על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבנה טובה יותר של מנגנונים המסדירים את הסחר בין קולט הפלזמה ממברנה (PM) והתאים תאיים דורשת גישה ניסויית להחלטות מרחב ובזמן מצוינים. יתר על כן, גישה כזו יש גם יש יכולת להבחין קולטנים מותאמים בצהריים מאלו בתאים תאיים. והכי חשוב, גילוי קולטנים בשלפוחית אחת דורש רגישות גילוי יוצאת דופן, שכן כל שלפוחית נושא רק מספר קטן של קולטנים. גישות סטנדרטיות לבחינת סחר קולט כוללות biotinylation פני שטח בעקבות זיהוי ביוכימי, שאין לו לא את ההחלטות דרושות מרחב ובזמן; ובדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הקולטנים immunolabeled, אשר דורשים קיבוע כימי של תאים ולכן לוקה ברזולוציה הטמפורלית מספיקה 1-6. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו ואחרים פתחנו והעסקנו Stra חדשtegy המאפשר הדמיה של ההחדרה הדינמית של קולטנים לשעה עם רזולוציות מרחב ובזמן מצוינים 7-17. הגישה כוללת תיוג של ה-GFP-pH רגישה, 18 pHluorin superecliptic, לתחום התאי N-המסוף של הקולטנים. Superecliptic pHluorin יש את המאפיין הייחודי של הניאון ב-pH הניטראלי ולא ניאון ב-pH חומצי (pH <6.0). לכן, את הקולטנים המתויגים הם כאשר אנשים שאינם ניאון בתוך לומן חומצי של שלפוחית סחר תאי או תאי endosomal, והם הופכים בקלות דמיינו רק כאשר הם נחשפים לסביבת ה-pH הניטראלית התאית, על פני השטח החיצוניים של ראש הממשלה. האסטרטגיה שלנו וכתוצאה מכך מאפשרת לנו להבחין הקולטנים PM מאלה בתוך שלפוחית סחר תאית. כדי להשיג החלטות מספיק מרחב ובזמן, כמו גם את הרגישות הנדרשת כדי ללמוד סחר דינמי של קולטנים, שהועסקנו כולל פנימי משקףמיקרוסקופיה יון הניאון (TIRFM), שאפשר לנו להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של דימות אופטי (~ 170 ננומטר), ההחלטה הזמנית של מיקרוסקופיה וידאו שיעור (30 מסגרות / שני), ואת הרגישות לגילוי קרינה של ה-GFP אחת מולקולה. על ידי הדמית pHluorin-תויג תחת קולטנים TIRFM, הצליחו ישירות לדמיין אירועי הכנסת קולט בודדים לתוך PM בנוירונים בתרבית. גישת הדמיה זו יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת על כל חלבון קרום בתחום תאי שאפשר לתייג עם pHluorin superecliptic, ותאפשר נתיחה של המנגנונים המפורטים המרכזיים שמנחים החדרה של חלבוני קרום שונים (קולטנים, תעלות יונים, מובילים, וכו ') כדי PM.
פרוטוקול
1. הכנת תרבות גליה מאוסה למיזוג תרבות עצבי
- T75 צלוחיות מצופות בפתרון קולגן (01:03 דילול Purecol בDDH 2 O). את הצלוחיות נקבעות זקופות והשאירו לייבוש למשך הלילה בברדס תרבית רקמה.
- חיץ דיסקציה (aCSF: 119 mM NaCl, 5 המ"מ KCl, 1 המ"מ MgCl 2, 30 המ"מימ דקסטרוז, 25 HEPES מ"מ, 7.4 pH, ללא סידן) ותקשורת גליה (DMEM בתוספת 10% FBS, 10 יחידות / המ"ל פניצילין, 10 מיקרוגרם / המ"ל סטרפטומיצין, וGlutamax) מוכנים ומאוחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מסיבות שאינן ידועות, הנוירונים עכבר הם תמיד קשים יותר לתרבות מאשר תאי עצב בעכברים. מניסיוננו, תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה עובדת היטב עבור נוירונים עכבר תרבית ראשוניים. עם זאת, תרבות כזו מעורבת אינה מתאימה לניסויי TIRF הדמיה, כמו בסוג זה של נוירונים התרבות והתהליכים שלהם נוטים לגדול על גבי תאי גליה, situating somata העצבי ותהליכים דנדריטיים מעבר להישג ידם של מיקרוסקופיה TIRF. לכן, תרבות עצבית נמוכה יותר בצפיפות עם כמה גליה על coverslip היא אידיאלית עבור TIRF הדמיה. בדקנו לראשונה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי קרני אתחול ממעבדת ג'קסון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
פולי-L-ליזין
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב חברה מספר קטלוגים תגובות | |||
| פתרון קולגן שור מטוהר (Purecol) | המתקדם Biomatrix | 5005-B | |
| תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת) | GIBCO | 15140-122 | |
| פירובט נתרן | GIBCO | 11360-070 | |
| גלוקוז הגבוה DMEM | GIBCO | 10313-021 | |
| סרום שור עוברי (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| פפאין | ורטינגטון קורפ יוכימית | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease אני מלבלב שור (DNase) | SIGMA | DN25-10 מ"ג | |
| של Dulbecco נאגר מלוח (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05% טריפסין | GIBCO | 25300-054 | |
| SIGMA | P2636-1G | ||
| חומצה בורה | פישר סיינטיפיק | BP 168-500 | |
| בינוני Neurobasal | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 תוספת סרום חינם | GIBCO | 17504-044 | |
| סרום סוס חום פעיל | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | פישר סיינטיפיק | BP310-500 | |
| Millipore | PICM03050 |
מקורות
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and syn....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
