זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

סיכום

ניתוח של כלי דם במוח האנטומיה מכרסם משחק תפקיד חשוב במחקר ניסויי שבץ. בהקשר זה, זלוף intravascular עם לטקס צבעוני כבר נחשב כלי סטנדרטי במשך כמה שנים. עם זאת, טכניקה זו מרמזת מגבלות טכניות שונות, המערערים את השחזור שלה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לדמיין כולים מוחיים באופן שחזור. הזרקה של תערובת של שני צבעים שחורים פחם מסחרי זמינים דרך תוצאות חדר לב השמאליות של שריר הלב במילוי נאות של כולים מוחיים עם הדמית ניגודיות גבוהה. יש לנו ליישם בהצלחה בטכניקה זו כדי לזהות נקודתי anastomotic בין שטחי כלי דם מוחיים של עכברים עם רקע גנטי שונה. סוף הסוף אנחנו נותנים ראיות לכך שהשיטה חדשה ופשוטה לצביעת כלי יכולה להיות משולבת עם כלוריד triphenyltetrazolium (TTC) צביעה - כלי בשימוש נרחב כדי להתבונן ולנתח כמויות אוטם בעכברים.

תקציר

המבנה האנטומי של כולים מוחיים הוא גורם מפתח עבור פרמטרים המודינמיים במוח, כמו גם את חומרת פציעה בעקבות עלבונות איסכמי. מערכת כלי הדם במוח באופן דינמי מגיבה למצבים שונים pathophysiological והוא מציג הבדלים משמעותיים בין זנים ובתנאים של מניפולציות גנטיות. בעיקרו של דבר, טכניקה אמינה לצביעת כלי שיט תוך גולגולת היא חיונית כדי ללמוד בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עד לאחרונה, אוסף של טכניקות שונות כבר מועסק לדמיין vasculature המוחין כולל הזרקה של שרף צמיגות נמוך, araldite F, ג'לטין מעורב עם צבעים ¹ (כלומר ארגמן אדום, הודו דיו) או לטקס שונים עם ² או ³ ללא הפחם שחור. טפטוף של מתחם לטקס לבן דרך אב העורקים עולה כבר דווח לראשונה על ידי קויל וJokelainen ^3. מאדה et al. ² שינה את הפרוטוקול על ידי הוספת carboדיו שחור n למתחם הלטקס להדמית ניגוד משופרת של הכולים לאחר זלוף המלוח של המוח. עם זאת, זלוף לא יעיל ומילוי לקוי של הכולים לעתים קרובות חוו עקב צמיגות גבוהה של מתחם הלטקס ^4. לכן, יש לנו תארנו טכניקה פשוטה וחסכונית באמצעות תערובת של שני צבעים שחורים פחם זמינים מסחרי (CB1 ו CB2) כדי להמחיש את מערכת כלי הדם במוח באופן לשעתק ^5. הראנו שזלוף עם CB1 CB2 + בתוצאות עכברים בצביעת כולים מוחיים קטנים משמעותי בצפיפות גבוהה יותר בהשוואה לזלוף הלטקס ^5. כאן, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לזהות את נקודתי anastomotic בין הקדמי (ACA) ועורקי מוח אמצעיים (MCA) ללמוד וריאציות כולים בעכברים עם רקע גנטי שונה. לבסוף, אנו להוכיח את ההיתכנות של הטכניקה שלנו במודל חולף מוקד מוחות איסכמיה בעכברים על ידי שילוב CB1 +צביעת כולים CB2 בתיווך עם כתמי TTC בדרגות שונות של פציעות איסכמי.

פרוטוקול

1. בעלי חיים

1. ניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הרשויות המקומיות. לכל הניסויים, C57Bl6 / י עכברים ברי סוג, ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE KO) וSV129 עכברים (12-16 שבועות ישנים, משקל גוף, גרם 26-30 5-6 חיות לקבוצת ניסוי) היו בשימוש.

