הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced

Summary

תרומתו של גורם שיפוץ הכרומטין ACF למוות של תאי E4orf4 מושרה נמדדה. הפרוטוקול כולל מבחר של שיבוטים של תאים שבם טיפול דוקסיציקלין גורם מציאה מותנית של ACF יחידות המשנה Acf1 וSNF2h, ולהשתמש של assay DAPI למדוד מות תאים E4orf4 מושרה בשורות התאים מושרות.

Abstract

אינאקטיבציה פונקציונלית של ביטוי גנים בתאי יונקים היא חיונית ללימוד התרומה של חלבון של עניין ^ל1,2 מסלולים השונים. עם זאת, מציאה מותנית של ביטוי גנים נדרשה במקרים שבי מציאה מכוננת אינה נסבלת על ידי תאים לתקופה ארוכה של זמן ^3-5. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנה של שורות תאים המאפשרות מציאה מותנית של יחידות משנה של גורם שיפוץ הכרומטין ACF. שורות תאים אלו יקלו לקבוע את תרומתו של ACF לאינדוקציה של מוות של תאים על ידי E4orf4 חלבון אדנווירוס ^6. רצפי קידוד RNAs מכבנה הקצרה ליחידות משנת Acf1 וSNF2h של גורם שיפוץ הכרומטין ACF היו משובטים ליד אמרגן דוקסיציקלין-מושרה בפלסמיד המכיל גם גן לגן התנגדות נאומיצין. שיבוטים סלולריים neomycin עמידים נבחרו בנוכחות G418 ומבודד. שורות התאים וכתוצאה מכך נגרמות על ידיטיפול דוקסיציקלין, ופעם Acf1 או רמות הביטוי SNF2h הופחתו, התאים היו transfected עם קידוד פלסמיד E4orf4 או וקטור ריק. כדי לאשר את ההשפעה הספציפית של מבני shRNA, רמות חלבון Acf1 או SNF2h שוקמו לרמות WT ידי cotransfection עם פלסמיד Acf1 להביע או SNF2h שניתן היו עמיד לshRNA ידי הקדמה של מוטציות שקטות. היכולת של E4orf4 לגרום למוות של תאים בדגימות השונות נקבעה על ידי assay DAPI, שבתדירות ההופעה של גרעינים עם מורפולוגיות אפופטוטיים באוכלוסיית תאי transfected נמדדה ^7-9.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מנוצל עבור לקבוע את תרומתו הפונקציונלית של חלבונים שונים לאינדוקציה של מוות של תאים על ידי שותפי החלבון שלהם במקרים שבי מציאה מכוננת עשויה להיות תא קטלני.

Protocol

1. דור של שורות תאים מושרים

1. לפני הניסוי אחד צריך למצוא את הריכוז המינימאלי של תרופת G418 שהורג את כל התאים ששמשו לעריכה של שורות התאים רצויות. לצורך כך, צלחת התאים של בחירה בכמה צלחות כפולות ב70% confluency במדיום שישמש במהלך הניסוי ולהוסיף ריכוז גדל והולך של G418 (0-1,000 מיקרוגרם למ"ל). לפקח על התאים היומיים כדי לקבוע את הריכוז המינימאלי G418 שהורג את התאים ביעילות. מוות של תאים נצפה תוך 3-7 ימים.
2. לפני הדור של שורות תאים מומלץ לוודא על ידי מבחני transfection חולפים, שמבטא את פלסמיד shRNA....

Discussion

מציאה של ביטוי גנים ספציפיים היא גישה חשובה לחקירה של התרומה של חלבון למסלולים רגולטוריים. מאז מציאה מכוננת של ביטוי של גנים חיוניים משפיעה לרעה על שגשוג תאים, מחקרם עשוי לדרוש גם הקדמה חולפת של siRNAs או יישום של מערכות מציאה מותנות יציבות. הדור של שורות תאי יציבות עם היכולת לביטוי סמים של shRNAs שתואר כאן, מעניק יתרון על transfections החולף אשר לא יכול להיות יעיל בשורות תאים רבות, ועל השימוש בוירוסים שדורשים הכנה חוזרת ולפעמים נוסף קצר בחירת טווח. שורות התאים, שנוצרו ברגע, לא דו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
גלוקוז DMEM הגבוה	Gibco	41965
ט מערכת FBS המאושר	Clontech	631106
L-גלוטמין	Gibco	25030
פן דלקת	Gibco	15140
0.25% טריפסין-EDTA	Gibco	25200
T-Rex-293 תאים	Invitrogen	R710-07
G418	סיגמא	A1720
blasticidin	Invitרוגן	R210-01
pSuperior.neo + GFP פלסמיד	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	transfection Polyplus	101-40
דוקסיציקלין	סיגמא	D9891
paraformaldehyde	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15710
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	סיגמא	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01