מאמר שיטה

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

DOI:

10.3791/50011

⸱

3 בינואר 2013

 ,  , 
1Life Science Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה לעיבוד חומרי פסולת אנושיות חלב כירורגית מתוארת. רקמת מעובד, בצורה של organoids, ניתן לאחסן קפוא ללא הגבלה זמן או להציב בתרבות לצמיחה לטווח ארוך. שיטה זו מאפשרת בדיקה ניסיונית של ביולוגיה של תא נורמלית אנושית אפיתל, ואת ההשפעות של הפרעות חיצוניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה ניסיונית של תא התנהגות נורמלית אנושית חלב אפיתל (HMEC), וכיצד תאים רגילים לרכוש נכסים חריגים, ניתן בהנחייתם של מערכות תרבות במבחנת שמודל מדויק יותר בביולוגית vivo. השימוש בחומר אנושי הנגזר ללימוד התמיינות תאים, הזדקנות, הזדקנות, והנצחה הוא יתרון במיוחד בהתחשב בהבדלים הרבים המולקולריים המשמעותיים בנכסים אלה בין תאי מכרסמי אדם ובדרך כלל מנוצלים 1-2. תאי חלב להציג מערכת מודל נוחה בגלל כמויות גדולות של רקמות נורמליות ולא נורמליות זמינות בשל התדירות מאמופלסטית צמצום וניתוחי כריתת שד.

בלוטת החלב מורכב מתערובת מורכבת של סוגים רבים שונים של תאים,, שומן למשל, אפיתל, mesenchymal, אנדותל. תאי האפיתל הם אחראים לתפקוד החלב המובדל של הנקה,והם גם מקורו של הרוב המכריע של מקרי סרטן שד בנשים. פתחנו שיטות לעיבוד רקמות התעלמות ניתוחית בלוטת חלב למרכיבי אפיתל טהורים כמו גם תאי mesenchymal 3. החומרים מעובדים יכולים להיות מאוחסנים קפוא ללא הגבלה זמן, או באופן יזום לתרבות העיקרית. חומרים שנזרקו כירורגים מועברים למעבדה וידנית גזור להעשרה לרקמות המכילות אפיתל. לאחר עיכול של הרקמה הגזורה באמצעות רצועות חומרי סטרומה hyaluronidase collagenase ומepithelia בקרום המרתף. את החתיכות הקטנות של העץ נובעים אפיתל (organoids) ניתן להפריד stroma עיכול על ידי סינון רציף על קרומים של גודל נקבובי קבוע. בהתאם לגודל נקבובי, שברים ניתן להשיג בהיקף של חתיכות גדולות יותר ductal / מכתשיים, צבירי מכתשיים קטנים יותר, או בתאי סטרומה. אנו צפינו צמיחה מעולה כאשר תרבויות הם יזמו כorganoids לא כדיסתאים בודדים sociated. מיקום של organoids בתרבות באמצעות תקשורת ישכנע מתח נמוך תומך בצמיחה לטווח הארוך של HMEC הנורמלי עם סמנים של סוגי שושלת מרובים (,, מוליד luminal myoepithelial) 4-5. כמות מספקת של תאים ניתן להשיג מרקמות של אדם אחד כדי לאפשר בדיקה ניסיונית נרחבת באמצעות קבוצות סטנדרטיות סלולריות, כמו גם חקירה באמצעות שיטות תפוקה גבוהות.

HMEC התרבותי שהוא מועסק במגוון רחב של מחקרים הבוחנים את התהליכים הרגילים המסדירים את הצמיחה, התמיינות, הזדקנות, והזדקנות, וכיצד תהליכים נורמלים אלו שונו במהלך שינוי האלמותי וממאירים 4-15,16. ההשפעות של גידול בנוכחות של חומר חוץ תאי מטריצה, סוגי תאים אחרים, ו / או תרבות 3D יכולות להיות לעומת צמיחה ב5,15 פלסטיק. HMEC התרבותי, החל בתאים נורמלים, מספק מערכת ניסויית צייתנית לבחון גורמים העשוי להניע או למנוע הזדקנות אנושית וגידולים ממאירים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיבוד רקמות ועיכול