2. צביעת כלי מוחות עם אטקס הצבעוני

1. הכן תערובת של דיו 25 μl פחם שחור (הרליץ, גרמניה) עם 0.5 מ"ל של תרכובת לטקס (Pebeo, צרפת) בשעת 1:20 ביחס צינור EP ולחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאסוף את התערובת במזרק מ"ל 2 עם מחט של 28-30G לפני מרדים בעלי החיים.
2. להמס 50 מ"ג של אבקת הידרוכלוריד papavarine לתוך 1 מ"ל של תמיסת מלח הרגיל סטרילי. אסוף את הפתרון במזרק אינסולין. לנתק את המחט ממזרק אינסולין אחר סטרילי. הנח מחט זה בסוף 20 גמ 'PE10 צינור ארוך. עכשיו לצרף צינור PE10 זה במחט של מזרק האינסולין המכיל פתרון הידרוכלוריד papavarine להיות מוזרקים דרך וריד הירך כדי להבטיח vasodilatation ומילוי תקין של כלי דם.
3. הכן שני מזרקי אינסולין עוד כל מ"ל מכיל 1 מתוך תמיסת מלח. מזרקי אינסולין לאפשר אספקה ​​חלקה של הנוזל שהוזרק במיקום מדויק. עם זאת, בשל צמיגות גבוהה של לטקס, חלופה 1 מיליליטר מזרקים עם מחטים נשלפות רחבות יותר יש להשתמש.
4. קח את כל המזרקים והמכשירים מבתרים מעוקרים הקרובים לשלב ההפעלה. פרש יריעת דרייפר כירורגית סביב במת המבצע. שלב הפעולה צריך להיות מואר מספיק ומיקרוסקופ ניתן להשתמש במידת צורך.
5. עכשיו למדוד את משקל גופו של עכבר C57Bl6 / י ולאחר מכן לגרום להרדמה של 5% מתאדים isoflurane ב70% N ₂ O ו 30% O _2. המשך להרדמה של 1% מisoflurane מתאדה. לאחר positionin התקיןגרם של העכבר על הגב וקיבועה של הגפיים, להעריך את עומק ההרדמה. ואז לחתוך את העור מעל וריד ירך שמאל ולאתר את הווריד. הכנס את הקצה החד של המחט שהונחה על PE10 צינורית ולהזריק פתרון הידרוכלוריד papavarine לאט בקצב של 100 לדקה μl (משקל 50 מ"ג / קילו משקל גוף).
6. לאחר ההזרקה, לחתוך את חלל הבטן ולנקב את הסרעפת. חותך את הצלעות לחשוף את הלב מבלי לפגוע או חבורותיו. קליפ אב עורקים החזי יורד עם כ מלקחיים עורקים. הפוך קיצוץ חד בעלייה הימנית כדי לאפשר לדם הוורידים לנקז החוצה. להזריק 2 מ"ל של תמיסת מלח לתוך החדר השמאלי, ואחריו על ידי ההזרקה באופן ידני עם הלטקס הצבעוני לחץ קל על 18-20 שניות. השתמש במזרקים הממולאים מראש בזה אחר זה. הימנע מהזרקה כל בועות.
7. לאחר ההזרקה של לטקס, לעזוב את החיים למשך 5 דקות. לערוף את החיה ולהסיר את המוח כולו בזהירות. תשמרו על עצמך טוב שלא לפגוע בכלי הדם ובארכיטקטורת קורטהx תוך הסרת עצם הגולגולת וקרומי המוח. מניח את המוח בצלחת תרבית תאים 60 מ"מ המכילה 6-8 מ"ל של 4% PFA לקחת תמונה. הנח שליט מדידה תחת הצלחת השקופה. קח את התמונות בהגדלה של 25x גב ופני שטח הגחון של המוח עם מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. תמונות יש לקחת בזווית של 90 מעלות בין צלחת הפטר והאובייקטיבי במיקרוסקופ כדי לכמת את המרחק המקורי.
8. חזור על התהליך בחי 4-5 נוספות.

3. צביעת כלי מוחות עם תערובת של סוגי דיו פחם שחורים

1. כדי להשוות את התוצאה של הכתמת לטקס מבוססת מוחות כלי דם בפרוטוקול שלנו, להכין תערובת של 100 μl של הרליץ Stempelfarbe דיו (CB1) עם 900 μl של שקנאי Scribtol שוורץ דיו (CB2) בצינור 1.5 מ"ל EP. הכן שני צינורות EP לעשות נפח כולל של תערובת 2 מ"ל של CB1 ו CB2 ביחס 01:09. לאסוף את התערובת בשני מזרקי אינסולין נפרדים (1מ"ל כל אחד). מכסה את המזרקים ולמקם אותם באמבט מים כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס איסוף 2 מ"ל של תמיסת מלח במזרקי אינסולין 2 נוספים, ולמקם אותם באמבט מים גם כן.
2. הרדם את החיה וחוזר על אותו התהליך כפי שתואר לעיל, פרט להזרקת hydrochloride papavarine. בעקבות זריקה של 2 המ"ל salaine לחדר השמאלי, מזריק תערובת 2 מ"ל של צבע שחור פחם במקום לטקס הצבעוני. לבצע את הזריקות ביד עם לחץ קל על 18-20 שניות למ"ל. קליפ אב העורקים החזי יורד לפני את הזריקות.
3. להקריב את החיה, הסר את המוח ולצלם.
4. לשימור לטווח הארוך של המוח, לשים את המוח ב4% PFA הלילה אחרי דגירה עם סוכרוז בריכוז גובר בהדרגה, עד שהמוח הצף טובלות לחלוטין (אחרי 5% ב 15% ולאחר מכן 30%). מוחם של בעלי חי perfused עם הלטקס הצבעוני גם יכול להישמר באותו אופן.
5. בצעהליך בחיות 4-5 נוספות. כדי להשוות את ההבדלים באנטומיה של כלי דם במוח בשל רקע גנטי שונה או זנים, חזור על הפרוטוקול במספר שווה של ApoE KO וSV129 עכברים, בהתאמה.
6. כדי ללמוד את האנטומיה של כלי הדם בתנאי איסכמי, לגרום לאיסכמיה המוחית חולפת מוקד ל45 דקות או 90 דקות בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי של חסימת intraluminal של MCA תחת הרדמה עמוקה (תיאור מפורט של הניתוח הוא מעבר להיקף של מאמר זה; הקורא נקרא Doeppner et al., 2010). בסוף תקופת reperfusion המתוכננת (יום 1 או 5 ימים), לבצע את צביעת כלי הדם עם CB1 CB2 + דיו בלבד וכתם את המוח כולו עם 2% פתרון TTC על 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות כדי לזהות את נפח האוטם . TTC מצטמצם formazan צבע האדום על ידי אנזימי המיטוכונדריה (דהידרוגנז במיוחד succinate). לאחר מכתים TTC, את כתמי הרקמות הפעילות מטבולית עמוק האדומים ואילו רקמות infarcted נשארה unstaiהנד ונראה לבן בשל אנזים המיטוכונדריאלי מתפקד ומפוגל. לאסוף תמונות באותו אופן כפי שתואר לעיל.

4. מחקר של כלי דם במוח שטחים

1. כדי לנתח את האנטומיה הברוטו של כולים מוחיים, תמונות של פני השטח הגבי של המוח או המוכתם עם לטקס צבעוני או CB1 CB2 + דיו ניתן לנתח עם ImageJ תוכנה (תוכנה מבוססת ג'אווה ציבור תחום המשמשת לעיבוד תמונה וניתוח). מוחות perfused עם לטקס צבעוני עשויים להראות מעלות משתנות של כתמי כלי ממוקמים על פני שטח הגבו, בעוד CB1 CB2 + זלוף יהיה כתם לכל הכולים משני משטחי הגחון וגב.
2. פתח קובץ תמונה עם תוכנת ImageJ. לזהות את כל נקודתי anastomotic בין ACA ו-MCA. נקודת anastomotic מוגדרת כאתר שבו קוטר הכלי הוא מרחק החצי בין הנקודות הקרובות ביותר ההסתעפות של ACA וענפי MCA, בהתאמה ² או צר. צייר קו דמיוני (קו anastomotic) על ידי סימון נקודתי anastomotic בעזרת ציור כלי קו מקוטע ותוסף "קו מקווקו".
3. הגדר את ההיקף במ"מ. מדוד את המרחק בין קו anastomotic וקו האמצע ב4 מ"מ זנב לקוטב הקדמי של המוח באמצעות כלי קו ישר וציור כלי "מידה". לעשות את אותו הדבר בגיל 6 המ"מ caudally מהקוטב החזיתי. מנתח את תמונות 3-4 לבעלי חיים ולחשב את הערך הממוצע. השווה את הערכים בין קבוצות שונות של בעלי חיים כדי לזהות את הווריאציה של האנטומיה מוחית. בבעלי החיים C57Bl6 / י, קו anastomotic בין ACA ו-MCA ​​ניתן לייחס קרוב יותר לקו האמצע ב4 מ"מ מגיל 6 המ"מ caudally מהקוטב החזיתי. עכברי KO APOE יציגו הבדל משמעותי מבחינה זו. להיפך, בSV129 עכברי קו anastomotic ישקר ועוד במקביל לקו האמצע הן ב4 מ"מ ו 6 מ"מ caudally מהקוטב החזיתי.
4. כדי לנתח את האנטומיה של כלי הדם אניn תנאי איסכמי, לבצע את החישובים שהוזכרו לעיל. זהה את גבול האוטם כשולי רקמות בצבעים אדומים ולבנים מייצגים את הרקמה פעילה מבחינת חילוף חומרים ורקמות נמקית כתם, בהתאמה. מדוד את המרחק של גבול מהאוטם בקו אמצע 4 מ"מ ובזנב 6 מ"מ מהמוט הקדמי של המוח. אסוף את הערך הממוצע מתמונות 3-4 לבעלי חיים. השווה את התוצאות בין איסכמיה השונה ותקופות reperfusion.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על המגבלות הטכניות של הדמיה מבוססת לטקס הקונבנציונלית של מערכת כלי דם במוח מכרסם. האיור 1A מראה כי זלוף הבא של הלטקס הצבעוני, רק הכלי גדול על פני שטח הגחון הוא מוכתם, עוזב את פני השטח הגבי כל כתם. התוצאה היא גם משתנית מאוד. רק חיה אחת מתוך שישה מופעים חלקית צביעה של ACA ו-MCA ​​הגלוי על פני השטח הגבי של המוח (מידע לא מוצג). לעומת זאת, CB1 CB2 + תוצאות זלוף במילוי מספיק של כולים קטנים וגדולים באופן שווה (1B איור). הצביעה ...

דיון

הטפטוף של CB1 CB2 + על ידי הזרקת הוראות יכול להתבצע בהצלחה על ידי ללא הכשרה נמרצת, מאחר שאינו כרוך בכל מכשיר ספציפי לרמוז לחץ מסוים ^2,3. ההטרוגניות של תוצאות זלוף בפרוטוקול שלנו היא גם זניחה. רק חית 1 מתוך 16 בעלים חיים שאינם איסכמיים ו3 מתוך 20 בעלי חי איסכמי הראו זלוף לא שלם. במקרים אלה, שילוב של בועות במהלך זלוף המלוח שמוביל לחסימה של כולים היה ככל הנראה הסיבה לתוצאה המוצלחת.

למרות הטפטוף של לטקס שה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	שם חברה	מספר
Scribtol שוורץ (CB2)	שקנאי, גרמניה	221 135
Stempelfarbe (CB1)	הרליץ PBS AG, גרמניה	10417202
Gedeo אטקס	Pebeo, צרפת	13042B