Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

Summary

כדי ללמוד את ההדדיות בין Xenorhabdus חיידקים Steinernema נמטודות, שיטות פותחו כדי לפקח על נוכחות ומיקום בתוך נמטודות חיידקים. הגישה הניסויית, אשר יכול להיות מיושמת על מערכות אחרות, כרוכה בחיידקי הנדסה לבטא חלבון פלואורסצנטי הירוק והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חיידקים בתוך נמטודות השקופה.

Abstract

Symbioses, החיים משותפים של שניים או יותר אורגניזמים, הם נפוצים לאורך כל ממלכות חיים. כשתיים מכל מקום אורגניזמים ביותר על פני אדמה, נמטודות וחיידקים יוצרים מגוון רחב של עמותות סימביוטיים שנע בין מועיל לפתוגניים ^1-3. עמותה אחת כזו היא מערכת היחסים הדדיים המועילה בין חיידקי Xenorhabdus ונמטודות Steinernema, שהתפתחה כמערכת מודל של סימביוזה ^4. נמטודות Steinernema היא entomopathogenic, באמצעות חיידקי סימביונט להרוג חרקים ^5. להעברה בין מארחי חרקים, החיידקים להתנחל המעי של שלב נעורי התולעת של נמטודות ^6-8. לאחרונה, כמה מינים נמטודות אחרים הוכחו לנצל חיידקים להדברת חרקים ^9-13, וחקירות שהחלו לבחון את יחסי הגומלין בין נמטודות והחיידקים במערכות אלה <sup> 9.

אנו מתארים שיטה להדמיה של סימביונט חיידקים בתוך או על מארח נמטודות, מנצלים את השקיפות האופטית של נמטודות כאשר נצפו על ידי מיקרוסקופ. את החיידקים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי, המאפשר ההדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלסמידים רבים זמינים שנושאים גני מקודדי חלבונים כי לזרוח באורכי גל שונים (כלומר ירוק או אדום), וצמיד של פלסמידים מזן חיידקי Escherichia תורם לסימביונט חיידקי נמען היא מוצלחת למגוון רחב של חיידקים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לחקור את הקשר בין Steinernema carpocapsae וXenorhabdus nematophila ^14. שיטות דומות שמשו כדי לחקור עמותות אחרות נמטודות-חיידק ^{9, 15-18} והגישה לכן היא באופן כללי.

נפגשהוד מאפשר אפיון של נוכחות ולוקליזציה חיידקים בתוך נמטודות בשלבים שונים של פיתוח, לספק תובנה על טבעה של העמותה והתהליך של קולוניזציה ^{14, 16, 19.} ניתוח מיקרוסקופי מגלה שכיחות הקולוניזציה בתוך אוכלוסייה ולוקליזציה של חיידקים לארח רקמות ^{14, 16, 19-21.} זה יתרון על פני שיטות אחרות לניטור חיידקים בתוך אוכלוסיות נמטודות, כגון sonication ²² או טחינת ^23, אשר יכול לספק רמות ממוצעות של התישבות, אבל לא יכול, למשל, להפלות אוכלוסיות עם שכיחות גבוהה של עומסי סימביונט נמוכים מאוכלוסיות עם תדירות נמוכה של עומסי סימביונט גבוהים. להפלות את התדירות והעומס של חיידקים מיישבים יכול להיות חשוב במיוחד כאשר הקרנה או אפיון מוטציות חיידקים לפנוטיפים קולוניזציה ^{21, 24.} אכן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נעשה שימוש בהקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות חיידקים לפגמים ^{ב17 קולוניזציה, 18,} ​​והוא פחות מייגע מאשר שיטות אחרות, כולל sonication ^{22, 25-27} ונתיחת פרט נמטודות ^{28, 29.}