  1. השג רקמת שד אנושית כחומר שנזרק מפרוצדורות כירורגיות. mammoplasties ההפחתה יכולה לספק תאים נורמלים או שפירים; fibroadenomas וgynecomastias לספק תאים שפירים; רקמות כריתת שד אינן סרטניות (היקפי או נגדי לגידול, או תת עורית) לספק תאים שעשויות לנוע בין נורמלי לשפירים לmicrotumors מכיל. ודא אישור IRB תקין קיים לפני קבלת החומר שנזרק. כל החומר צריך להיות מטופלים על פי תקנות פתוגן bloodborne.
  2. חומרי מקום במכלים סטריליים המכילים חיץ או תקשורת (למשל הבינוני של 01:01 Dulbecco השינוי של הנשר והחם F-12 של) בתוספת 100 U / המ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, 5 מיקרוגרם / המ"ל Fungizone, 50U/ml polymyxin B, ו 10% סרום עוברי שור, והובלה למעבדה ב 4 ° C. רקמת ההפחתה מאמופלסטית ניתן לאחסן או נשלחה ב4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי suכדאיויות תא bsequent. חתיכות קטנות של רקמה מאמופלסטית הלא ירידה עשויות לדרוש עיבוד מהיר יותר.
  3. הפרד את אזורי האפיתל ממטריצת סטרומה של רקמת שומן, רקמת חיבור וכלי דם באמצעות שילוב של מלקחיים, אזמל סטרילי ומספרי. חותך חתיכות של רקמות עם מספריים ומניחים בתבנית זכוכית גדולה סטרילי (למשל, 150 מ"מ). עדינות לנתח את אזורי אפיתל, אשר מופיעים כגדילים לבנים המשובצים במטריצת סטרומה המצהיבה, תוך שימוש במלקחיים כדי להחזיק את החומר והאזמל כדי לגרד ממנו את החומר גס השומני. כדי להקל על עיכול, לחתוך את רקמת אפיתל לחתיכות קטנות יותר של 3-4 מ"מ ~ באמצעות אזמלים ומקום מנוגדים למבחנת 50 מ"ל. אם כמויות גדולות של רקמה שנמצאות בעיבוד, להבי אזמל טריים עשויים להיות נחוצים. הסרת חומר שומני מהצלחת לרשות בהתאם לתקנות מוסדיות.
    1. ברקמות כבדות סיביות (למשל, mas תת עוריtectomies עם מחלת fibrocystic חמורה), לא יהיה יותר חומר מוצק לבן, שאינו האפיתל. זה עלול להיות קשה לנתח את תאי האפיתל מסיבי מטריצות כאלה. חתיכות גדולות של חומר סיבי ניתן לחתוך לחתיכות קטנות יותר, כי הם ~ כיכר מ"מ 1-3 באזור ומתעכלים בנפרד.
  4. הנח את רקמת אפיתל גזור לתוך צינור צנטריפוגה חרוטים (50 מ"ל או 15 מ"ל) עם הרקמה הכוללת שלא יעלה על שליש מהנפח של הצינור. להביא את הצינור עד נפח מלא, ומשאיר רק מרחב אוויר קטן, כדי לאפשר ערבוב במהלך סיבוב, תוך שימוש בתערובת עיכול רקמה (DME/F-12 או שווה ערך, אינסולין 10 מיקרוגרם / מ"ל, אנטיביוטיקה כאמורה לעיל, וריכוז סופי של 10 % FCS, collagenase 200 U / ml הגולמי וhyaluronidase 100 U / ml.
  5. צינורות מקום על מסובבי צינורית HulaMixer ולסובב 360 מעלות בלילה 8 סל"ד ב 37 ° C.
  6. צנטריפוגה צינורות ב 600 XG למשך 5 דקות. השלך את השומן והבינוני supernatant להסכם הסילוקing לתקנות מוסדיות.
  7. בדקו להשלמת תהליך עיכול על ידי דילול aliquot קטן של הגלולה במדיום. העיכול יושלם כאשר בדיקה מיקרוסקופית מראה גושים של תאים (organoids) עם מבנים חינם מstroma המצורף (איור 1 א) חלק מופיע-ductal, מכתשיים, או ductal-מכתשיים. רקמות הפחתה מאמופלסטית בדרך כלל עדיין תצגנה stroma המצורף לאחר עיכול לילה ותדרושנה זמן עיכול נוסף.
    1. Resuspend הגלולה מתעכלת חלקי בתערובת טרייה רקמת עיכול ולדגור מחדש עם סיבוב ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4-12 שעות אחרות. חזור על שלבים 1.6 ו -1.7. אם העיכול הוא עדיין לא שלם, שוב להוסיף תערובת עיכול לגלולה ולדגור מחדש עם סיבוב על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הריכוז של אנזימים עשוי להיות מופחת למניעת יתר עיכול בן לילה.
  8. כאשר העיכול יושלם, סרכזת צינורות ב 600 XG למשך 5 דקות, לשאוב לעכליון תערובת, resuspend גלולה במדיום בתוספת אנטיביוטיקה בכ 15 מ"ל ml/50 צינור, צינור 5 ml/15 מ"ל.

