הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

12.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4450

⸱

20 בנובמבר 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Jackson Laboratory

במאמר זה

סיכום

על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.

תקציר

הבנה טובה יותר של מנגנונים המסדירים את הסחר בין קולט הפלזמה ממברנה (PM) והתאים תאיים דורשת גישה ניסויית להחלטות מרחב ובזמן מצוינים. יתר על כן, גישה כזו יש גם יש יכולת להבחין קולטנים מותאמים בצהריים מאלו בתאים תאיים. והכי חשוב, גילוי קולטנים בשלפוחית ​​אחת דורש רגישות גילוי יוצאת דופן, שכן כל שלפוחית ​​נושא רק מספר קטן של קולטנים. גישות סטנדרטיות לבחינת סחר קולט כוללות biotinylation פני שטח בעקבות זיהוי ביוכימי, שאין לו לא את ההחלטות דרושות מרחב ובזמן; ובדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הקולטנים immunolabeled, אשר דורשים קיבוע כימי של תאים ולכן לוקה ברזולוציה הטמפורלית מספיקה 1-6. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו ואחרים פתחנו והעסקנו Stra חדשtegy המאפשר הדמיה של ההחדרה הדינמית של קולטנים לשעה עם רזולוציות מרחב ובזמן מצוינים 7-17. הגישה כוללת תיוג של ה-GFP-pH רגישה, 18 pHluorin superecliptic, לתחום התאי N-המסוף של הקולטנים. Superecliptic pHluorin יש את המאפיין הייחודי של הניאון ב-pH הניטראלי ולא ניאון ב-pH חומצי (pH <6.0). לכן, את הקולטנים המתויגים הם כאשר אנשים שאינם ניאון בתוך לומן חומצי של שלפוחית ​​סחר תאי או תאי endosomal, והם הופכים בקלות דמיינו רק כאשר הם נחשפים לסביבת ה-pH הניטראלית התאית, על פני השטח החיצוניים של ראש הממשלה. האסטרטגיה שלנו וכתוצאה מכך מאפשרת לנו להבחין הקולטנים PM מאלה בתוך שלפוחית ​​סחר תאית. כדי להשיג החלטות מספיק מרחב ובזמן, כמו גם את הרגישות הנדרשת כדי ללמוד סחר דינמי של קולטנים, שהועסקנו כולל פנימי משקףמיקרוסקופיה יון הניאון (TIRFM), שאפשר לנו להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של דימות אופטי (~ 170 ננומטר), ההחלטה הזמנית של מיקרוסקופיה וידאו שיעור (30 מסגרות / שני), ואת הרגישות לגילוי קרינה של ה-GFP אחת מולקולה. על ידי הדמית pHluorin-תויג תחת קולטנים TIRFM, הצליחו ישירות לדמיין אירועי הכנסת קולט בודדים לתוך PM בנוירונים בתרבית. גישת הדמיה זו יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת על כל חלבון קרום בתחום תאי שאפשר לתייג עם pHluorin superecliptic, ותאפשר נתיחה של המנגנונים המפורטים המרכזיים שמנחים החדרה של חלבוני קרום שונים (קולטנים, תעלות יונים, מובילים, וכו ') כדי PM.

