מאמר שיטה
אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.
במהלך השנים האחרונות, התרומה של תאי שומן מסוג II (אפיתל AECII) להיבטים שונים של רגולציה בחיסון הריאות הוכרה יותר ויותר. AECII הוכח להשתתף בייצור ציטוקינים בנשימה מודלקת ואפילו לפעול כהצגת אנטיגן תאים הוא בזיהום והתפתחות מחל תאי T תיווך 1-8. לכן, הם מעניינים במיוחד גם בהקשרים קליניים כגון-תגובתיות היפר נשימה לזרה ו- אנטיגנים עצמיים, כמו גם זיהומים שבמישרין או בעקיפין למקד AECII. עם זאת, ההבנה של הפונקציות החיסוניות המפורטות מוגשות על ידי תאי האפיתל סוג II במכתשיים הריאה הבריאה כמו גם בדלקת שלנו נשארת חלק. מחקרים רבים בנוגע לתפקוד AECII מתבצעים באמצעות עכבר או שורות תאי אפיתל מכתשיים אדם 9-12. עבודה עם שורות תאים בהחלט מציעה מגוון של הטבות, כגון זמינות של מספר גדול of תאים לניתוחים נרחבים. עם זאת, אנו מאמינים כי השימוש בAECII העכברי העיקרי מאפשר הבנה טובה יותר של התפקיד מסוג זה תא בתהליכים מורכבים כמו זיהום או דלקת אוטואימונית. AECII העכברי הראשי יכולה להיות מבודד באופן ישיר מבעלי חיים סובלים מתנאי נשימה כאלה, כלומר הם היו כפופים לכל הגורמים החיצוניים הנוספים ששחקו תפקיד בהגדרה נתחה. כדוגמה, AECII קיימא יכול להיות מבודד מעכברים נגועים intranasally עם שפעת וירוס, אשר בעיקר מטרות אלו תאים לשכפול 13. חשוב מכך, באמצעות זיהום vivo לשעבר של AECII המבודד מעכברים בריאים, מחקרים של תגובות התאיות רכובות על זיהום יכולים להיות רחוקים יותר מורחבים.
הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי העיקרי מתבסס על עיכול האנזימטית של ריאת העכבר ואחריו התיוג של השעית תא וכתוצאה עם נוגדנים ספציפיים לCD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 וCD16/CD32. AECII הגרעיני לאחר מכן זוהה כאוכלוסיית תא הפיזור ללא תווית וצידה הגבוה (SSC גבוה) ומופרד על ידי תא הפעיל פלואורסצנטי מיון 3.
בהשוואה לשיטות חלופיות של בידוד תאי האפיתל עיקריים מריאות עכבר, הפרוטוקול שלנו לבידוד cytometric זרימת AECII ידי בחירה שלילית פירוש לא נגע, בת קיימא והטהור ביותר AECII בזמן קצר יחסית. בנוסף, ובניגוד לשיטות מקובלות של בידוד על ידי צילום פנורמי ודלדול של לימפוציטים באמצעות קשירה של נוגדן בשילוב חרוזים מגנטיים 14, 15, מיון תא cytometric זרימה מאפשר אפליה באמצעות גודל תא וגרעיניות. בהתחשב בכך שהמכשור למיון תא זרימת cytometric זמין, ההליך המתואר ניתן ליישם בעלויות נמוכות יחסית. הבא לנוגדנים ואנזימים להתפוררות ריאות, ללא ריאגנטים נוספים כגון מגנטי רגיליםחרוזים נדרשים. התאים המבודדים מתאימים למגוון רחב של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים, הכוללים בתרבות מבחנה ומבחני גירוי תאי T, כמו גם transcriptome, Proteome או ניתוחי secretome 3, 4.
פרטים בדבר חומרים כימיים וחומרים נדרשים מפורטים בטבלה בסוף הפרוטוקול להלן. לפני תחילת עבודה, להכין 15 צינורות מ"ל (אחת לעכבר) המכילים 4 מ"ל של dispase ומראש חמים להם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בבלוק חימום, זמן קצר לחמם aliquots הקטן של 1-% להמס agarose הנמוך (במים) עד 95 מעלות צלזיוס עד שנוזלים ובהמשך קריר עד 45 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
1. הכנת הריאות המאוסות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בעת מיון השעיות תאי ריאה שבודדו מעכברים בריאים, שער AECII יהיה בדרך כלל מהווה כ 42 ± 10% מכל האירועים. אחוז זה יכול להיות ניכר נמוך יותר כאשר עכברים עם תנאי נשימה כגון זיהום ויראלי משמשים, כהשעית תא הראשונית תכיל שיעור גבוה משמעותי של לימפוציטים ותאים אחרים של מערכת חיסון שגויסו לדרך הנשימה. לAECII מבודד מריאות נגועות IAV ביום 3 הזיהום הבא שנצפינו הפחתת התדירות של תאים בשער AECII על ידי בערך 50%.
סוג טיפוסי, כמו .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי על ידי הזרימה cytometry מציע דרך מהירה לגישה לתאים ראשוניים מריאת העכבר למגוון שלם של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים. ההליך המתואר תשואות אוכלוסיות קיימא והטהורות ביותר של AECII כי הם די במספר ניתוחים שלאחר מכן ישירות, כגון בידוד RNA (ראה דמות 2b) ומחקרי transcriptome. ליישומים פונקציונליים, אפשר גם לתרבות התאים המבודדים, המאפשר לדוגמה את הדור של מדיום מותנה AECII או ניסויי שיתוף תרבות. כהטבה במיוחד ללימודים פונקציו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
ברצוננו להודות למ Hoxter לקבלת סיוע טכני במיון AECII העכברי העיקרי בין 2 דגימות רמת biosafety.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמניה (DFG) לDB (SFB587, TP-B12 וBR2221/1-1) ומלגה מבית הספר למחקר ביו הנובר (DFG GSC 108) לרמה של AA. DB נתמך על ידי היוזמה של הנשיא וקרן רשת של הלמהולץ איגוד מרכזי מחקר הגרמני (HGF) תחת W2/W3-029 מספר החוזה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| שכינת צינורית Introcan 22g | בראון | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 מ"ל (5000 יחידות caseinolytic) | BD Biosciences | 354235 | aliquot עד 4 מ"ל בצינורות 15 מ"ל, חנות ב -20 ° C |
| Biozym הרובד agarose | Biozym | 840101 | 1% w / v בH 2 O |
| Deoxyribonuclease אני מלבלב שור, 2000 יחידות קוניץ / בקבוקון | סיגמה אולדריץ | D4263 | טרי לפזר תוכן של בקבוקון 1 בשנת 300 DMEM μl |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | משמש כמסופק על ידי יצרן (G הנמוךlucose, פירובט, HEPES) |
| מסננות סלולריות (100 מיקרומטר, 75 מיקרומטר) | BD פלקון | 352360, 352350 | |
| ניילון רשת (48 מיקרומטר, 30 מיקרומטר) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 מסנן מיקרומטר | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| אנטי עכבר CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | שיבוט 93; מטוהרים |
| אנטי עכבר F4/80 | BioLegend | 123116 | השיבוט BM8; APC מצמידים |
| אנטי עכבר CD11b | BioLegend | 101208 | השיבוט M1/70; PE מצמידים |
| אנטי עכבר CD11c | BioLegend | 117310 | השיבוט N418; APC מצמידים |
| נגד עכברCD45 | BioLegend | 103102 | שיבוט 30-F11; מטוהרים |
| אנטי עכבר CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE מצמידים |
| עיזים אנטי עכבר IgG polyclonal | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE מצמידים |
נוגדנים מצמידים fluorochromes החלופי יכולים לשמש, בהתאם cytometer הזרימה והלייזרים הזמינים. |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה