$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
איברים פנימיים כגון לב, מוח, מעיים ולפתח סימטריות שמאל ימין (LR) כי הם קריטיים עבור הפונקציות הרגילות שלהם 1. ריסים ניעתי מעורבים בהקמת LR אסימטריה בעוברי החולייתנים, כוללים עכבר, צפרדע, ודג זברה 2-6. "הריסים" הללו LR לייצר זרימת נוזל סימטרית שיש צורך לעורר סימטרי קטרי משומר (TGF-β superfamily) איתות מפל במזודרם צלחת הרוחב מהשמאל, שהוא חשב לספק מידע דפוסי LR לפיתוח איברים 7. לכן, כדי להבין את המנגנונים בבסיס דפוסי LR, זה חיוני לזיהוי גנים ששולטים בארגון של תאי ריסי LR, תנועתיות ואורך ריסי LR והיכולת שלהם לייצר תזרים חזק סימטרי.
בעובר דג הזברה, ריסי LR נמצאים בשלפוחית של Kupffer (KV) 2,4,5. KV מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל monociliatedשמצרפים לום מלא נוזל. מיפוי הגורל הראה כי KV נגזר מקבוצה של 20-30 ~ תאים המכונית תאי גב Forerunner (DFCs) שנודדים בשולי blastoderm הגבו במהלך שלבי epiboly 8,9. במהלך השלבים מוקדמים somite, אשכול DFCs ולהתמיין לתאי אפיתל ריסים כדי ליצור KV בtailbud של העובר 10,11. היכולת לזהות ולעקוב אחר DFCs-בשילוב עם שקיפות אופטית והתפתחות מהירה של עובר דג זברת דג הזברה KV-להפוך את מערכת מודל מצוינת ללמוד תאי ריסי LR.
מעניין, אבות של המשפחה של תאי DFC / KV לשמור גשרי cytoplasmic בין תא החלמון עד 4 לאחר הפרית שעה (hpf), ואילו גשרי cytoplasmic בין תא החלמון והתאים עובריים אחרים הקרוב לאחר 2 hpf 8. ניצול של גשרי cytoplasmic אלה, פתחו אסטרטגית הזרקת שלב ספציפית, כדי לספק morpholino oligonucleotides (MO) באופן בלעדי לDFCs ומציאת הפונקציה של גן מטרה בתאים 12 אלה. טכניקה זו יוצרת עוברי chimeric שבתפקוד הגן הוא הפיל אותי בשושלת DFC / KV פיתוח בהקשר של עובר פראי מסוג. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV, אנחנו מזריקים microbeads ניאון לKV הלום ותנועת חרוז שיא באמצעות videomicroscopy 2. זרימת נוזל בקלות ודמיין ניתן לכמת על ידי מעקב עקירת חרוז לאורך זמן.
הנה, באמצעות טכניקת במה הספציפית DFC ממוקד מציאת הגן וההזרקה של microbeads ניאון לKV לדמיין זרימה, אנו מציגים פרוטוקול המספק גישה יעילה כדי לאפיין את תפקידו של גן מסוים בזמן ההתפתחות ותפקוד KV.