בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
זיהינו אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורמים לגורמי הפרעת קצב פרוזדורים בעכברים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר שנגזרים מאלה שנועדו לבודד את שריר לב עכברי בילוד. על מנת לקבל מלנוציטים לב בריאים מתאימים למהדק תיקון נרחב יותר או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן לבידוד וציפוי מלנוציטים לב המבוססים על אלה שתוכננו במקור לבודד מלנוציטים עורית. ההליך המעודן בא לידי הביטוי בסקירה זו ומייצר מספרים גדולים יותר של תאים כמו melanocyte הבריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.
מבוא
לאחרונה זיהו אוכלוסיית תא רומן בלב של עכברים ובני האדם שמבטאים את אנזימי מלנין-סינתזה ומורפולוגית דומה מלנוציטים עורית. אנו נקראים 'מלנוציטים הלב' התאים אלה ומצאנו שהם נמצאים במקומות אנטומיים שממנו הפרעת קצב פרוזדורים מתעורר בי לעתים קרובות מקורן בבני אדם. מצאנו גם מלנוציטים לב לתרום להפרעות קצב פרוזדורים בעכברים עם מחיקה בתאי מין של DCT. מלנוציטים לב מופצים בדלילות לאורך אטריום העכבר שבו הם מהווים פחות מ -0.1% מכל תאי פרוזדורים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר באמצעות סמנים ספציפיים melanocyte Cre-מושרה. ההליך הראשוני שלנו פותח מאלו המשמשים לבודד את שריר לב עכברי בילוד ומספרים קטנים מאוד הניבו של תאים מתאימים להקלטות מהדק תיקון או ניתוח PCR. עם זאת, על מנת לשפר את לרפאה ואת הכדאיות של מלנוציטים לב, ליותר בניתוח המעמיק אלקטרו או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן מאלה שנועדו לבודד את מלנוציטים עורית. יש ההליך המתואר והפגין בסקירה זו את היתרון של ייצור מלנוציטים לב בריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
.1 הכנת הפתרונות וציוד הדרושים
- ראשית, לעקר את מכשירי ניתוח (מלקחיים ישרים צורה, מלקחיים צורה מעוגלות, מספריים צורה ישרות, ומספריים צורה מעוגלות) על ידי המעוקר במשך 15 דקות. ב 121 C °. להכין 2 סטים של מכשירים, שבו קבוצה אחת משמשת ללנתח את לבם ואת הסט השני ישמש למיותר את הרקמה.
- לפזר 1 שקית של תקשורת בתרבות MCDB153 ב900 מ"ל מים מעוקרים, מסוננים ומערבבים לאט עד שהאבקה נמסה. הוספת 1.2 יקרבונט גרם נתרן, או 15.7 פתרון ביקרבונט מ"ל של נתרן [7.5% w / v], לכל ליטר של נפח הסופי של מדיום שמכין ומערבבים עד שהיא נמסה. התאם את רמת החומציות ל7.2 על ידי הוספה או N HCl 1 או 1 N NaOH, ואז לשפוך את התקשורת דרך מסנן עליון 0.2 מיקרומטר בקבוק בתנאים סטריליים בשכונת תרביות רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי). לאחר מכן לאסוף את התקשורת ולאחסן אותו ב 4 ° C..
- הכן את התוספים ללהוסיף לתקשורת והתרבות (חומרי רשימה). יש להוסיף התוספים לתקשורת רק לפני יש צורך בתקשורת לציפוי התאים.
- הכן DPBS עם 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין).
- בשלב בא, להכין פתרון טריפסין 0.25% על ידי הוספת 0.25 גרם של טריפסין (לבלב שור, פעילות> 2,500 USP יחידות / מ"ג, ultrapure; USB) לשל DPBS בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין) 100 מ"ל.
- ציוד הנדרש אחר הנחוץ להשלמת הליך זה כולל סטראו, פטרי מנות (10 ס"מ), צינורות חרוטי 50 מ"ל, מסננות תא 40-מיקרומטר, DPBS בתוספת אנטיביוטיקה, מנות תרבות 60 מ"מ ומנות תרבות 35 מ"מ.