פרוטוקול

1. הכנת תרבות גליה מאוסה למיזוג תרבות עצבי

  1. T75 צלוחיות מצופות בפתרון קולגן (01:03 דילול Purecol בDDH 2 O). את הצלוחיות נקבעות זקופות והשאירו לייבוש למשך הלילה בברדס תרבית רקמה.
  2. חיץ דיסקציה (aCSF: 119 mM NaCl, 5 המ"מ KCl, 1 המ"מ MgCl 2, 30 המ"מימ דקסטרוז, 25 HEPES מ"מ, 7.4 pH, ללא סידן) ותקשורת גליה (DMEM בתוספת 10% FBS, 10 יחידות / המ"ל פניצילין, 10 מיקרוגרם / המ"ל סטרפטומיצין, וGlutamax) מוכנים ומאוחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
  3. ביום של תרבות גליה, תקשורת גליה היא חממה במשך לפחות 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני הנתיחה של מוח עכבר. עכברים עובריים או ילוד מורדמים באמצעות עריפת ראש מהירה. cortexes מוחיה הם נתחו את הנתיחה תחת מיקרוסקופ.
  4. רקמות מוח גזור מתעכלות בפתרון פפאין (100 המ"ל פפאין וμl% DNase אני 20 1 בחיץ נתיחת מ"ל 2) על 37 מעלות צלזיוס fo20 דקות r.
  5. בעקבות עיכול פפאין, רקמות מוח נשטפות עם 10 תקשורת גליה מראש חמם מ"ל. תקשורת גליה הטריה (2 מ"ל) נוספה לאחר מכן לרקמות המוח מתעכלת, ואת הרקמות נכתשה עם זכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת.
  6. תקשורת גליה הטריה (8 מ"ל) הוא הוסיף לרקמות ניתקו. תא מסננת 70 מיקרומטר משמש לסינון השעית הרקמה ניתקה. תאים אז נזרע לתוך צלוחיות T75 (בדרך כלל 2-3 עוברים 1 T75 בקבוקון זרע יכול) ולהציב לתוך 37 מעלות צלזיוס תא תרבות חממה.
  7. למחרת, התקשורת מT75 צלוחיות היא aspirated. את הצלוחיות נשטפות עם 10 המ"ל PBS. תקשורת גליה הטריה (10-15 מ"ל) ואז הוא הוסיף לכל בקבוק.
  8. בתוך 10-12 ימים, גליה בT75 צלוחיות צריכה להיות confluent. תאי גליה נשטפים עם PBS, ו5 מ"ל של טריפסין 0.05% נוספים לכל T75 בקבוק.
  9. לאחר הדגרת טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, תאי גליה הם תאי גלייה וניתקו מכל T75 בקבוק נחלקים לשנייםקולגן מצופים T75 צלוחיות שונות.
  10. מחדיר תרבות (Millipore PICM03050) מוכנים על ידי צבת אותם לצלחות 6 היטב, ציפוים בקולגן, וייבוש באוויר-בן הלילה. תקשורת גליה (2 מ"ל כל אחת) ממוקמת מתחת לכל תותב תרבות.
  11. גליה מT75 צלוחיות confluent הם trypsinized וזרע אל מחדיר התרבות (1 T75 בקבוק לצלחת 6 היטב, 2 מ"ל כל הוספה). מחדיר תרבות גליה אלה ישמשו למצב התרבויות העצביות.