Protocol

1. בנייה של זן חיידקי פלורסנט באמצעות צימוד

1. לגדול מתח הנמען (סימביונט להיבחן) ומתח תורם בן לילה. המתח התורם, בדרך כלל חיידקי Escherichia, צריך להיות מסוגל לתרום דנ"א באמצעות נטייה ויש לשנותה עם פלסמיד (טבלה 2) שנושא את גן מקודד חלבון פלואורסצנטי. בהתאם לפלסמיד, מתח עוזר נטייה עשוי להיות גם נדרש. אם כך, זן זה צריך להיות גם גדל בן לילה. המתח התורם ועוזר המתח צריך להיות מבוגר עם אנטיביוטיקה כדי לבחור לאחזקה של פלסמיד.
2. תת התורם, עוזר, וזני נמען לתקשורת צמיחה העשירה ברכיבים המזינה חסרת אנטיביוטיקה ביחס 1:100 של התרבות עד בינוני.
3. לגדל את התרבויות בטמפרטורה המתאימה לכל מאמץ עד שהם מגיעים לשלב צמיחת אמצע יומן (OD ₆₀₀ ~ 0.6). לXenorhabdus וא חיידק זה שלב של לגדולה הגיעה לכ 3-4 שעות לאחר subculturing. זה עשוי להשתנות בהתאם לעומס, או במקרים מסוימים פלסמיד, בשימוש.
4. מערבב את הזנים בצינור microcentrifuge וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב17900 XG (13,000 סל"ד ברוב microfuges). חלקם של תורם ומקבל שמניב תוצאות הטובות ביותר ישתנה לשילובים שונים, וייתכן ויש לקבוע באופן אמפירי. לXenorhabdus נמען וא תורם coli, אנו משתמשים 03:01 או ביחס 1:1. אם מתח עוזר נחוץ (E. coli, למשל), יש להוסיף באותו היחס כמו לתורם.
5. למזוג supernatant.
6. Re-להשעות את התא גלול ב 30 μl של מדיה חדשה.
7. ספוט ההשעיה על גבי צלחת מדיה עשירה מזין ללא אנטיביוטיקה, ולאפשר המקום לייבוש.
8. דגירה את הצלחת, הפוכה, בלילה בטמפרטורה אופטימלית לחיידק הנמען ומותר לתורם (ועוזר, אם רלוונטי). הצלחת צריכהלהיות מודגרות לפחות 18 שעות.
9. לגרד את הכתם והקו למושבות בודדות על צלחת אנטיביוטיקה סלקטיבית. האנטיביוטיקה צריכה לבחור נגד התורם ומקבל המכיל את הפלסמיד. אחד או שניים פסי בידוד נוספים עשויים להיות נחוצים כדי לבודד תרבות טהורה.
10. ודא מושבות התוצאה הן סימביונט הנמען, ולא בלחץ התורם, על ידי הקרנה לנוכחות של פנוטיפים ספציפיים נמען, כגון מורפולוגיה מושבה, או גילוי תגובת שרשרת פולימרז של גני נמען ספציפיים. מסך המושבות לנוכחותו של פלסמיד ידי תגובת שרשרת פולימרז של רצף הפלסמיד ידוע וקרינה. המושבות צריכות לזרוח תחת אורך הגל המתאים לחלבון פלואורסצנטי הנכון.