.2 בידוד לבבות מגורי עכבר ילודים
- ראשית, להשיג P0 לגורי עכבר יילודי P2 (n = 6 עד 8). מומלץ להשתמש בגורים שנוצרו על ידי רביית DCT-Cre נקבות הומוזיגוטים עם זכרים כי הם הטרוזיגוטיים לאו R26R: אלל EYFP או Z אלל / EG לתייגתאים כמו melanocyte-. שני R26R: עכברי EYFP וZ / EG זמינים מג'קסון מעבדות (מספרי מניית 006,148 ו003,920, בהתאמה).
- בשלב בא, להרדים את גורי עכבר יילודים, לנגב חזה עם ספוגית אלכוהול ולאחר מכן למקם את הגורים ב10 ס"מ צלחת פטרי עם DPBS.
- חותך את העור באזור החזה ועצם חזה עם מלקחיים ומספריים מעוקרים ולאחר מכן פתח את החזה בזהירות תחת סטראו. לבם של גורי עכבר יילודים קטנים מאוד כדי להיות זהיר כדי לוודא כדי להסיר את כל הלב עם אטריה המצורפת.
- שטוף את הלב בDPBS ולהעביר אותם לצלחת פטרי 10 ס"מ חדש.
.3 אנזימתי עיכול
- להביא את צלחת פטרי עם הלבבות עקורים למכסת מנוע בתרבית רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי) ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים תוך שימוש בטכניקות סטרילי במכסת המנוע.
- ראשית, לשטוף את הלבבות שלוש פעמים בDPBS בתוספת האנטיביוטיקה סטרילי.
- מניחים את הלבבות (n = 6-8) בצלחת 60 מ"מ התרבות ולהוסיף 6-8 מ"ל של .0.5% פתרון טריפסין לצלחת.
- בשלב הבא, לחתוך את הלב לחתיכות קטנות (פחות מ -1 מ"מ בגודל) ודגירה אותם 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באווירת 5% CO 2.
- , לאחר תקופת הדגירה היא מלאה לשפוך את הפתרון של רקמה וטריפסין מצלחת לב וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי.
- לאחר מכן, באמצעות פיפטה סטרילית 10-מ"ל, במהירות אך בעדינות, triturate הפתרון בצינור חרוטי 50 מ"ל 30-50 פעמים.
- סנן את הפתרון דרך מסננת תא 40-מיקרומטר על גבי צינור חדש, נקי 50 מ"ל חרוטי וכתוצאה מכך לאיסוף התסנין.
- בשלב בא, צנטריפוגות צינור 50 מ"ל ב240 x גרם בצנטריפוגה בטבלה העליונה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. ואז, בעדינות לשאוב את supernatant וresuspend גלולה שנותר ב6-8 מ"ל של DPBS סטרילי. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר. צעד זה פלטות myocytes פרוזדורים ומלנוציטים לב אבל לא להפיל את fibroblasts מאז fibroblasts הם קטנים יותר ויישארו בsupernatant.
תאים דמויי Melanocyte .4 ציפוי הלב
- בעקבות השטיפה השלישית לאחר צנטריפוגה, לנקז בזהירות או לשאוב את הפתרון לשטוף (DPBS) וresuspend גלולה ב6 מ"ל של תקשורת בתרבות MCDB שלתוספים נוספו.
- עכשיו, לצייר הפתרון המושעה לפיפטה העברת סטרילי ולמקם את התאים בצלחת 35 מ"מ, או בטוב של צלחת 6 היטב, וברכת תאי לב הבודדים מ3 עכברים בילוד בצלחת 35 מ"מ אחד או כן.
- דגירה צלחות הלילה בשעה 37 ° C באווירת 5% CO 2, לשאוב את התקשורת והתרבות יחד עם כל תאים פנויים ולאחר מכן לשטוף את הצלחות פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן להוסיף תקשורת טרי לצלחות ולהחליף את התקשורת כל 2 ימים. תאים מבודדים מלב בילוד או עוברי יכולים להישמר בתרבות לתקופה של עד 3 שבועות, ואילו תאים מבודדים מלשמוע מבוגריכול להישמר ts בתרבות עד 10 ימים.
תאים דמויי Melanocyte .5 בידוד לב מלב מאוס למבוגרים
- ראשית, להסיר את הלב מעכברים בוגרים (3-4 שבועות בן, n = 3) דרך sternotomy קו האמצע לאחר מתן הפרין 100 intraperitoneal U לעכברים ולאחר מכן הרדמת חסדם. מומלץ להשתמש pentobarbital להרדים עכברים להליך זה, אך תרופה זו אינה זמינה בכל המקומות.
- בשלב הבא, לשטוף את הלבבות העקורים בDPBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה במכסת מנוע בתרבית רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי). לסחוט את לבם מעט עם מלקחיים לנתח מעוקלים כדי להסיר כל דם שנותר מהם ולאחר מכן לשטוף את לבם בDPBS עוד פעם אחת.
- הסר את הפרוזדורים וannulus בין העליות וחדרים מהלב (מבנים אלה מכילים תאים כמו melanocyte-) ולמקם את דגימות רקמה שהוסרו בצלחת 35 מ"מ.
- חותך את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים וכוח מעוקליםps אז ולהוסיף 6-8 מ"ל של .0.5% פתרון טריפסין לצלחת. ואז דגירה המנות ב37 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות.
- עכשיו, בצע את השלבים מהתהליך שתואר לעיל החל מהצעד 3.6 ואילך.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא טכניקה משופרת בהשוואה לזו שפורסמנו בעבר לבידוד מלנוציטים לב מהלב העכברי. הליך זה מעסיק את השימוש של סמני ניאון מונעים על ידי Cre-recombinase אנזים ספציפי סינתזת מלנין לתייג תאים כמו melanocyte-לב. חשוב להשתמש בסמן כדי לתייג מלנוציטים לב כאשר עובדים עם תאים עובריים או בילוד טרי מבודדים, מאז ההבדלים מורפולוגיים המבדילים מלנוציטים לב מmyocytes פרוזדורים עדיין לא פיתחו (איור 1 א). כפי שניתן לראות באיור 1 א כאשר צעד הבידוד...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מלנוציטים לב נמצאים במקומות אנטומיים בתוך הלב, כי בדרך כלל לגרום לטריגרים הפרעות קצב פרוזדורים. אזורים אלה כוללים את ורידי ריאה, annulus בין העליות והחדרים, המבואה האחורית עזב וovale הנקב (איור 4). כדי להבין את תפקיד תאים אלה לשחק בarrhythmogenesis, אנו מפתחים טכניקות לבודד אותם וללמוד הפיסיולוגיה שלהם. עם זאת, אנחנו מוכרים את זה השיפור בטכניקה זו כדי להניב כמויות בריאים וגדולות יותר של מלנוציטים לב תאפשר מחקרים נוספים כדי לחקור את התגובה של מלנוציטים לב לגירויים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בפרס R01 HL105734 לVVPMDL נתמך, בין שאר, על ידי המכון הלאומי לבריאות בקריירה מחקר פרס K08 HL094748. VVP הוא חוקר חדשני של איגוד הלב האמריקאי נתמך על ידי מענק 11IRG900384.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | להמיס במים |
| DPBS, ללא סידן וללא מגנזיום | Invitrogen | 14190136 | ריכוז מלאי: 1x ריכוז עבודה: 1x |
| פניצילין-סטרפטומייצין | Invitrogen | 15140163 | ריכוז מלאי: 100x ריכוז עבודה: 1x |
| סרום בקר עוברי (Fetal Bovine Serum) | Life Technology | Certified | ריכוז עבודה: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | להמיס ב-DMSO ריכוז מלאי: 3.2 μM ריכוז עבודה: 32 nM |
| טרנספרין (Transferrin) | Sigma-Aldrich | T8158 | להמיס ב-DPBS ריכוז מלאי: 0.1 mg/ml ריכוז עבודה: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | להמיס ב-DPBS ריכוז מלאי: 0.5 mM ריכוז עבודה: 5 μM |
| אינסולין | Sigma-Aldrich | I6634 | להמיס בחומצה אצטית 10 mM ריכוז מלאי: 1 mg/ml ריכוז עבודה: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | להמיס במים ריכוז מלאי: 4 ng/μl ריכוז עבודה: 4 ng/ml |
מקורות
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