2. תרבות עצבית

  1. את coverslips הזכוכית עבור התרבות העצבית מנוקה על ידי שרייה ב70% 3 HNO לפחות לילה. Coverslips מכן שטף עם 2 לפחות 3 פעמים DDH O, ולייבש בתנור Isotemp (> 200 מעלות) למשך הלילה.
  2. coverslips ניקה מונחים בצלחת 6-טובה, אחד לכל coverslip היטב. Coverslips מצופים בפתרון פולי-L-ליזין (2 מ"ל, 0.1% בחומצה בורה 100 מ"מימ, pH = 8.5) בלילה 37 מעלות צלזיוס חממה.
  3. פתרון פולי-L-ליזין הוא להסיר את coverslips וcoverslips נשטפים 3 פעמים עם autoclaved DDH 2 O. Coverslips אז מודגרת ב37 מעלות צלזיוס חממה בלילה בתקשורת ציפוי (Neurobasal להשלים עם סרום 5% חום מומת סוס, 10 יחידות / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 10 מיקרוגרם / מ"ל, Glutamax; 2% B27 תוסף מתווסף למדיום הציפוי ביום בו שימוש).
  4. ביום למחרת, תקשורת הציפוי מוסרת ו2 מ"ל של מדיה ציפוי טריה עם B-27 נוסף לכל גם שיש coverslip זכוכית.
  5. עכברות הרות (E15-18) מורדמות עם CO 2, ועכברים עובריים מורדמים באמצעות עריפת ראש. ההיפוקמפוס או סטריאטום הוא גזור מרקמת המוח ולהציב לתוך צינור חרוטים 15 מ"ל עם חיץ קר כקרח נתיחה, לתרבות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים קוצניים בינוניים striatal, בהתאמה.
  6. רקמות מוח גזור הן ניתקו עם פפאין כמתואר בשלבי 1.4) ו -1.5).
  7. Following דיסוציאציה, מספר התאים בכל השעיה עצבית נספר עם hemocytometer. הנוירונים מכן נזרעו על כל coverslip בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל היטב של צלחת 6-היטב, ותרבית ב37 מעלות צלזיוס חממת הלילה (הנוירונים DIV 0).
  8. כדי להכין מחדיר תרבות גליה למיזוג התרבויות העצביות, תקשורת גליה יוסרה ממחדירה תרבות גליה ובינונית ציפוי טרי מתווספת (2 מ"ל ובהוספת 2 מ"ל מתחת למסגרת).
  9. למחרת (DIV 1), coverslips עם נוירונים ממוקמים מתחת מחדיר תרבות גליה, coverslip אחד בכל טוב.
  10. הנוירונים ניזונים במחצית הנפח של המדיה טריה חומם מראש האכלה (עם B-27) כל 3-4 ימים עד שהם מוכנים לניסויי transfection והדמיה.

3. Transfection

  1. transfection העצבי מתבצע באמצעות Lipofectamine 2000. לכל תרבות העצבית (תרבות אחת לכל coverslip), 2 μlLipofectamine 2000 ומיקרוגרם 1 של ה-DNA משמשים. בינוני Neurobasal טרי עם שום תוסף משמש לדילול Lipofectamine וה-DNA.
  2. ה-DNA וLipofectamine מודגרת למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר לאחר הערבוב.
  3. שמור 1 מ"ל של תקשורת מכל עלון מתחת תרבות גליה, ו1 מ"ל מתוך כל הוספה, ולהעביר את התקשורת לצינור חרוטים. הוסף את אותו הנפח של תקשורת מלבה + B27 למדיום הציל ולדגור על 37 ° C. בינוני זו משמשת לתרבות עצבית בעקבות transfection.
  4. לאחר דגירת 20-דקות Lipofectamine / דנ"א, מחדירה תרבות גליה יוסרו רגעי מהצלחות 6-כן. תערובת Lipofectamine / דנ"א 200 μl מתווספת לכל coverslip עם הנוירונים. מחדיר תרבות גליה מכן חזר לכל באר, מעל לנוירונים. דור של בועות תחת הקרום של מחדירה התרבות יש להימנע. הנוירונים מודגרת עם תערובת Lipofectamine / דנ"א על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות.
  5. לאחר הדואר תקופת 2-4 שעתי דגירה, מוסיפה גליה יוסרה שוב. תקשורת התרבות עם תערובת Lipofectamine / DNA היא תוסר מכל טובה. התקשורת שנשמרה בשלב 3.3) מתווספת לנוירונים (2 מ"ל לטוב). מחדיר תרבות גליה מוחזרים לכל באר, והתקשורת מכל גליה להוסיף מוסרת, ו2 מ"ל של התקשורת מצעד 3.3) הוא הוסיף לכל הוספה.
  6. הנוירונים בתרבית ל24-72 שעות נוספות כדי לאפשר ביטוי של cDNA transfected לפני TIRF ההדמיה מבוצע על הנוירונים האלה.

4. TIRF הדמיה

  1. נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF: 119 mM NaCl, KCl 2.5 מ"מ, גלוקוז 30 מ"מימ, 2 המ"מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 HEPES מ"מ, pH = 7.4) ישמש לניסויים חייה הדמיה. מערכת הדמית TIRF היא מותאם אישית הגדרה עם 100-mW ציאן ליזר לעירור, וחיוב כפל אלקטרוני מצמידי מכשיר מצלמה (EMCCD) לגלאי.
  2. לפני ניסויי הדמיה, aCSF הוא הזהיר ב37 & dלמשל; אמבט מי C לפחות 30 דקות. להוסיף החימום להדמיה חייה ממוקם על במת מיקרוסקופ, ולהוסיף החימום, ליזר, והמצלמה התחממו לפחות 30 דקות לפני תחילת ניסויי ההדמיה.
  3. Coverslip עם הנוירונים transfected הוא כנס לתוך התא חייה ההדמיה. ACSF מראש התחמם הוא ממוקם בתא אחרי התא מורכב; שלב זה אמור להסתיים במהירות אפשרית.
  4. ברגע שהתא ממוקם על הוספת החימום על במת מיקרוסקופ, הנוירונים transfected מזוהים ויזואלית תחת מצב הדמיה עלית ניאון.
  5. לאחר נוירונים בריאים transfected מזוהים (ראה איורים 1 ו 2), אנחנו בדרך כלל לבצע 1 דקות של צילום אקונומיקה כדי לחסל פלואורסצנטי pHluorin קיים מראש על קרום הפלזמה, כמו pHluorin-קולטנים על קרום הפלזמה יש רמות גבוהות מאוד כאשר קרינה TIRF ההדמיה ראשונה התחילה, אשר מפריע להדמיה של תוספות אישיותאירועי ertion.
  6. בעקבות photobleach, הגדרת מכפיל הרווח של האלקטרון במצלמת EMCCD מוגדרת למקסימום, וההקלטה מתבצעת על דקות 1 ב 10 רץ.
  7. כל הקלטה תכיל 600 תמונות. אירועי הכנסה מזוהים בשמם על ידי משחק חזרה ההקלטה באמצעות ImageJ. אירועי החדרה בודדים מנותחים באופן ידני באמצעות ImageJ.

5. נציג תוצאות

התרבות העצבית העקבית היא המפתח לניסויים מוצלחים חייה הדמיה. איור 1 מציג נוירונים ביפוקמפוס עכבר התרבית באמצעות פרוטוקולנו בין 11 ל DIV דיב 18. זה ברור מהתמונות שהנוירונים פתחו תהליכים נרחבים וכי התהליכים דנדריטיים מכוסים בצפיפות עם קוצים הדנדריטים, סימנים שהנוירונים האלה הם בריאים בתרבות. פרוטוקול התרבות שלנו יכול לשמש גם לסוגים אחרים של תאי עצב במוח. לדוגמה, לאחרונה שימוש בפרוטוקול זה לתרבותהנוירונים striatal בינוניים קוצניים במחקר במטרה לבחון הקולטן D2 דופמין (DRD2) כניסה בנוירונים בתרבית עכבר striatal בינוני קוצני 9. איור 2 מראים נוירונים קוצניים בינוניים striatal עכבר תרבית באמצעות פרוטוקולנו בDIV 8. יש לנו גם בצע בהצלחה TIRF הדמיה של DRD2s pHluorin המתויג-superecliptic בסוג זה של תא עצב. איור 3 מציג ביטוי של pHluorin מתויג-DRD2 (pH-DRD2) בנוירון בינוני קוצניים ויזואליזציה של pH-DRD2 כניסה בתא עצב זה.

figure-protocol-1
איור 1. תרבות היפוקמפוס עכבר תוך שימוש בשיטת תרבות הממשק. DIV: ימים במבחנה, ביום של התרבות נחשב DIV 0. מהתמונות ניכר כי נוירונים ביפוקמפוס הבוגרים בסוג זה של התרבות שבין 11 ל 15 DIV DIV. בשעת 11 וDIV 13, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצי filipodia ולא בשלים. בגיל 15 וDIV18, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצים גדולים, אינדיקציה של נוירונים בוגרים יותר. לוחות שמאל:-הגדלה נמוכה תמונות של נוירונים ביפוקמפוס עכבר בגילים שונים. לוחות נכונים: תמונות בהגדלה גדולה (זום על הדנדריטים עצביים של הפנל השמאלי) של תהליכים דנדריטיים עצביים עם קוצים הדנדריטים בגילים שונים.

figure-protocol-2
איור 2. התרבות המאוסה striatal הבינוני הקוצנית נוירון בשיטת תרבות הממשק. הנוירונים שבתמונות הם בDIV 8.

figure-protocol-3
איור 3. נוירון עכבר striatal הבינוני הקוצני transfected עם סופר קולט האקליפטית pHluorin מתויג-דופמין D2 (pH-DRD2). תמונה מהשמאל היא הקרנת עוצמתו מרבית של הקלטת זמן לשגות (600 תמונות, 100 אלפית שני לכל תמונה). ראשי חץ לבנים מצביעים על החדרת שלפוחי בודדה של pH-DRD2. תמונה זו שומרת מידע הכנסה בממד xy אבל מאבדת את המידע בזמן. תמונה מהימין מציגה הקרנת עצמה מרבית yt, שבו מחסנית xyt היא מסובב 90 מעלות סביב ציר y, ופיקסל המקסימאלי בכל שורת ציר x מוקרן על פיקסל בודד ציר y. תמונה זו שומרת מידע החדרה לאורך ציר yt אבל מאבדת את מידע ציר x.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מסיבות שאינן ידועות, הנוירונים עכבר הם תמיד קשים יותר לתרבות מאשר תאי עצב בעכברים. מניסיוננו, תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה עובדת היטב עבור נוירונים עכבר תרבית ראשוניים. עם זאת, תרבות כזו מעורבת אינה מתאימה לניסויי TIRF הדמיה, כמו בסוג זה של נוירונים התרבות והתהליכים שלהם נוטים לגדול על גבי תאי גליה, situating somata העצבי ותהליכים דנדריטיים מעבר להישג ידם של מיקרוסקופיה TIRF. לכן, תרבות עצבית נמוכה יותר בצפיפות עם כמה גליה על coverslip היא אידיאלית עבור TIRF הדמיה. בדקנו לראשונה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי קרני אתחול ממעבדת ג'קסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

פולי-L-ליזין
רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגים תגובות
פתרון קולגן שור מטוהר (Purecol) המתקדם Biomatrix 5005-B
תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) GIBCO 14185-045
פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת) GIBCO 15140-122
פירובט נתרן GIBCO 11360-070
גלוקוז הגבוה DMEM GIBCO 10313-021
סרום שור עוברי (FBS)
GlutaMAX GIBCO 35050-061
פפאין ורטינגטון קורפ יוכימית LS003126
Deoxyribonuclease אני מלבלב שור (DNase) SIGMA DN25-10 מ"ג
של Dulbecco נאגר מלוח (DPBS) GIBCO 14190-144
0.05% טריפסין GIBCO 25300-054
SIGMA P2636-1G
חומצה בורה פישר סיינטיפיק BP 168-500
בינוני Neurobasal GIBCO 21103-049
B-27 תוספת סרום חינם GIBCO 17504-044
סרום סוס חום פעיל GIBCO 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES פישר סיינטיפיק BP310-500
Millipore PICM03050

מקורות

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Plasma Membrane InsertionTotal Internal Reflection Fluorescence MicroscopyReceptor TraffickingDopamine D2 ReceptorSuperecliptic pHluorinVesicle Fusion DetectionLive Cell ImagingNeuronal Culture
הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.