2. ייצור של ביצי נמטודות Axenic

1. לגדול 5 מ"ל של סימביונט החיידקים הטבעיים בן לילה. כדי להתחיל תרבות, חיידקים עשויים להיות מחוסנים לLysogeny מרק (LB) או מ"ק אחרתקשורת lture ישירות ממניות או ממקפיא צלחת פס.
2. מורח 600 μl של תרבות החיידקים על גבי צלחות אגרו 10 ליפידים מ"מ (לוס אנג'לס) ^29. שמונה עד עשר צלחות תנבנה מספיק נמטודות עבור רוב המינים.
3. דגירה בחושך ללא לחות ב 25 מעלות צלזיוס במשך ימים.
4. הוסף 5000 נמטודות זיהומיות נוער, או בשלבים אחרים, בהתאם לנמטודות בשימוש, ב500 μl של תקשורת למדשאות חיידקיים. דגירת הצלחות ב 25 ° C במשך 3 ימים.
5. בדקו את הצלחת שלו לנוכחות של נמטודות וביצים הבוגרות. הנח 20 μl מים לשקופית מיקרוסקופ. בעזרת מקל סטרילי לגרד מעלה כמות קטנה של נמטודות מהדשא בקטריאלי. הנח את המקל לתוך המים ולאפשר לנמטודות לשחות כבויה. יראה השקופית בהגדלה נמוכה. לקבלת מידע נוסף על מראה לראות את הדיון והאיור 2.
6. אם ביצים ונקבות נראות לעין, תמשיך, אחרת דגירת הצלחות ב 25 & dלדוגמה: C ולבדוק להתפתחות תקינה בכל 6-12 שעות. כאשר נקבות מכילות ביצים, הנח כמה מ"ל של מים על פני השטח של הצלחות. ערבלו בעדינות את הצלחות ולשפוך את המים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. נמטודות צריכות לבוא מן הצלחות וכבר לא תהיינה גלוי על פני שטח הצלחת. כמה שטיפות עשויות להיות נחוצות.
7. לאפשר לנמטודות להתיישב לתחתית של התחתית.
8. שטוף נמטודות. פיפטה את עודפי מים מהחלק העליון של הצינור. למלא במים נקיים ולאפשר נמטודות המבוגרת להתיישב. פיפטה את המים העודפים.
9. מלא את צינורות חרוטים עם פתרון ביצה. ברגע שפתרון הביצית הוסיף העיתוי של כל שלבי פתרון עם ביצה חייב להמשיך בדיוק כפי שתאר לתשואה מרבית ביצה. דגירת הצינורות תוך עדינות רועדת לבדיוק 10 דקות. רוב נמטודות צריכה להיות מומסת עד סוף הדגירה.
10. מייד סרכזת צינורות החרוטים ב1250 XG לבדיוק 10 דקות (כולל הבאת צנטריפוגה עד מהירותאבל לא עד 0 x גרם. השתמש בבלמים).
11. מייד למזוג supernatant.
12. מייד מחדש להשעות את הגלולה עם ביצת פתרון על ידי pipetting.
13. מייד למלא צינור חרוטים עם פתרון ביצה ומערבבת היטב על ידי 3-5 פעמי היפוך. אחר כך להסתובב באופן מיידי כמו ב2.10.
14. מייד למזוג supernatant.
15. Re-להשעות הגלולה בLB ידי pipetting, העברה לצינור חרוטים 15 מ"ל לpelleting המשופר במהלך שלבי שטיפה. LB הוא סטנדרטי לSteinernema spp. חוצצים אחרים (למשל בינוני מלחים מינימאליים) ניתן להשתמש בהתאם לנמטודות והחיידק, תוך התחשבות החיץ אסור לפגוע באף נמטודות או החיידק.
16. מלא את הצינור עם LB וספין כמו ב2.10.
17. למזוג supernatant, מחדש להשעות בLB.
18. יש לשטוף את נמטודות כוללות של 3 פעמים על ידי חזרה על 2.14 ו -2.15.
19. לדלל את הביצים נמטודות מחדש מושעות לנפח מתאים. לא צריך להיות לפחות 10 ביצים לכל microliter. לדוגמהgs ניתן לאחסן בצלחת פטרי 6-סנטימטר בLB 5 מ"ל במשך לפחות ארבעה ימים על ידי הוספת אנטיביוטיקה שמעכבת את הצמיחה של חיידקים מיישבים ועוטף את הצלחת בparafilm. את הביצים צריכות להיות כובסו פעם בLB 15 מ"ל (כמו ב2.13 ו2.14) לפני inoculating על מדשאות חיידקיים. שים לב שהביצים תבקענה בזמן זה ולא יכולה להיות מסונכרן התפתחותית בעת שימוש במבחני קולוניזציה.

3. Assay שיתוף עם חיידקי טיפוח פלורסנט

1. לגדול חיידקי ניאון לילה, בחירה לפלסמיד במידת צורך.
2. מורח 600 μl של תרבות החיידקים על 10 צלחות אגרו ליפידים מ"מ עם מקל סטרילי. לדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
3. מקום 500-5,000 ביצים נמטודות axenic בסך של 100-400 μl (אופטימלי 2000 נמטודות ב200 μl) על כל צלחת אגרה שומנים בדם.
4. דגירה בחושך ללא לחות ב 25 ° C עד IJs, או בשלבים אחרים של עניין, טופס. IJs יהיה גלוי כפוטבעת לבנה zzy על קצה הצלחת. להסתכל על שלבי חיים אחרים, ראה פרוטוקול 4.
5. מקם את הצלחות במלכודת שונה לבנה ^30. הסר את המכסה של הצלחת אגרה שומנים ולמקם את התחתית לתחתית של 100 מ"מ ריק x 20 מ"מ צלחת פטרי. מלא את צלחת פטרי הגדולה עם מים, או בולם מתאים לנמטודות שנייה, כדי להקיף את הצלחת הקטנה. מפלס המים צריך להיות כמחצית מגובו של הצלחת הקטנה.
6. דגירת מלכודת המים עד IJs צאצאים צמח למאגר.
7. נמטודות נוער זיהומיים ניתן לאחסן מים בבקבוק תרבית רקמה.

4. אוסף משלבי חיים מוקדמים להקרנה

1. השתמש בשלבים 3.1 עד 3.4 להגדיר את assay.
2. דגירת הצלחות עד לשלבי החיים הרצויים נמצאים. בדיקה חזותית יומית עשויה להיות נחוצה כדי לקבוע עיתוי. כדי לבדוק את הצלחות, השתמש בהליך המתואר בפרוטוקול 2.5. בשביל ש ' carpocapsae X. nematophila על צלחות LA, נשים הרות תהיינה נוכחות ב4-5 ימים, בני הנוער יהיו נוכחים ב7 ימים, ובני נוער זיהומיות יתחילו להיות מיוצרים על ידי 15-17 ימים.
3. כאשר שלבי החיים הרצויים נמצאים, לאסוף המדגם שלך. מלא גם מצלחת גם 96 עם 200 μl של PBS או הבולם מתאים אחרים. עדינות לגרד מעליו קצת דשא החיידקים המכיל נמטודות. כמות גודלה כגודל אפון (~ 50 מ"ג) תספק לפחות כמה מאה נמטודות פעם צאצאי F1 מיוצרים, אבל יותר עשויה להיות נחוץ לנקודתי זמן קודמות. הנח את המקל למאגר גם מכיל.
4. דגירה למשך 30 שניות עד דקה. מוציא את המקל ומגרד את השאריות שנותרו. השתמש במקל כדי להסיר כל אגר מהבאר. נמטודות צריכות להיות גלויות בתוך המאגר. העבר את התערובת לחיץ צינור microfuge נקי.
5. פנק את נמטודות עם levamisole או סוכן משתק אחר. לפזר כמה גרגרים של levamisole ל30 & mu; ליטר המים. הוסף 1-2 μl תמהיל זה עבור כל 50 μl של מדגם. לאחר טיפול levamisole את נמטודות תהיינה בלתי כדאיות מבחינה כלכלית.
6. אם תהיינה לצפות דגימות במועד מאוחר יותר, לתקן כמתואר בשלב זה. אם לא, דלג לשלב 4.6. הוסף 200 μl של פתרון מקבע המכיל 1X חיץ ו4% paraformaldehyde. מערבב בעדינות, pipetting עלול לגרום שלבי חיים עדינים לlyse. מכסים בנייר כסף, והדגירה בטמפרטורת חדר שבייקר על נמוך במשך לפחות 18 שעות.
7. מניח את הצינורות במעמד צינור, ולאפשר לנמטודות להתיישב לתחתית של התחתית.
8. שטוף נמטודות להסיר רקע. פיפטה את הנוזל עודף ולהוסיף 200-500 μl של חיץ ועדינות לערבב. חזור. זה עשוי לחזור כמה פעמים כדי להסיר יותר רקע אם רוצה.
9. לאפשר לנמטודות להתיישב לתחתית של תחתית ומחדש להשעות בעצמה הרצויה.
10. אם נמטודות אינה קבועה, מסך באופן מיידי. נמטודות קבועות עשויות להיות מאוחסנות במקרר עדלשבועות. אחסן בחושך.

5. נמטודות הקרנה לאיגוד על ידי חיידקים מיקרוסקופים

1. בחר כמה נמטודות כדי להציג תחת המיקרוסקופ על ידי הסרת דגימה קטנה של התערובת שלך.
2. כדי להבטיח שנמטודות עדיין לתמונה, לטפל עם סוכן משותק כמתואר בפרוטוקול 4.5. אם אתה לא לוקח את תמונה או את נמטודות כבר קבועות, בשלב זה ניתן לדלג עליו.
3. הוסף 20-30 μl של נמטודות במים לשקופית מיקרוסקופ ואת מקום coverslip על גבי.
4. צפה בנמטודות השלמה באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להבטיח נמטודות היא בשדה הראייה.
5. צפה בנמטודות באמצעות הגדרת הניאון במיקרוסקופ שמתאים לקרינה שהביעה על ידי החיידקים.
6. כדי לזהות לוקליזציה חיידקים, לקחת תמונות של נמטודות תחת הגדרת ניאון והגדרת מיקרוסקופ אור, ולאחר מכן להרכיב את התמונות. את התמונות צריכות להיות מאותו להרגיש אתד של נוף. ייתכן שיהיה צורך לנסות כמה הגדלה ונופים של נמטודות למצוא את החיידקים.
7. ההפצה של הקולוניזציה נמטודות ניתן לכמת על ידי ספירת אוכלוסייה של נמטודות, בקיע לנוכחות או עדר של חיידקים, וחישוב האחוזים קולוניאליים. אנו ממליצים לספור לפחות עד 30 נמטודות בתוך האוכלוסייה נספרת בכל קטגוריה (עם או בלי קולוניזציה) כדי לקבל ערך אמין.
8. כאשר רק מספר נמטודות באוכלוסייה הם התנחלו, זה עשוי להיות נחוץ כדי לספור כמה אלף נמטודות לפני 30 הם נצפו. לספירת תפוקה גבוהה להשתמש בשלבים הבאים.
9. במקום לספור נמטודות בנפרד, aliquot האוכלוסייה לתוך צלחת רבה גם (למשל צלחת 24 היטב). לאחר נמטודות התיישבה לתחתית הצלחת, כל אחד גם ניתן לסרוק במיקרוסקופ ומספר נמטודות יישבו יכול להיות בקיע.
10. המספר הכולל של נמטודותאוכלוסיית na ניתן לזהות על ידי דילולים סידוריים של נמטודות בבאר. לדוגמה, 1 מ"ל של נמטודות ניתן להוסיף גם, מעורב היטב על ידי ערבוב עם טיפ pipet, ו 3 μl ניתן להסיר וספרתי לכימות של כלל האוכלוסייה בבאר.
11. אחוז נמטודות יישבה ניתן להשיג על ידי חלוקת המספר מאוכלס על ידי המספר הכולל של נמטודות בבאר.

6. נציג תוצאות

תמונות מיקרוסקופ דוגמה של נמטודות Steinernema קשורים חיידקי Xenorhabdus מוצגות באיור 3. כדי ליצור תמונה המורכבת לראות באיור 3 א, תמונה לעומת שלב כוסתה בתמונת ניאון. החץ באיור 3A מציין את חיידקי נוכח בתוך נמטודות נוער התולעת (הבר = 100 מיקרומטר). 3B האיור נבנה בצורה דומה ומתאר נמטודות wi נוערחיידקי ה ירוקים ניאון חלבון שכותרת (מוטות ירוקות) מקומיים לאורך לום המעיים נמטודות (הבר = 20 מיקרומטר). אוכלוסייה של נמטודות משתי אמצעי תקשורת נספרה ובקיע להתישבות על ידי חיידקי סימביונט (טבלה 1). לקבלת נתונים סטטיסטיים חזקים, עדיף לספור לפחות 100 נמטודות לדגימה עם לפחות 30 נופלים בכל קטגוריה. כפי שניתן לראות בטבלת 1, נמטודות אלה התנחלו ברמה של כ -14.6%, כאשר גדלו על אגר ושומנים 68.6% כאשר גדלו על אגר כליות כבד. נמטודות אחרות ומיני חיידקים הוכחו יש רמות שונות של התישבות. לדוגמא X. nematophila מאכלס 99% מס קטיני carpocapsae זיהומיות (מרטנס 2003), ופ luminescens מאכלס 26% מח קטיני זיהומיות bacteriophora (Ciche 2003).

איור 1. מתווה סכמטי של השיטה. א החיידק שהונדס חלבון פלואורסצנטי. ביצי נמטודות B. מבודדים מנמטודות בוגרות כדי לייצר נמטודות סטריליים. ג נמטודות סטריליים הם שיתוף טפח-עם חיידקי הניאון. ד שלבי חי כתוצאה מכך הם מוצגים תחת מיקרוסקופ להעריך נוכחות חיידקים בתוך נמטודות.

איור 2. תיאור של נשים בוגרות המכילות ביצים. א סכמטי מציג את המראה הכללי של נקבות Steinernema. תמונת דסק ס: הבלעה feltiae כרס נשי. החץ השחור מצביע על הפות. חצים לבנים להראות ביצים נראות לעין. תמונה היא בהגדלת 20X, וסרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. תמונה ב דסק מפותח אבל עדיין לא בקע סfeltiae ביצת נמטודות. תמונה היא גדלת 40X, וסרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. תמונת דסק"ש ג ביצים מבודדת מס feltiae נמטודות בהגדלת 10X. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר.

איור 3. תמונות מיקרוסקופ דוגמה של עמותת נמטודות בקטריאלי. א 'ס' נמטודות puntauvense היו קשורות עם סימביונט חיידקיהם, X. bovienii, GFP להביע. התמונה היא תמונה מורכבת מיוצרת על ידי כיסה תמונה לעומת שלב עם תמונת ניאון מאותו שדה הראייה. החץ מציין סימביונט חיידקי הניאון בתוך פונדקאי נמטודות. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. ב תמונה זו מראה ס נמטודות נוער carpocapsae עם X. GFP מבטא nematophila מקומי בתוך מעי נמטודות.תמונה זו נבנתה דרך כיסה תמונת ניאון מעל תמונה לעומת פער התערבות. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר.

להתאמץ	מספר נמטודות עם acteria	סכה נמטודות נספרת	אחוז מנמטודות olonized
אגר שומני puntauvense ס	30	205	14.60%
אגר כליות כבדות puntauvense ס	72	105	68.60%

טבלת 1. ניקוד דוגמה לאוכלוסיית נמטודות לנוכחות חיידקים. בניסוי זה, axenic ס נמטודות puntauvense גדלו עם סימביונט GFP מבטא בתקשורת צמיחה השונה (אגר אגרו שומנים וכליות הכבד ³²⁾ לבדיקת ליקויי קולוניזציה. כולל של hundre אחד לפחותנמטודות ד לדגימה נספרו והבקיע לנוכחות של חיידקים. לכוח סטטיסטי, שלוש ניסיוניים משכפל יש למנות עם לפחות 30 נמטודות נופלת בכל קטגוריה.

טבלה 2. פלסמידים המכילים חלבון פלורסנט. רשימה של פלסמידים פוטנציאליים להחדרה של חלבון פלואורסצנטי לתוך סימביונט החיידקים ניתנים מופיעה בשמו של פלסמיד. מידע אחר הכלולים הוא החלבון מקודדת קלטת הניאון, אנטיביוטיקה המשמשת לתחזוקת פלסמיד, הוראות אחרות לשימוש, המקור לפלסמיד. הריכוז שצוין בסוגריים הוא הריכוז של האנטיביוטיקה המשמשת לX. nematophila. כל פלסמידים אלו שמש בהצלחה בשנייה Xenorhabdus או Photorhabdus. מידע נוסף ניתן לקבל את הציטוטים האמורים. בהתאםעל החיידק הנבדק, כמה פלסמידים לא יכולים לעבוד על בסיס החלבון פלואורסצנטי, בחירת אנטיביוטיקה, אתר הכנסה, או מוצא של שכפול. את פלסמידים המפורטים לעיל מכילים תכונות שונות שעשויות לאפשר שימוש בחיידק של עניין. לדוגמה, מוסיף מיני Tn7-KSGFP לattTn7 האתר של כרומוזום, בעוד pECM20 מחדיר לתוך X. כרומוזום nematophila ידי הומולוגי רקומבינציה. לחלופין, פלסמידים pPROBE נשמרים extrachromosomally, וכל pPROBE פלסמיד יש את אותו עמוד שדר וfluorophore אבל יש סמנים שונים לבחירה או למוצא של שכפול כדי לאפשר את השימוש בם במגוון הטקסונומי או רקע מוטציה.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לזיהוי האופטי של חיידקים בתוך מארח נמטודות (איור 1). שיטה זו מנצלת את השקיפות האופטית של נמטודות ויכולת fluorescently חיידקי תווית, מה שמאפשר בניתוח vivo של חיידקים בתוך פונדקאי נמטודות (איור 3). באופן ספציפי, גישה זו מזהה לוקליזציה חיידקים בתוך המארח שלו. על ידי ספירת אוכלוסיית נמטודות וניקוד לנוכחות חיידקים, התדירות של התישבות חיידקים על פני אוכלוסיית נמטודות ניתן לקבוע (טבלה 1). שיטה זו ה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
אגר שומנים (עקר)			8 גרם מרק מזין, 15 אגר גרם, שמרי תמצית 5 גרם, מים 890 מ"ל, 10 מ"ל 0.2 גר '/ המ"ל MgCl 2. 6H 2 0, * 96 מ"ל סירופ תירס פתרון, 4 מיליליטר שמן תירס * מערבב תקשורת בעת שמזגה צלחות * להוסיף מרכיב עקר אחרי מעוקר
פתרון סירופ תירס (עקר)			סירופ תירס 7 מ"ל, 89 מיליליטר מים תמהיל וחיטוי
פתרון ביצה			16.6 מ"ל 12% hypochlorite נתרן, 5 המ"ל KOH 5M, מי 80 מ"ל
Lysogeny מרק (עקר)			5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם tryptone, 5 גרם מלח, 1 ליטר מים תמהיל וחיטוי
Microfuge	דיג	13-100-675	כל microfuge שמחזיק צינורות microfuge יעבוד
סרכזת	Beckman	366802	צנטריפוגה בראש הטבלה הגדולה שמחזיקה 15 מ"ל ו 50 צינורות חרוטי מ"ל
סטרילי 60 מ"מ X 15 מ"מ צלחת פטרי	דיג	0875713
50 צינורות צנטריפוגות מ"ל	דיג	05-539-6
15 צינורות צנטריפוגות מ"ל	דיג	05-531-6
100 מ"מ X 20 מ"מ צלחת פטרי סטרילית	דיג	0875711Z	עמוק יותר מצלחות פטרי הרגילות
צלחת 24 היטב	גריינר ביו אחד	662000-06
מיקרוסקופ			מיקרוסקופ צריך יכולות ניאון תואמות fluorophore
Paraformaldehyde	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15710
PBS (עקר)			8 גרם NaCl 0.2 גרם KCL 1.44 גרם Na 2 HPO 4 0.24 גרם KH 2 PO 4 1 ליטר מים התאם לpH של 7.4 ליטר ומים עד 1 וחיטוי
צינורות Microfuge	דיג	05-408-138	2 מ"ל או 1.5 מ"ל צינורות
מטרף			כל מביא שגורם לנוזל בעדינות להעביר יעבוד
חומצת Diaminopimelic	סיגמא	D-1377	במידת צורך, להוסיף מדיה לריכוז או 1 mM