בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

סיכום

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

תקציר

fibroblasts סרטן הקשורים (cafs) הוא סוג התא הבולט ביותר בתוך stroma הגידול של סוגי סרטן רבים, בסרטן השד בפרט, והנוכחות הבולטת שלהם קשורה לעתים קרובות עם ^1,2 פרוגנוזה גרוע. Cafs הוא subpopulation הופעל של fibroblasts סטרומה, שרבים מהם להביע את סמן myofibroblast α-SMA ל ^3. Cafs מקורן fibroblasts רקמות המקומיים, כמו גם מתאי מוח עצם שהופקו גויסו לגידול לפתח ולאמץ פנוטיפ CAF תחת השפעת גידול microenvironment ^4. Cafs הוצג כדי להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות גידול תא, אנגיוגנזה, ופלישת ^5-8. אנחנו הוכחנו כי cafs לשפר את צמיחת גידול על ידי תיווך דלקת גידול מקדם, החל בשלבים המוקדמים מראש neoplastic ^9. למרות ראיות גוברות של cafs לשחק תפקיד המפתח בקידום צמיחת גידול,Cafs לומד כבר אתגר מתמשך בשל חוסר הסמנים CAF ספציפיים וההטרוגניות העצומה של תאים אלה, עם תת רבים שיתוף קיים בגידול microenvironment ^10. יתר על כן, לומד fibroblasts במבחנה מתעכבת עקב העובדה שפרופיל ביטוי הגנים שלהם לעתים קרובות שינה בתרבית הרקמה ^11,12. כדי לטפל בבעיה זו ולאפשר ביטוי פרופיל גנטי משוחד של fibroblasts מעכבר רענן ורקמות אדם, פתח שיטה המבוססת על פרוטוקולים קודמים למיון תא Fluorescence-Activated (FACS) ^13,14. הגישה שלנו מסתמכת על ניצול PDGFRα כסמן משטח לבודד מעכבר fibroblasts טרי ורקמה אנושית. PDGFRα מתבטא בשפע על ידי שני fibroblasts וcafs ^9,15 הנורמלים. שיטה זו מאפשרת בידוד של אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הרגיל, כולל, אך לא מוגבלת ל- SMA α + הופעל myofibroblasts. fibroblasts מבודד אז יכול להיותהמשמש לאפיון והשוואה של האבולוציה של ביטוי גנים המתרחשת בcafs במהלך tumorigenesis. ואכן, אנו ואחרים דיווחו על פרופיל ביטוי של fibroblasts בודד על ידי תא מיון ^16. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ופרופיל אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts מרקמות עור שד, סרטן לבלב וסרטן ריאות. יתר על כן, השיטה שלנו מאפשרת גם culturing של תאים ממוינים, על מנת לבצע ניסויים פונקציונליים וכדי למנוע זיהום על ידי תאים סרטניים, אשר לעתים קרובות מכשול גדול כאשר מנסה cafs התרבות.

פרוטוקול

1. ביתור רקמת שד או עור מעכברים

1. לפני ביתור הרקמה הרצויה מעכברים, להכין את הציוד וריאגנטים הבאים:

   ספקים:

   • כלי ניתוח (שטף עם חומר ניקוי ולאחר מכן טבל באתנול 70%).
   • משטח הקלקר לנוח על העכבר במהלך נתיחה.
   • סיכות או מחטים להחזיק עכברים במהלך נתיחה.
   • צנצנת זכוכית עם מכסה לעיכול, מכילה סרגל סערה מגנטי (autoclaved).
   • אמבט מים ב 37 ° C, המכיל stirrer מגנטי צולל ומספיק מים כדי להטביע את צנצנת העיכול, בזמן מנוחה על הצלחת והמערבבים.