2. סינון והקפאה של חומר מתעכל

  1. העברת aliquots של גלולת resuspended גבי מסננת מיקרומטר סטרילי 100 מעל צינור מ"ל סטרילי 50. בואו לטמיון הבינוני לתוך הצינור, ואז לשטוף מחדש את organoids בזמנים מובילים 1-2x עם 2-3 מ"ל של מדיום. חזור על פעולה עד שכל resuspended הגלולה הועברה. אם יש יותר מדי organoids על המסנן והבינוני כבר לא מתנקז בקלות, יש להשתמש במסנן חדש (ות) עבור החומר שנותר. זהירות להעיף את המסנן (הים) על גבי צינור סטרילי ורוחץ את organoids לתוך הצינור עם מדיום יותר. זוהי ברכת organoid מיקרומטר 100.
  2. קח את החומר שמתנקז אל הצינור המקורי המ"ל 50 ולחזור על התהליך של 2.1 באמצעות מסננת מיקרומטר 40, כדי לקבל את ברכת 40 מיקרומטר organoid, המכילה בעיקר מבני מכתשיים. החומר שמתנקז אל הצינור דואר מהווה ברכת התסנין, המכילה גושים בודדים / קטנים של תאי אפיתל mesenchymal וחתיכות קטנות של כלי הדם.
  3. הגלולה של 100 מיקרומטר, 40 מיקרומטר, וברכות תסנין ב 600 XG למשך 5 דקות.
  4. לשאוב supernatant, לשקם כל צינור בעל"ה השנייה (או שווה ערך DME/F-12 עם 44% FCS ו 6% DMSO) באמצעות כ 1 מ"ל של CPMII ל0.1 מ"ל של ארז גלולה. שמור ב 4 ° C.
  5. זרעי מנת מבחן ל2 ברכות organoid ידי הצבת 0.1 מ"ל של חומר resuspended לירידה של 35 מ"מ רקמת תרבות פלסטיק מנה אחרת טיפה כמו ב3.2 להלן. ברכת התסנין ניתן לזרוע ישירות על גבי פלסטיק תרבית רקמה עם מדיום פיברובלסט (DME/F-12 או שווה ערך עם אינסולין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 10% FBS).
  6. Aliquot חומר resuspended שנותר לאמפולות מקפיאה הסוג Nunc (1 מ"ל / 2 אמפולה מ"ל). הקפא לילה ב-80 ° C ולאחר מכן להעביר מייד לאחסון בחנקן נוזלי. יש לנו לא נצפה כל אובדן משמעותי של יכולת קיוםמאוחסן קפוא באמפולות המקורית שלנו מאז 1970 מאוחר.

