בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

סיכום

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

תקציר

במהלך השנים האחרונות, התרומה של תאי שומן מסוג II (אפיתל AECII) להיבטים שונים של רגולציה בחיסון הריאות הוכרה יותר ויותר. AECII הוכח להשתתף בייצור ציטוקינים בנשימה מודלקת ואפילו לפעול כהצגת אנטיגן תאים הוא בזיהום והתפתחות מחל תאי T תיווך ^1-8. לכן, הם מעניינים במיוחד גם בהקשרים קליניים כגון-תגובתיות היפר נשימה לזרה ו- אנטיגנים עצמיים, כמו גם זיהומים שבמישרין או בעקיפין למקד AECII. עם זאת, ההבנה של הפונקציות החיסוניות המפורטות מוגשות על ידי תאי האפיתל סוג II במכתשיים הריאה הבריאה כמו גם בדלקת שלנו נשארת חלק. מחקרים רבים בנוגע לתפקוד AECII מתבצעים באמצעות עכבר או שורות תאי אפיתל מכתשיים אדם ^9-12. עבודה עם שורות תאים בהחלט מציעה מגוון של הטבות, כגון זמינות של מספר גדול of תאים לניתוחים נרחבים. עם זאת, אנו מאמינים כי השימוש בAECII העכברי העיקרי מאפשר הבנה טובה יותר של התפקיד מסוג זה תא בתהליכים מורכבים כמו זיהום או דלקת אוטואימונית. AECII העכברי הראשי יכולה להיות מבודד באופן ישיר מבעלי חיים סובלים מתנאי נשימה כאלה, כלומר הם היו כפופים לכל הגורמים החיצוניים הנוספים ששחקו תפקיד בהגדרה נתחה. כדוגמה, AECII קיימא יכול להיות מבודד מעכברים נגועים intranasally עם שפעת וירוס, אשר בעיקר מטרות אלו תאים לשכפול ^13. חשוב מכך, באמצעות זיהום vivo לשעבר של AECII המבודד מעכברים בריאים, מחקרים של תגובות התאיות רכובות על זיהום יכולים להיות רחוקים יותר מורחבים.

הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי העיקרי מתבסס על עיכול האנזימטית של ריאת העכבר ואחריו התיוג של השעית תא וכתוצאה עם נוגדנים ספציפיים לCD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 וCD16/CD32. AECII הגרעיני לאחר מכן זוהה כאוכלוסיית תא הפיזור ללא תווית וצידה הגבוה (SSC ^גבוה) ומופרד על ידי תא הפעיל פלואורסצנטי מיון ^3.

בהשוואה לשיטות חלופיות של בידוד תאי האפיתל עיקריים מריאות עכבר, הפרוטוקול שלנו לבידוד cytometric זרימת AECII ידי בחירה שלילית פירוש לא נגע, בת קיימא והטהור ביותר AECII בזמן קצר יחסית. בנוסף, ובניגוד לשיטות מקובלות של בידוד על ידי צילום פנורמי ודלדול של לימפוציטים באמצעות קשירה של נוגדן בשילוב חרוזים מגנטיים ^{14, 15,} מיון תא cytometric זרימה מאפשר אפליה באמצעות גודל תא וגרעיניות. בהתחשב בכך שהמכשור למיון תא זרימת cytometric זמין, ההליך המתואר ניתן ליישם בעלויות נמוכות יחסית. הבא לנוגדנים ואנזימים להתפוררות ריאות, ללא ריאגנטים נוספים כגון מגנטי רגיליםחרוזים נדרשים. התאים המבודדים מתאימים למגוון רחב של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים, הכוללים בתרבות מבחנה ומבחני גירוי תאי T, כמו גם transcriptome, Proteome או ניתוחי secretome ^{3, 4.}

פרוטוקול

פרטים בדבר חומרים כימיים וחומרים נדרשים מפורטים בטבלה בסוף הפרוטוקול להלן. לפני תחילת עבודה, להכין 15 צינורות מ"ל (אחת לעכבר) המכילים 4 מ"ל של dispase ומראש חמים להם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בבלוק חימום, זמן קצר לחמם aliquots הקטן של 1-% להמס agarose הנמוך (במים) עד 95 מעלות צלזיוס עד שנוזלים ובהמשך קריר עד 45 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