   ריאגנטים:

   • FACS חיצי: (4 ° C): פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF (מגנזיום סידן חינם) + 0.5% BSA
   • פתרון collagenase (שנעשה מייד לפני שימוש):
     0.05 גרם collagenase השני
     0.05 גרם collagenase IV
     0.01 Deoxyribonuclease גרם
     20מיליליטר FACS החיץ ראשון שמור על פתרון collagenase על קרח עד לשימוש.
   • PharmLyse (מגיב Lysing אמוניום כלוריד).
   • FACS חיץ השני: פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF + 1% FCS.
2. נתיחה של בלוטות חלב (ראה גם ^17).
   • להרדים נקבות עכברים באמצעות פחמן דו חמצני (CO ₂₎ שאיפה.
   • על משטח קלקר, הנח את העכבר על הגב שלו ולהצמיד את כל ארבעת הגפיים באמצעות 25 מחטי מד (איור 1 א ') בתקיפות. רסס את העכבר בנדיבות עם אתנול 70%.
   • באמצעות מלקחיים, להרים את עור הבטן בקו האמצע ולעשות חתך קטן במספריים חדים.
   • החל מהחתך, לחתוך את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הימנעות בפגיעה בחללי בטן או חזה.
   • חותך את העור על רגליו האחוריות מחתך קו האמצע לכיוון הרגל, וכתוצאה מכך "צורת Y".
   • משוך עור מגוף של עכבר ולהצמיד, חשיפהבלוטות החלב צמוד לחלק התחתון של העור (1B איור).
   • השתמש Q-טיפים בעדינות כדי להפריד בלוטות חלב מעור תוך חיתוך רקמות "ו חיבור עם מספריים חדים קטנים כדי להפריד את בלוטת החלב לכיוון עמוד השדרה של העכבר.
   • בלוטות הבטן (מס '4, 5) הן טובות ביותר עבור פרוטוקול זה. ניתן גם להשתמש בבלוטת החלב ^-2, אבל לקחת בחשבון שבלוטות אלה נמצאות בסמיכות אנטומית לשריר pectoralis אשר עשוי להיות קשה להיפרד, וכתוצאה מכך תאים ממקור רקמה מעורבת.
   • הערה: כאשר מנתחי רקמת גידול, מומלץ להסיר את אזורי נימקים.
3. דיסקציה של רקמות עור: הדרך הקלה ביותר להשיג רקמת עור, מבלי להתמודד עם הסרת שיער היא להשתמש באוזני עכבר. אם כמות גדולה יותר של רקמה נדרשת, אתה יכול לגלח את השיער מגוף עכבר ולנתח עור.
   • להרדים עכברים באמצעות ₂ משאיפת CO.
   • בעזרת מספריים חדים, לחתוך את שתי אוזניים ואת המקום מייד בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן (~ 0.5 מ"ל) של PBS על קרח.

2. הכנת השעית תא חלב בלוטה / עור היחידה

• הנח בלוטות / עור בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן של PBS על קרח חלב. אם רקמה היא דמים לשטוף x2 עם PBS, ולאחר מכן למחוק את PBS העודף.
• ברר ביסודיות עם מספריים מעוגלים.
• הוסף 20 פתרון collagenase מ"ל (הערה: כמות זו של פתרון collagenase תהיה יעיל לנתק כ 5 גרם של רקמה ואוזני חלב או גידול מעכברים עד 15).
• הנח מייד על צלחת מערבבים ב37 ° C אמבט מים, ודגירה במשך 15 דקות תוך ערבוב בקצב בינוני.

הערה: זמני דגירה אופטימליות עשויים להשתנות אם לעכל רקמות אחרות.

• כדי להפסיק את התגובה, להוסיף 30 מ"ל הקר DMEM + 10% FCS.
• מסנן את תערובת throug רקמה / מדיהמסננת תא 70 מיקרומטר חה מונחת על גבי צינור 50 מיליליטר חרוטים.
• צנטריפוגה צינור החרוטים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C.

3. אדומה תמוגה תאי דם

הערה: בשלב זה הוא אינו נחוץ אם עכברים היו לב perfused-עם PBS לפני שהם הקריבו.

• לשאוב supernatant באמצעות פיפטה זכוכית מחוברת לואקום, מבלי להפריע לתא הגלול.
• לlyse RBC, resuspend תא גלול ב 10 מיליליטר פתרון PharmLyse ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
• לנטרל את פתרון PharmLyse ידי ההוספה כ 40 מ"ל של חיץ FACS I.
• ספין צינור החרוטים עם תאים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C.
• לשאוב supernatant.

4. חסימה של Fc אנדוגני

• אופציונלי: תאי ספירה כדי לקבוע את הנפח המתאים לשלבים הבאים.
• תאי resuspend ב1-3 מ"ל FACS חיצי (תלוי oתא מספר n, וכמות הנוגדנים ברצונך להשתמש).
• הוסף FcBlock (אנטי עכבר CD16/CD32) להגיע 1:50 דילול (10 מיקרוגרם / מ"ל), ולדגור על קרח למשך 10-20 '.
  אין צורך לשטוף את FcBlock.

5. הכתמה

• קח את 100 aliquots μl לצינורות Eppendorf כדי לשמש כשליטה בלתי מוכתמת ופקדי צבע אחד (לפי מספר נוגדני ניאון משמשים).
• לfibroblasts תווית: להוסיף אנטי PDGFRα (ישירות מצומדת לfluorophore) לדילול 01:50 (10 מיקרוגרם / מ"ל).
• כדי לתייג את אוכלוסיות תאים אחרות (תאי מערכת חיסון, למשל, תאי האנדותל מקרופגים וכו '): להוסיף נוגדנים מצומדות fluorescently מתאימים לסמני פני שטח, ל1:50 דילול.

הערה: למרות שPDGFRα הוא סמן חזק לfibroblasts, מומלץ לכלול נוגדנים לתאי מערכת חיסוניים ותאי האפיתל במטרה שלא יכלול חיובי כפולאוכלוסיות ובכך לשפר את הטוהר של fibroblasts המבודד.

• הוסף 2 μl של כל נוגדנים לכל אחת ממבחנות אפנדורף בקרת הצבע האחד.
• דגירת תאים עם נוגדני 1 שעה על קרח בחושך.
• לשטוף: למלא צינורות עם חיץ FACS אני וספין למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C.
• לשאוב תאי supernatant, resuspend בFACS חיצי לריכוז של כ 2 10 x ⁶ תאים / מ"ל, או בכל הריכוז המתאים ביותר למיון עם סדרן FACS הזמין שלך.

אופציונלי: תאים ניתן resuspended בFACS חיץ השני לתקופת מיון. זה עשוי לשפר את כדאיויות תא. עם זאת, חשיפה לגורמים בסרום עשויה להיות השפעת ביטוי גנים, שיש לבדוק, ונלקח בחשבון.

• העברת תאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם מסנן עליונים: תאי סינון לחצוצרות למניעת גושים סלולריים.
• על מנת להוציא את התאים מתים, להוסיף 7AAD (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) או נכסיודיד idium (PI) קטעים (פרט לשליטה בלתי מוכתמת).

הערה: כדי להימנע מבזבוז תאים, אתה יכול להוסיף ל7AAD/PI מדגם בלתי מוכתם, לאחר הרישום בFACS, ולהשתמש בו שוב כשליטת 7AAD בלבד.

• שמור דגימות על קרח בעת ניתוח.

6. בידוד של תאים על ידי FACS

(הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש ידע קודם בהפעלת סדרן FACS, למשל BD FACS AriaII, או הסיוע של טכנאי מיומן).

• באמצעות FACS סדרן התוכנה (BD FACSDiva), להכין חלקות ניתוח מתאימות לניתוח פיזור קדימה (FSC), פיזור הצד (SSC), 7AAD, FITC, PE וכל fluorophore אחר המשמש לתאי תווית (איור 2).
• לפני טעינת מדגם זה לסדרן התא, מערבולת בקצרה resuspend תאים.
• התחל על ידי ניתוח מדגם הכתם כדי להגדיר gating לאוכלוסיית התאים המוחלטות, לשער החוצה celפסולת הליטר, וכדי לקבוע autofluorescence או כתמי רקע.
• לנתח דגימת כתם + 7AAD לקבוע שער והאוכלוסייה של תאי חיים מאוכלוסיית התא.
• לנתח כל שליטת צבע אחד כדי לקבוע וכיול פרמטרים כגון פיצויים.
• לנתח דגימה המוכתמת להגדיר את המיקום של שערים למיון.
• ברגע שפרמטרים ושערים לאוכלוסיות התאים הרצויים הוגדרו, מתחיל במיון אוכלוסיות התאים שכותרתו לתוך צינורות Eppendorf או 15 צינורות חרוטי מ"ל המכילים מדיום תרבות או בולם תמוגה רנ"א (כגון RLT חיץ או Trizol).

הערה: אם מיון מספר גדול של תאים, זה לא מומלץ למיין ישירות לתוך מאגר תמוגה רנ"א, כנפח הגדול של נוזל נדן מלווה את התאים ידללו את מאגר תמוגה ולהפחית את התשואה.

• ספין למטה תאים מייד לאחר מיון הוא סיים, והעברה למדיום טרי או חיץ תמוגה רנ"א, דהתלוי ועומד על מטרת הניסוי שלך.
• אם מיון כדי תאים מבודדים תרבות, לבצע סוג סטרילי. להתאוששות טובה יותר של תאים, להשתמש באדום ללא DMEM פנול + 5% FCS במקום FACS חיץ השני ולאסוף תאים לתרבות בינונית עם 20% FCS.
• אם culturing מסודר fibroblasts, קולגן alwaysplate על צלחות מצופות ולא ישירות על פלסטיק כזה תוצאות בהפעלה של fibroblasts המוביל לשינויים בביטוי הגנים שלהם.

תוצאות

שימוש PDGFRα כסמן לתוצאות פיברובלסטים בבידוד של אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts רקמות. רמת הטוהר לאחר המיון הייתה 99%, כלכמת את הניתוח שלאחר המיון (איור 2 א). הערכת אחוז תאים שאינם מזהם פיברובלסטים על ידי הביטוי היחסי של גני בקרת תא ספציפיים (האיור 2B) בדרך כלל מראה זיהום 0.1-0.6%. רמה זו של טוהר מאפשרת יצירת פרופילי transcriptome איכות גבוהה של fibroblasts המבודד ^9.

דיון

בעוד הניסויים שבוצעו בתרביות רקמה יכולים להיות אינפורמטיבי ולהציע עקרונות פונקציונליים כי ניתן מאומת in vivo, ידוע ששינויים גדולים מתרחשים בביטוי גן בתאים בתרבית ^11,12. על מנת להימנע מצעד תרבית רקמה כאשר אפיון ביטוי גנים בfibroblasts, פתחו פרוטוקול המאפשר בידוד של כמו גם פיברובלסטים נורמלים, סרטן הקשורים מעכבר טרי או רקמה אנושית. פרוטוקול זה מיושם בהצלחה ברקמות עור, לבלב ושד מעכבר ואדם ^מ9. בידוד של fibroblasts באמצעות מיון FACS דורש סמן משטח שfibrobl...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב חברה מספר קטלוג תגובות (אופציונלי)
DMEM	Gibco	41965
PBS	תעשיות ביולוגיות	02-023-1A
Collagenase השני	ורטינגטון	LS4176
Collagenase IV	ורטינגטון	LS4188
Deoxyribonuclease	ורטינגטון	LS2007
PharmLyse	BD	555899
מסננת תא 70 מיקרומטר	SPL	93070
המטוהר אנטי עכבר CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
ויה חללית (7AAD)	דואר Bioscience	00-6993-50
אנטי עכבר CD140a-PE (PDGFRa)	דואר Bioscience	12-1401-81
אנטי עכבר F4/80- FITC	Cederlane	CL8940F
DMEM w / o אדומה פנול	Gibco	31053
סוג קולגן אני	BD Biosciences	354236