3. זריעת Organoids ותת תרבויות העיקריות קפוא

  1. מהירות להפשיר אמפולה קפואה המכילה את organoids באמבטית ° C 37 מים. זרעים את organoids לתוך 2 עד 10 (6) בדרך כלל ~ 60 מנות מ"מ, או 1-3 מנות 100 מ"מ, בהתאם להערכה חזותית של מספר organoids באמפולה. organoids כ 20-40 seeded למנת 60 מ"מ הוא אופטימלי.
  2. organoids המופשר מונחים בזהירות, טיפה אחרת טיפה, על משטח הצלחת עם המ"ל פיפטה פיפטה פסטר 1 או לחלוקה שווה של organoids. Organoids הונח סמוך יחד יהיה מקום מוגבל לתולדה, והוליד פחות תאים לתת או הקפאה. הימנע מגרד את פני שטח הצלחת (תאים לא נוטים לגדול משטחים שרוטים אחרונים). חכה 1-2 דקות על מנת לאפשר לorganoids לצרף ולאחר מכן להוסיף את מקור צמיחה לאט כדי להימנע ממוציא את organoids (למשל 2-3 ml/60 מנת מ"מ). אניncubate על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 humidified החממה. אלה הם התרבויות העיקריות. אנו משתמשים כעת M87A + בינוניים אוקסיטוצין (X) לצמיחת HMEC החזקה ביותר (איור 2).
  3. אחרי היום 1, לבדוק שorganoids מחובר. הוסף מדיום נוסף (2-3 המ"מ ml/60 מנה לדוגמה). נדידת תאים מorganoids צריכה להיות גלויה על 24-48 שעות, ותולדה המיטוטי ידי 48-72 שעות לאחר זריעה (האיור 1B, C). לפעמים קובץ מצורף הוא גרוע לאחר 24 שעות, במיוחד אם ציפוי organoids או organoids overdigested מנשים מבוגרות, אבל רוב ההכנות תיצרפנה בתוך 72 שעות. חתיכות קטנות של כלי הדם יכולות לצרף ולהצמיח תולדת תא פיברובלסט (1D איור).
  4. להאכיל תרבויות לפחות 3 פעמים בשבוע. תאים שגודלו בתקשורת M87A סוג לגדול למפגש קרוב בתוך 5-8 ימים, תלויים בצפיפות של זריעה.
  5. אם יש צמיחה משמעותית פיברובלסט, Trypsinization דיפרנציאלי (DT), המבוסס עלניתוק מהיר של fibroblasts מפלסטיק פני השטח, יש צורך להסיר את fibroblasts. כאשר את תיקוני אפיתל הפכו תקשורת גדולה, לשאוב, צלחת לשטוף (לדוגמה, 1-2 ml/60 מנת מ"מ) עם STE (מלוח, טריפסין 0.05%, 0.02% EDTA), aspirate, להוסיף STE מ"ל 0.5 הטרי ולהשאיר בטמפרטורת חדר עבור סביב 1 דקות עם תצפית מיקרוסקופית מתמדת. כאשר fibroblasts לנתק אבל תאי האפיתל הם עדיין חסידים, בעדינות אך באופן חד לדפוק דופן הכלי נגד משטח קשה כדי לסלק את fibroblasts ולאחר מכן לשאוב במהירות. לשטוף פעם עם PBS, ולשאוב שוב. תרבויות מזוהמות בכבדות עם fibroblasts ייתכן DT נוסף.
  6. תת תרבויות עיקריות כאשר תיקוני אפיתל גדולים נמצאים, אבל לפני המפגש. צפיפות הזריעה ומצורפת organoid תשפיע על הזמן הנדרש. כדי לשמר את התרבות והעיקרית ליצירת תרבויות משתיים רבות, יכול להסתפק לאורך זמן, אנו מבצעים Trypsinizations החלקי (PT).
  7. תקשורת לשאוב, לשטוף צלחת בקוטר 60 מ"מימ עם STE 1-2 מ"ל, להוסיף STE טרי מ"ל 0.5 ל צלחת. ציית לניתוק תא מתחת למיקרוסקופ בטמפרטורת חדר במשך 1-5 דקות, עם דפיקות עדינות של המנה לקדם ניתוק תא. Trypsinization יש להפסיק כאשר 50% מהתאים שמנותקים. מוקדם PT בניתוק בדרך כלל יש תאים מהירים. למועד מאוחר יותר נק ', תאים יכולים להיות ממוקמים על 37 מעלות צלזיוס לניתוק מהיר יותר, עם ניטור זהיר, כמו כל התאים עשויים לבוא במהירות.
  8. הוסף 2 מ"ל של מדיה המכילה סרום לצלחת, repipette להתרחץ, ולהעביר לצינור מ"ל סטרילי 15. חזור עם 2x ~ 1-2 מיליליטר תקשורת נוספת, והוסיף לשטוף לצינור. Refeed המנה העיקרית ולחזור לחממה. ספירת התאים בצינור עם haemocytometer. PT בניתן לחזור סביב 4-8 פעמים עם צמיחה מחודשת של תאים טוב במנות העיקריות והצמיחה מקבילה לטווח ארוך משתיים subcultured או קפוא (תאי מעבר 2 נקראים משניים; פעם subcultured, תאים אינם loפריימריס nger). מרגע שהחומר organoid אינו קיים עוד בתרבויות העיקריות, משניים subcultured מראים ירידה בפוטנציאל הכפלת אוכלוסייה בטווח הארוך.
    1. עבור תת תרבות למשנית, תאי זרע ישירות מהצינור לתוך כלים. הזריעה של צלחת 1-2 x 10 5 cells/100 מ"מ במדיום חזק כגון M87A + X תוביל למפגש ב4-7 ימים. אנו מוסיפים רעלן הכולרה למדיום בקטע שני להגדלת פוטנציאל שגשוג; רעל כולרה מושמט בתרבות העיקרית משום שהיא מובילה לתולדת תא רבה שכבתית מorganoids.
    2. להקפאה כמשני, צינור גלולה ב 600 XG למשך 5 דקות, וresuspend בCPMII עם צפיפות סופית של 10 6 תאים / מ"ל. Aliquot resuspended תאים לתוך אמפולות מקפיאה הסוג Nunc, להקפיא לילה ב-80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר מייד לאחסון בחנקן נוזלי.
  10. מומלץ להקפיא תאים מPT 1 למשמרת, ולהשתמש בתאים מPT השני לתת תרבות. PT בנוסף ניתן לאחסן הוקפא לשימוש עתידי.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דמויות מייצגות לרקמות מתעכלות כראוי לorganoids והניחו בתרבות מוצגות באיור 1. הרקמה מתעכלת חלקי תציג חומר עדיין מחובר לחלק החיצוני של מבנים אלה, וסביר להניח שחלק צמיחת תאי fibroblastic בתרבות העיקרית, הדורש DT להסיר. רקמת Overdigested תציג גבולות חיצוניים פחות חלקים, ועלול לקחת זמן רב כדי לצרף בתרבות העיקרית. תולדת אפיתל צריכה להתחיל בתוך 48-72 שעות (1B, C). חתיכות קטנות של כלי דם (1D) יכולות להיות מקור לתולדת התא mesenchymal. אוטופיות צמח אפיתל להראות אוכלוסיות הטרוגניות מורפולוגית, עם אוכלוסיות שגשוג המכילות תערובות של תאים עם סמנים הקשורים ל, מוליד myoepithelial, ושושלות luminal (1E, 3C-E). צמיחה בתקשורת מתח הנמוכה כגון M87A תוספת עם רעל ואוקסיטוצין כולרה תתמוך בטווח הארוך מעולהצמיחה של קיפאון טרום HMEC הנורמלי בהשוואה לניסוחי תקשורת קודמים (איור 2). תקשורת מסוג M87A גם תתמוך בצמיחה של תאי luminal ומולידו במעברים 4-8 (איורי 3C-E, 4); לאחר מכן, רוב התאים להראות סמני שושלת myoepithelial בלבד. HMEC תרבית על פלסטיק יכול לשמור על היכולת שלהם ליצור ארגון עצמי 3D הראוי בmicropatterned 3D microwells, עם תאים פנימיים לתאי myoepithelial (איור 4 א ', ב') luminal, וכדי ליצור מבנים מאורגנים כאשר מצופה בMatrigel (4C, ד).

figure-results-1
איור 1. organoids HMEC והתרבות העיקרית. () Organoid מראה מבנה ductal-מכתשיים לאחר עיכול וסינון. (B, C) Organoids מראה מבנה ductal ומכתשיים 2 ימים לאחר ההשמה בתרבות העיקרית; לציין outgr תא התחילהowth (חצים לבנים). (ד ') כלי דם קטנים מצורפים ומתחיל עם תולדת פיברובלסטים מאותן תרבויות כמו B, C. (ה) תולדת אפיתל תאים מתרבות organoid העיקרית לאחר 4 ימים. שושלות מזוהות ע"י השאירה עם נוגדנים לK14 (אדום) וK19 (ירוק); גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). Luminal (K14-/K19 +, ירוק), myoepithelial (K14 + /-K19, אדום), ואב (K14 + / K19 +, צהובים) תאים גלויים. תאי בתוליים הם נצפו בליבת organoid עקב חדירת נוגדנים שלמות.

figure-results-2
איור 2. Organoids הצמיחה של תרבויות HMEC בניסוחי מדיה שונים. המתקבל מאדם אחד, דגימה 184, היה ביוזמת בתרבות העיקרית באמצעות ניסוחי מדיה שונים. הצמיחה הטובה ביותר לטווח ארוך מתקבלת באמצעות הניסוח האחרון שלנו, M87A + אוקסיטוצין (X) 4. בינוני זה תומך גםצמיחה של שושלות HMEC מרובות (ראה איור. 1E). ניסוח תקשורת מוקדם יותר, 3 מ"מ ספק צמיחה חזקה פחות, ואילו אמצעי תקשורת סרום חינם, MCDB170 (MEGM המסחרי) 17 מוביל לאינדוקציה מהירה של cyclin קינאז מעכב p16 INK4A ובחירה עבור תאי חריגים 7,11,13.

figure-results-3
איור 3. השוואה של גיוון בשושלת organoids חסר תרבות וHMEC התרבותי ב4 במעבר. (A, B) ניתוח FACS של organoid חסר תרבות, enzymatically ניתק ל() ביטוי של EpCAM וCD49f/alpha 6 integrin, ו (ב) CD227/Muc1 וCD10/CALLA. (C, D) ניתוח FACS של 4 בקטע שלפני קיפאון HMEC לביטוי של (C) וEpCAM CD49f/alpha 6 integrin, ו( ד ') CD227/Muc1 וCD10/CALLA. עמ זיהויopulations מתויגים כהלפריקונים (מבטא סמנים luminal EPCAM או CD227), חבר פרלמנט האירופי (מבטא סמנים myoepithelial CD49f או CD10), או PROG (העשיר בCD49f + + EPCAM האוכלוסייה /). שים לב כי במהלך ההסתגלות לתקנת התרבות של שינויי EpCAM וCD49f לעומת organoids תרבות. (ה) לא הממוין HMEC וFACS מועשרים הלפריקונים וחבר פרלמנט אירופי, בשעת 4 בקטע ה מוכתמת לניתוח immunofluorescence של קרטין K14 (MEP סמן) וK19 (LEP מרקר) כדי לאמת את זיהוי שושלת. מוכתם גרעינים עם DAPI נראה כחול.

figure-results-4
איור 4. HMEC המתורבת מסוגל להרכיב מבנים מאורגנים ביחסים עם שושלת vivo דמויים כאשר הניחו microenvironments מתאים. () טרום קיפאון 4 בקטע HMEC היה FACS המועשרn בluminal הלפריקונים ושושלות MEP myoepithelial באמצעות סמנים לCD227 וCD10, עם שושלות אלו אומתו ע"י ביטוי של K14 וK19 (לא מוצג). (ב) כאשר מערבבים יחד בmicropatterned microwells, את התאים בתרבית היו מסוגלים ארגון עצמי לbilayers עם חבר פרלמנט אירופי, בצד החיצוני והפנימי [הלפריקונים שהותאם מנסון ואח'. 5]. הלפריקונים כותרת fluorescently (ירוק) וחבר הפרלמנט אירופי (אדום) היו הדמיה עם confocal מיקרוסקופ ב0 שעות, 24 שעות, 48 שעות ואחרי בנוסף לmicrowells (העליון). בקרת HMEC תויגו באופן שרירותי בתוויות ניאון אדומים או ירוקות (נמוך). (ג) תמונת שדה מוארת של תאי אב FACS מועשרים (cKit +) מצופה בתרבות 3D (Matrigel) וגדל במשך 18 ימים. מבנים וכתוצאה יכולים תערוכת המורפוגנזה מכתשיים. (ד) מבנים הוצאו מMatrigel ומוכתם לזהות K14 וK19; גרעינים היו counterstained עם DAPI. ניתוח Immunofluorescent מראה מבנים מאורגנים עם פולה luminal ובסיס נכונהיושרה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה אנושי רקמת שד העיבוד המוצג כאן מאפשרת קבלת תאי האפיתל חלב טהורים מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים בשד האנושי. סינון הדרך נקבובית של גודל קבוע מאפשר פרדה של שברים שונים של בלוטת החלב (למשל, ductal וductal-מכתשיים לעומת מכתשיים) ממטריצת סטרומה מעוכלת. fibroblasts החלב Isogenic ניתן להשיג כדי שיתאים לתאי האפיתל. חומרים מעוכלים קפוא שמרה כדאיות טובה במשך 30 שנים. שיטה זו עבדה בהצלחה בכל אבל רקמת שד מאוד סיבית, והוא קל לביצוע. וריאציות אחרות של עיבוד רקמת שד קיימות שאינם מספקים שברי האפיתל שנמצאים כבת קיימא, נקיים, או פרודים. מיקום של organoids מעובד בתרבות עם לחץ תקשורתי וישכנע נמוכים כגון M87A מאפשר צמיחה לטווח הארוך של HMEC עם סמני שושלת מרובים. HMEC כי כבר בתרבית על פלסטיק עדיין שומר על יכולת generaמבני te 3D עם נורמלי ביחסי שושלת vivo דמויים. תרבויות HMEC אלו מתאימים לחקירה מקיפה ניסיונית, כולל תפוקה גבוהה, התנהגות HMEC נורמלית וגורמים שעשויים להניע או לעכב הזדקנות ושינוי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAL, JCG, ונתמכת על ידי גברת NIA (R00AG033176 וR01AG040081) ועל ידי מעבדת מחקר ופיתוח בימוי, ארה"ב מחלקת אנרגית החוזה # DE-AC02-05CH11231.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זכוכית צלחת פטרי 15 סנטימטרים VWR 89000-308
מספרי 6.5 " VWR 82027-594
מלקחי 8 " VWR 82027-436
אזמלים חד פעמיים Miltex 4-411
Collagenase SIGMA C0130
Hyaluronidase SIGMA H3506
אינסולין SIGMA I5500
DMSO SIGMA D8418
Pennicillin / סטרפטומיצין חי טכנולוגיות 15140-122
Fungizone חי טכנולוגיות 15290-018
סולפט Polymixin B חי טכנולוגיות 21850-029
סרום שור עוברי חי טכנולוגיות 26140-087
טריפסין 0.05% 100 מ"ל חי טכנולוגיות 25300-054
DMEM/F12 חי טכנולוגיות 11039-021
HulaMixer חי טכנולוגיות 159-20D
100 מיקרומטר מסננת התא BD פלקון 352360
40 מיקרומטר מסננת התא BD פלקון 352340
צינורות 15 מ"ל גריינר ביו 1 188-261
צינורות 50 מ"ל גריינר ביו 1 227-261
מנות TC 10 סנטימטרים גריינר ביו 1 664-160
מנות TC 6 סנטימטר גריינר ביו 1 628-160
בקבוקוני קריוגני Nalgene 5000-1020
Heamocytometer אוזר מדעי 1490
סרכזת אפנדורף מודל 5702

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prowse, K. R., Greider, C. W. Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).
  2. Gil, J., Peters, G. Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).
  3. Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture. In Vitro. 16, 415-425 (1980).
  4. Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells. Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).
  5. Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).
  6. Stampfer, M. R., Bartley, J. C. Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).
  7. Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation. Oncogene. 17, 199-205 (1998).
  8. Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion. Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).
  9. Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines. Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).
  10. Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -L., Ljung, B. -M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. In situ analysis of genome instability in breast cancer. Nat Gene. 36, 984-988 (2004).
  11. Li, Y., Pan, J., Li, J. -L., Lee, J. -H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized. Mol. Cancer. 6, (2007).
  12. Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis. Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).
  13. Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization. Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).
  14. Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs. Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).
  15. LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).
  16. Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia. Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).
  17. Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים