שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

סיכום

אנחנו מציגים את שיטה חדשה לשמירה על רירית מעי אנושית בתרבות ובניטור של התגובה לסוגים שונים של גירויים על פני לפחות 24 שעות. בשיטה שלנו, את הקוטביות של הרקמה נשמר, מה שמאפשר לגירוי פיסיולוגי דרך מסלול הפסגה.

תקציר

דגמים אחדים קיימים כיום לדמות מיקרו הסביבה של המעי האנושי המורכב, שבו מגוון רחב של יחסי גומלין יתקיים מציאותי. הומאוסטזיס תקין ישירות תלוי באינטראקציות הללו, כפי שהם מעצבים את סובלנות גרימת תגובה חיסונית נגד אנטיגנים מזון כולו ובו בזמן ההרכבה תגובה חיסונית יעילה כנגד חיידקים פתוגניים לבלוע בטעות עם אוכל.

הומאוסטזיס מעיים נשמר גם דרך אינטראקציות מורכבות שונות בין החיידקים (כולל זני חיידקים מועילים הקשורים לאוכל) והמארח, שמסדירים את הקובץ המצורף / השפלה של ריר, את הייצור של פפטידים מיקרוביאלית על ידי מחסום אפיתל, ו" החינוך "של תאי אפיתל 'ששולט פנוטיפ tolerogenic או immunogenic של ייחודיים, מעיים תושבי תאי הלימפה "אוכלוסיות. אינטראקציות אלה היו עד כה קשים מאוד לשחזר עם מבחני חוץ גופיתאו באמצעות שורות תאים בתרבית או תאי דם היקפיים mononuclear. בנוסף, מודלים עכבר שונים באופן מהותי ברכיבים של רירית המעי (ארגון שכבת ריר, קהילת חיידקי commensal) ביחס למעי האדם. לכן, מחקרים של מגוון רחב של טיפולים שהביאו במרפאות לתנאים חשובים הקשורים ללחץ או פתולוגי כגון תסמונת מעי רגיז, מחלות מעי דלקתיות או סרטן מעי גס היו קשים לביצוע.

כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו מערכת חדשנית המאפשרת לנו לעורר explants של רירית מעי אדם ששומר עליהם באתרו על ידי מיזוג חיידקי המארח והתגובה חיסונית, באופן קוטבי. גירוי הפסגה מקוטב הוא בעלת חשיבות רבה לתוצאות שהושרו תגובה חיסונית. הוכח שוב ושוב את אותם גירויים שיכולים לייצר תגובות שונות לחלוטין כאשר הם עוקפים את פני הפסגה של EPI המעייםthelium, מגרה את תאי האפיתל basolaterally או לבוא במגע ישיר עם רכיבי propria lamina, מיתוג פנוטיפ מtolerogenic לimmunogenic וגורם לדלקת מיותרת ומוגזמת באזור.

השגנו גירוי מקוטב על ידי הדבקת גליל מערה שתחם את האזור של גירוי על פני הפסגה של הרירית כפי שיפורט בפרוטוקול. אנחנו השתמשנו במודל זה כדי לבחון, בין יתר, השפעות שונות של שלושה זני לקטובצילוס שונים. אנו מראים כי מערכת המודל הזה היא חזקה מאוד כדי להעריך את מאפייני המערכת החיסונית של פרוביוטיקה בתנאים בריאים ומחלה.

פרוטוקול

1. קבלת והכנת רקמות

1. רקמה (בריא או IBD רירית) מתקבלת במהלך ניתוח. ברגע שהוא נכרת העברת הדגימה למעבדה בהקדם האפשרי, להשאיר אותו ^ב+ / Mg ⁺ חיץ HBSS Ca ^{+ +} ללא תוספת פן / סטרפטוקוקוס על 4 מעלות צלזיוס או על קרח.

* גודל הדגימה תלוי בזמינות של הרקמה: חלק מהרקמה שהושגה, הוא אך ורק את מה שאין צורך לאבחון ויכול להשתנות במידה רבה בין נבדקים בריאים ומחלת מעי דלקתי. רקמה בריאה הוא נכרת מחולים שעברו ניתוח לטיפול בסרטן מעי גס.

2. שטוף את הרקמות בעדינות ולנקות אותו מכל חומר mesenteric. הפרד את השכבה רירית מsubmucosa באמצעות מספריים מלקחיים סטריליים, תוך שמירה על הרקמה בחיץ HBSS בצלחת פטרי (לא בהכרח immerged). לגעת במשטח הרירי עם המלקחיים קטן ככל האפשר.
3. חותכים רירית בפסי ג לפחות 1מ 'רוחב וזמן רב ככל האפשר. השתמש בשני אזמלים סטריליים, הרבה כאילו היית חיתוך האוכל שלך.
4. שטוף בעדינות לנקות את הרירית בHBSS ולהרחיב אותו על צלחת פטרי עם צד apical יפנה כלפי מעלה.

2. הרכבה רקמות

1. הכן את המדיום חדש (tisDMEM). השתמש DMEM בתוספת גלוטמין (2 מ"מ) וNaPyr (1 מ"מ), ולהוסיף 15% FBS-Na (סרום שור עוברי - בצפון אמריקה), 1% ITS-X ו-EGF 200 ng / ml בעת השימוש.
2. למלא צלחת פטרי 10 ס"מ עם שאר FBS-Na (להשתמש בכ -30 מ"ל, כך שרשתות מתכת תהיה שקועות לחלוטין) ולהטביע את רשתות המתכת. שמור את הצלחת לפתוח ולתמוך בגלילי הפלסטיק על הברז שלה.

* רשתות המתכת עשויות ברזל. הרשת היא בצורת ריבוע עם צד של 0.5 מ"מ.

3. קח 3 μl של דבק כירורגי עם 10 או 20 פיפטה μl. יש ליישם אותה בזהירות לאחד מגבולותיה של גליל פלסטיק בעת החזקתו fIRM עם המלקחיים.
4. מניח בעדינות את הגליל בצד הפסגה של הרירית, קרוב לאחד מגבולות הרצועה ככל האפשר.
5. כדי לתת זמן הדבק לצרף את הגליל על הרקמה בתקיפות, להכין צלחת תרבות איבר המרכז היטב: לוותר על 850 מיליליטר μl-1 של מדיום במרכז היטב ותומך ברשת המתכת בשולי של הצלחת המרכזית היטב.
6. לחתוך את הרקמות עודפת מהגבולות של הגליל באמצעות שני אזמלים סטריליים כמו קודם.
7. רם בעדינות את הגליל עם הרקמה המצורפת ומניח בצד basolateral על רשת המתכת במרכז הצלחת.

3. גרייה

1. השתמש בגירויים על פי בחירתך בריכוז המועדף עליך.
2. החל הנפח מתאים במרכז גליל הפלסטיק מבלי להפריע את הצילינדר או את פני השטח הרירי עם קצה פיפטה. ודא שעוצמת הקול שבחרת אחיד מכסה את פני השטח בתוך הצילינדר. בתוךכרכי dicated:
   גליל פלסטיק גדול: 200 μl
   μl 100: גליל פלסטיק בינוני
   גליל פלסטיק קטן: 50 μl
3. דגירה לתקופה של עד 3 שעות בחממה קונבנציונלית.

* אם ברצונך דגירה של נקודות זמן ארוכות יותר, הקפד להשתמש בנפח קטן בהרבה של גירויים (10-20 μl) וישירות למקם את הרקמה באווירה של 100% O ₂ בלחץ של כספומט 1 (ראה 3.5) .

4. קח בינונית עם הגירויים מחוץ למשטח הפסגה של הרקמה ולא להחליף עם מדיום חדש, משום שהרקמות אינה מקבלים מספיק O ₂ אם שכבה עבה של מדיום על פני הפסגה מונעת חילוף גזים. מכסה את הצלחת.
5. הנח את הרקמה באווירה של 100% O ₂ בלחץ של כספומט 1.

4. קציר

1. לאחר 24 שעות של זמן התרבות כולל (± 2.5 שעות) להסיר את הגליל מה בזהירותרקמת הדואר בעזרת דבק בעדינות מגרד אזמל ולאחסן אותו בהתאם לניתוח הרצוי (לתקן אימונוהיסטוכימיה ו / או מבחני immunofluorescence, או הקפאת הצמד בN2 הנוזלי לטיהור RNA ופרופיל ביטוי גן או טיהור חלבונים ומבחני מערב למחוק ).
2. למסוק בינוני basolateral לפרופיל הפרשת ציטוקינים. צנטריפוגה ב 8000 סל"ד במשך 7 דקות לפסולת גלולה, להעביר את supernatant בצינור Eppendorf (לחלופין aliquot) ולאחסן באופן מיידי ב -20 ° C.

* אם אתה רוצה לשמור על supernatants למשך זמן ארוך יותר, לאחסן אותם ב -80 ° C.

תוצאות

אנחנו הצלחנו לשמור על רירית מעי אדם בריאה וIBD בתרבות במשך לפחות 24 שעות שמירה על שלומה של הרקמה. בהתאם לתצפיות קודם ^1, זה היה אפשרי רק אם רוב זמן התרבות (לפחות 85% בסך הכל) התקיים בO _2, כמו הרקמה לא לשרוד במשך 24 שעות בחממות קונבנציונליות (איור 2). יש לנו גם הראו כי תגובות שונות של explants ניתן להבחין במודל זה תלוי בקוטביות של הגירוי (הפסגה לעומת basolateral) וimmunogenicity של הגירויים ^2,3.

דיון

הצורך בדגמים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שבו ניתן לבדוק את הטיפול ברירית מעי אנושי כדין כבר הדגיש ארוך. חוקרים רבים זיהו חפצים ופגמים פוטנציאליים בשניהם תא ⁵ ומודלי עכבר ⁶ השתמש עד כה למטרה זו. ואכן, למרות שנתונים פרה מבטיחים לעתים קרובות מתקבלים, אלה רק לעתים נדירות לתרגם לתועלת קלינית משמעותית.

השיטה המתוארת בעבודה זו, מציגה עיבוד פשוט יחסית, אך יעיל וחדשני לפרוטוקולים קיימים ^{7, 8}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
HBSS בריכוז 10X	Eurocalne	ECM4006XL
פניצלין/סטריפטומייצין	Lonza	DE17602E
גנטמיצין	Gibco	15750-037
DMEM	Lonza	BE12614
FBS-Na	Gibco	16000-044
100X ITS-X	Gibco	51500-056
EGF	Tebu-bio	100-15
L-גלוטמין	Lonza	BE17605E
חומצות אמינו שאינן חיוניות 100X	Gibco	11140-035
NaPyr	Gibco	11360-039
<חזק>חומרים
שליחוני שיבוט 6x8 מ"מ	BellCo	2090-00608
גלילי שיבוט 8x8 מ"מ	BellCo	2090-0080
שקיקי שיクלוניקה 10x10 מ"מ	BellCo	2090-01010
רשתות מתכת	תוצרת בית
צלחת לתרבית איברים עם באר מרכזית	BD Falcon	353037
דבק כירורגי (Vetbond)	3M	1469SB
צנצנות חמצן	הכנה ביתית
מכלי חמצן	חיטוי אוויר ונוזליםà