מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם חיידקי Escherichia SeqA, רגולטור שלילי של ייזום שכפול.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA
במאמר זה
סיכום
תקציר
Escherichia coli SeqA הוא רגולטור שלילי של שכפול הדנ"א שמונע פגי אירועי reinitiation לפי אשכולות GATC hemimethylated sequestering בתוך המקור של שכפול 1. מעבר למקור, SeqA נמצא במזלגות שהכפולים, שבו הוא מארגן את ה-DNA המשוכפל חדשה למבנים מסודרים גבוהים יותר 2. מקורבי SeqA רק בחולשה עם רצפי GATC בודדים, אבל הוא יוצר קומפלקסי זיקה גבוהות עם דופלקסים DNA המכילים אתרי GATC מרובים. היחידה התפקודית ומבנית המינימאלית של SeqA היא דימר, ובכך הסבירה את הדרישה של לפחות שני רצפי GATC כדי ליצור מורכבות-זיקה גבוהה עם DNA hemimethylated 3. בנוסף, ארכיטקטורת SeqA, עם oligomerization ותחומי ה-DNA מחייבים מופרדים מקשר גמיש, מאפשרת מחייבת לחוזר GATC המופרד עד שלושה סיבובי סליל. לפיכך, הבנת הפונקציה של SeqA ברמה מולקולרית דורשת ana המבניתמוגה של SeqA חייבת רצפי GATC מרובים. בהתגבשות החלבון ה-DNA, ה-DNA יכול להיות אף להשפעה יוצאת דופן על אינטראקציות האריזה בהתאם לגדלים והארכיטקטורה היחסיים של החלבונים והדנ"א. אם החלבון הוא גדול יותר מאשר ה-DNA או טביעות רגליים של רוב ה-DNA, אריזת הגביש מתווכת בעיקר על ידי אינטראקציות בין חלבונים. לעומת זאת, כאשר החלבון הוא באותו גודל או קטן יותר מאשר DNA או שהוא מכסה חלק קטן של ה-DNA, ה-DNA DNA-DNA וחלבון האינטראקציות רק שולט אריזת גביש. לכן, התגבשות של קומפלקסים-DNA חלבון דורשת הקרנה השיטתית של 4 אורך הדנ"א ומסתיים DNA (בוטה או סככה) 5-7. בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד לעצב, לייעל, לטהר ולהתגבש דופלקסים DNA המכילים hemimethylated חוזר טנדם GATC במתחם בוריאצית dimeric של SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) כדי לקבל גבישים מתאימים לקביעת מבנה.
פרוטוקול
1. טיהור חלבון
המקשר הגמיש חיבור N-(oligomerization) ו-C-מסוף (DNA המחייב) תחומי SeqA עזרי ההכרה חוזרת GATC hemimethylated המופרד 02:59 מדליק את ה-DNA. במחקר זה, שהייתי גרסה של dimeric SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) עם מוטציה נקודתית בתחום N-המסוף המונעת המשך oligomerization ומקשר קצר שמגביל את ה-DNA המחייבת לטנדם GATC חוזר מופרדת באופן בלעדי על ידי סיבוב אחד בדנ"א (איור 1) 2,8.
- מרה (DE3) BL21 תאים עם SeqA הקידוד פלסמיד תחת השליטה של אמרגן T7,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אחד האתגרים הגדולים ביותר בקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן הוא קבלת גבישים באיכות עקיפה. במקרה של חלבון או חלבון-DNA תסביכים, אתגר זה מתעצם בשל משתנים הנוספים שצריך להיות מותאמים. הוא האמין נרחב כי אורכו של ה-DNA ואת הנוכחות של מסוכך דביק כדי לשפר את הקשר בין מולקולות דנ"א השכנות בעוד פסאודו דופלקס את הפרמטרים העיקריים כדי לייעל. עם זאת, יש לנו הראינו שהאופי והאורך מסוכך אלה יכולים להיות השפעה נוספת על אריזת הגביש של קומפלקס החלבון ה-DNA. למרות שפרוטוקול זה היה מתוכנן כדי ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
המחברים מבקשים להודות לצוות PXRR בNSLS (ברוקהייבן המעבדה הלאומית) לקבלת סיוע במהלך איסוף נתונים ומוניקה Pillon לעזרה בטיהור ה-DNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות (MOP 67189).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | קטלוג # | תגובות (אופציונלי) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) | הפישר סיינטיפיק | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | יו היסוד בע"מ | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| גליצרול | Caledon | 5350-1 | |
| סוכרוז | סיגמה אולדריץ | S5016-500G | |
| סולפט dodecyl נתרן (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| אוריאה | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% Bis 29:1 / acrylamide | יו היסוד בע"מ | A0007-500ml | לאחסן ב 4 ° C |
| חומצה בורה | EMD | BX0865-1 | |
| קסילן cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| בלו Bromophenol | Bioshop | BR0222 | |
| מערכת ג'ל כפולה מתכוונן אנכי | CBC המדעי חברה בע"מ | DASG-250 | |
| מסך התגבשות אינדקס | המפטון מחקר | HR2-144 | לאחסן ב 4 ° C |
| מסך התגבשות אני אשף | אמרלד BioSystems | EBS-Wiz-1 | לאחסן ב 4 ° C |
| מסך התגבשות השנייה אשף | אמרלד BioSystems | EBS-Wiz-2 | לאחסן ב 4 ° C |
| קלאסיקות מסך התגבשות | Qiagen | 130701 | לאחסן ב 4 ° C |
| מגשי Intelliplate | אמנות רובינס מכשירים | 102-0001-00 | |
פתרונות חיץ חלבון טיהור: 100 המ"מימ TRIS pH 8, 2 המ"מ EDTA, mM DTT 2 ו 5% גליצרול. חיץ חלבון אחסון: 20 המ"מ TRIS pH 8, 150 המ"מ NaCl, 5 המ"מ DTT, 0.5 המ"מ EDTA ו5% גליצרול. תמהיל ג'ל טעינה: הוסף 20 גרם של סוכרוז, 25 מ"ג של כחול bromophenol, 25 מ"ג של cyanol FF קסילן, 1 מ"ל של 10% w / v SDS ו10 מ"ל של TBE 10X עד 70 מ"ל של autoclaved DDH 2 O. מערבב עם חימום קל עד סוכרוז נמס ולהתאים הסופייםנפח עד 100 מ"ל עם autoclaved DDH 2 O. לאחסן ב 4 ° C. חיץ הטעינה 2X: הוסף 11 גרם של אוריאה עד 10 מ"ל של תערובת טעינת ג'ל. מערבב בצלחת חמה עד האוריאה מתמוססת. Aliquot ב 2 צינורות מ"ל ולאחסן ב 4 ° C. תמהיל העמוד 10X: מיקס 420.4 גרם של אוריאה, 100 מ"ל של TBE 10X (autoclaved), 250 מ"ל של 40% 29:1 Bis / acrylamide בDDH 2 O. מערבב עד שהיא נמסה לחלוטין ולהתאים את הנפח 1 ליטר. אחסן בבקבוקים כהים ב 4 ° C. TBE 10X: ממס 108 גרם לטריס, 55 גרם של חומצה בורה ו9.3 גרם של EDTA ב1 ליטר של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. חיץ elution: לדלל 8 מ"ל של 5 M NaCl, 2 מ"ל של M TRIS pH 1 7.5, 0.4 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA pH 8 ב 200 מ"ל של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. |
מקורות
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
