מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מחיקות Gene הגנום ב

16.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4356

⸱

23 בנובמבר 2012

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה באמצעות סטרפטוקוקוס sanguinis כאורגניזם מודל. שיטה זו השיגה דרך PCRs גבוה התפוקה רקומביננטי ותמורות.

תקציר

Transposon mutagenesis ומחיקה של גן היחיד הם שתי שיטות שיושמו בנוקאאוט גן גנום רחב ^ב1,2 חיידקים. למרות mutagenesis transposon הוא פחות זמן רב, יקר פחות, ואינו דורש מידע הגנום הושלם, יש שתי חולשות בשיטה זו: (1) האפשרות של מוטציות שונות בספריית המוטציה המעורבת שנגד בוחרת מוטנטים עם תחרות ירד; ו (2) האפשרות של איון גן החלקי לפיו גנים לא לגמרי מאבדת את תפקודם לאחר החדרת transposon. ניתוח מחיקה של הגן יחיד עשוי לפצות על חסרונות הקשורים mutagenesis transposon. כדי לשפר את היעילות של מחיקה הגנום בודדה גן, אנו מנסים להקים טכניקת תפוקה גבוהה למחיקת גן יחידה הגנום באמצעות sanguinis Streptococcus כאורגניזם מודל. כל מחיקת גן לבנות בס sanguinis הגנום נועד מהווה 1-KB זרם של הגן הממוקד, גן APHA-3, חלבון התנגדות kanamycin קידוד, או במורד 1-KB של הגן הממוקד. שלושה זוגות של פריימרים F1/R1, F2/R2, וF3/R3, בהתאמה, מתוכננים ומסונתזים בפורמט צלחת 96-גם ל- amplifications PCR של שלושה המרכיבים האלה של כל מחיקה להקים. Primers R1 ו F3 מכילים רצפי 25-BP שמשלימים לאזורים של-3 APHA הגן בקצה 5 'שלהם. הגברת PCR קנה מידה גדולה של-3 APHA הגן מתבצעת פעם אחת ליצירה כל מבני המחיקה בגן בודד. האמרגן של גן APHA-3 בתחילה הוצא כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קוטב קלטת kanamycin. כדי ליצור מבני מחיקת הגן, הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור מבוצעות בפורמט צלחת 96-כן. Amplicon PCR רקומביננטי יניארית לכל מחיקת גן יהיה מורכב באמצעות ארבע תגובות PCR באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה. Expon הראשונישלב הצמיחה ential של ס ' sanguinis תרבית בטוד יואיט מרק בתוספת 2.5% סרום סוס מומת משמש כדי להגדיל את היכולת של שינוי מבני PCR-רקומביננטי. תחת תנאי זה, עד 20% של ס ' תאי sanguinis ניתן להפוך באמצעות ~ 50 ng של DNA. בהתבסס על גישה זו, 2048 מוטנטים עם מחיקת גן יחיד סופו של דבר התקבלו מ2270 הגנים בס sanguinis למעט 4 ORFs גנים כלולים כולו בתוך ORFs האחר בס sanguinis SK36 ו218 גנים חיוניים פוטנציאליים. הטכניקה ביצירת מבני מחיקת גן היא תפוקה גבוהה ויכולה להיות קל לשימוש במחיקות גן יחידות הגנום לכל חיידקי transformable.