1. הכנת הריאות המאוסות

1. להקריב את העכבר על ידי ₂ חנק CO. הערה: אין לבצע עקירת צוואר רחם כמו זה יהיה לפגוע בקנה הנשימה, כך שביצוע פעולות של הפרוטוקול, כגון התקנה של הריאות עם נוזל, לא ניתן לבצע בהצלחה. ודא אובדן הרפלקסים nociceptive.
2. רסס את העכבר עם אתנול ולעשות עוד חתך לאורך קו אמצע הגחון של הגוף. משוך את הפרווה ועור גחון ובהמשך גם לחתוך בזהירות ולהסיר את הצפק.
3. לגרום לדימום מחודשעכבר על ידי חיתוך ורידי צוואר שמאל וימין (Vena jugularis), כמו גם את עורק הכליה (renalis Arteria). הסר זרימת דם ברקמה.
4. זהירות לנקב ולאחר מכן להסיר את הסרעפת לחשוף את הלב וריאות על ידי גזירה מהצלעות. קח טיפול מיוחד לא לפגוע ריאות.
5. עם צינורית 26G ומזרק מ"ל 10 מלא בפוספט הקר נאגר מלוחים (PBS), לנקב החדר הימני של הלב והריאות תנקבנה עם PBS עד חופשי של דם.
6. לחתוך ולהסיר את בלוטות רוק כדי לחשוף את קנה הנשימה. גם לחתוך בזהירות את השריר המקיף את קנה הנשימה.
7. הכנס צינורית שכינת 22g לקנה הנשימה, הוצא את המחט ולדחוף קטטר הפלסטיק לכיוון הריאות. תקן את הקטטר על ידי קשירת חתיכה קטנה של חוט סביב קנה נשימה וקטטר.

2. עיכול אנזימתי של רקמת הריאה

אם ירצה, מדגם שטיפת רונכואלוואולרית יכול להיותשהוכן על ידי שטיפת הריאות בעזרת הצנתר בקנה הנשימה עם PBS או בינוני לפני השלב הבא.

1. שימוש במזרק מ"ל 2, להחדיר בזהירות נפח מקסימאלי של 2 מ"ל של dispase (מ4 aliquot המ"ל) לתוך הריאות דרך הצנתר, כך שכל האונות הם התרחבו באופן מלא. תחליף את המזרק עם מזרק 1 מ"ל מכיל 0.5 מ"ל של הנוזלים agarose וגם להחדיר לתוך הריאות.
2. השאר את המזרק על קטטר כדי למנוע חזרה זרימה של agarose ולכסות את הריאות עם נייר וקרח רקמות מעבדה באופן מיידי. בואו ג'ל agarose במשך כמה דקות.
3. הסר את ממחטת נייר, קרח, המזרק וקטטר, לחתוך את קנה הנשימה ובלו הריאות, לב והתימוס מהחזה. לאחר מכן לשטוף את הריאה בצלחת עם PBS ולהסיר את הלב, התימוס וקנה הנשימה שנותר.
4. שימו את הריאות ל2 מ"ל הנותר של dispase ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות.

3. הכנה של הריאותהשעית תא

1. הסר את הריאות מdispase ולהעביר אותו לצלחת המכילה 7 מ"ל של anti-CD16/32 נוגדן (מיקרוגרם 1 / ריכוז סופי מ"ל) במדיום DMEM ו100 DNase μl.
2. באמצעות מלקחיים, מתפורר לחלוטין רקמת הריאה על ידי משייכתו לגזרים ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ואילו בעדינות מתנדנד על כסא נדנדה להגדיר עד 200 סל"ד. אם תרצה, השעית התא לאחר מכן ניתן לאחסן ב 4 ° C עד לשלב הבא.
3. סנן את השעית התא דרך משתלב ניילון ראשון עם 100 מיקרומטר ולאחר מכן עם 70 מיקרומטר, 48 מיקרומטר ו 30 מיקרומטר נקבוביים. הקפד לשטוף את כל רשת, כמו גם את הצינורות ומנות ביסודיות עם DMEM כדי למזער פגיעה בתאים ולמקסם את התשואה. אם אתה איגום דגימות, זו יכולה להיות מושגת על ידי עובר כאן בהמשך תרחיפי תאים מעכברים של קבוצה אחת דרך אותו המסנן. לחדש את המסנן במקרה של סתימה.
4. תלוי בכמות, להעביר לתסנין 50 צינורות מ"ל אחד או יותר וסרכזת במשך 15 דקות ב160 XG ו4 ° C. הסר את supernatant.
5. Resuspend תא הגלול במאגר 2 מ"ל כדורי אדום תמוגה (0.15 ₄ Cl M NH, 0.01 מ ₃ KHCO, 0.1 המ"מ EDTA, 7.2 pH) ולסיים במהירות תמוגה ידי תוספת של 13 מ"ל של מדיום DMEM. להעביר את הפתרון לצינור וצנטריפוגה מ"ל 15 ל 12 דקות ב 160 XG ו4 ° C.

4. כתמי נוגדן למיון תא Cytometric תזרים

1. Resuspend התאים בקוקטייל 3 מיליליטר נוגדן ראשוני, שהוכן במדיום DMEM בדילולים מתאימים לcytometry זרימה. (נוגדנים היו בעבר עבור טיטרציה דילולי עבודה אופטימליים ע"י השאירו 1 10 ⁶ splenocytes x בנפח של 100 μl. שימוש 3 מ"ל של קוקטייל הנוגדן הראשוני המכיל את הריכוזים האופטימליים עבור כל אחד מהנוגדנים המשמשים לתאים מנקווה עד חמישה עכברים. אם יותר עכברים הם אספו לדגימה אחת, להתאים את עוצמת קול).
2. לכתמים, דגירת התאים למשך 10 דקות בחושךב 4 ° C.
3. לשטוף את התאים על ידי מילוי צינור המ"ל 15 עם בינוני וצנטריפוגה DMEM ל12 דקות ב160 XG ו4 ° C.
4. במקרה הנוגדנים כשהתיר או biotinylated שמשו ב4.1: הסירו את supernatant ו resuspend התאים ב2 - קוקטייל נוגדנים 3 מ"ל משני. כתם עבור 10 דקות ב 4 ° C בחושך.
5. לשטוף את התאים באמצעות מילוי הצינורית עם DMEM וצנטריפוגה במשך 12 דקות ב160 XG ו4 ° C.
6. Resuspend התאים ב1 מ"ל של DMEM ומראש דרך המסנן של 50 מיקרומטר סינון לתוך צינור למיון תא. אופציונלי: ספירת התאים כדי להשיג את מספר התא הכולל בהשעית תא הריאות.

5. מיון תא

1. מערבב את התאים על ידי vortexing לפני המיון. השתמש נחיר מיקרומטר 100 למיון תא של AECII. לחץ נוזל סיכוך ופליטת ליזר ואורכי גל גילוי תלוי במכשיר המשמש למיון תא cytometric זרימה, כמו גם את השימוש בfluorochromes antibody הליך הכתמה.
2. שער על התאים ^{הגבוהים} SSC שהם שליליים לfluorochromes משמש לצביעה וסוג לתוך צינור המכיל DMEM. השתמש קדימה גובה פיזור (FSC-H) לעומת אזור (FSC-) וגובה צידת פיזור (SSC-H) לעומת אזור (SSC-) חלונות כדי לכלול את כל כפילויות או אגרגטים סלולריים (ראה פירוט באסטרטגית gating איור 1).
3. על מנת לאסוף צנטריפוגה התאים הממוינים ל20 דקות על 280 XG ו4 ° C.
4. Resuspend התאים בתרבית בינונית או חיץ כנדרש לניתוח שלאחר מכן.

תוצאות

בעת מיון השעיות תאי ריאה שבודדו מעכברים בריאים, שער AECII יהיה בדרך כלל מהווה כ 42 ± 10% מכל האירועים. אחוז זה יכול להיות ניכר נמוך יותר כאשר עכברים עם תנאי נשימה כגון זיהום ויראלי משמשים, כהשעית תא הראשונית תכיל שיעור גבוה משמעותי של לימפוציטים ותאים אחרים של מערכת חיסון שגויסו לדרך הנשימה. לAECII מבודד מריאות נגועות IAV ביום 3 הזיהום הבא שנצפינו הפחתת התדירות של תאים בשער AECII על ידי בערך 50%.

סוג טיפוסי, כמו ...

דיון

הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי על ידי הזרימה cytometry מציע דרך מהירה לגישה לתאים ראשוניים מריאת העכבר למגוון שלם של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים. ההליך המתואר תשואות אוכלוסיות קיימא והטהורות ביותר של AECII כי הם די במספר ניתוחים שלאחר מכן ישירות, כגון בידוד RNA (ראה דמות 2b) ומחקרי transcriptome. ליישומים פונקציונליים, אפשר גם לתרבות התאים המבודדים, המאפשר לדוגמה את הדור של מדיום מותנה AECII או ניסויי שיתוף תרבות. כהטבה במיוחד ללימודים פונקציו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
שכינת צינורית Introcan 22g	בראון	REF 4252098B
Dispase, 100 מ"ל (5000 יחידות caseinolytic)	BD Biosciences	354235	aliquot עד 4 מ"ל בצינורות 15 מ"ל, חנות ב -20 ° C
Biozym הרובד agarose	Biozym	840101	1% w / v בH 2 O
Deoxyribonuclease אני מלבלב שור, 2000 יחידות קוניץ / בקבוקון	סיגמה אולדריץ	D4263	טרי לפזר תוכן של בקבוקון 1 בשנת 300 DMEM μl
DMEM	Gibco	22320-022	משמש כמסופק על ידי יצרן (G הנמוךlucose, פירובט, HEPES)
מסננות סלולריות (100 מיקרומטר, 75 מיקרומטר)	BD פלקון	352360, 352350
ניילון רשת (48 מיקרומטר, 30 מיקרומטר)	Bückmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 מסנן מיקרומטר	PARTEC	04-0042-2317
אנטי עכבר CD16/CD32	BioLegend	101302	שיבוט 93; מטוהרים
אנטי עכבר F4/80	BioLegend	123116	השיבוט BM8; APC מצמידים
אנטי עכבר CD11b	BioLegend	101208	השיבוט M1/70; PE מצמידים
אנטי עכבר CD11c	BioLegend	117310	השיבוט N418; APC מצמידים
נגד עכברCD45	BioLegend	103102	שיבוט 30-F11; מטוהרים
אנטי עכבר CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE מצמידים
עיזים אנטי עכבר IgG polyclonal	BD Pharmingen	550767	polyclonal, PE מצמידים
			נוגדנים מצמידים fluorochromes החלופי יכולים לשמש, בהתאם cytometer הזרימה והלייזרים הזמינים.