בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

סיכום

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם במוח Plasmodium berghei עכברי אנקה נגוע מתוארים. השיטה מאפשרת כימות, כמו גם אפיון הפנוטיפי של לויקוציטים הבודד לאחר ההכתמה עם נוגדני ניאון וניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.

תקציר

אנו מתארים שיטה לבידוד ואפיון של תאי דלקת חסיד מכלי דם במוח של פ עכברי berghei אנקה נגוע. זיהום של-זני עכברים רגישים עם תוצאות מתח טפיל זה באינדוקציה של קדחת מוח ניסיונית, תסמונת נוירולוגית שחוזר על היבטים חשובים מסוימים של מלריה חמורה Plasmodium falciparum בתיווך ^ב1,2 בני האדם. צורות בוגרות של מלריה בדם שלב לבטא חלבונים טפילים על פני השטח של כדורי האדום הנגוע, המאפשר להם להיקשר לתאי האנדותל של כלי דם. תהליך זה גורם לחסימות בזרימת דם, וכתוצאה מהיפוקסיה ושטפי דם ³ וגם ממגר את הגיוס של לויקוציטים הדלקתי לאתר של קיבוע טפיל.

בניגוד לזיהומים אחרים, וירוסים כלומר neutrotopic ^4-6, שני תאי המלריה parasitized דם האדומים (pRBC), כמו גם הקשור inflammleukocytes atory יישאר מוחרם בתוך כלי דם ולא מסתנן parenchyma המוח. לפיכך, כדי למנוע זיהום של לויקוציטים המוחרם עם תאים שאינם דלקתיים במחזור, זלוף intracardial הנרחב של עכברים נגועים לפני חילוץ איברים ועיבוד רקמות נדרש בהליך זה כדי להסיר את תא הדם. לאחר זלוף, המוח נקצר ומבותר לחתיכות קטנות. מבנה הרקמה שבש עוד יותר על ידי טיפול האנזימטית עם collagenase D וDNAse I. אז homogenate המוח וכתוצאה הוא centrifuged בשיפוע Percoll המאפשר פרדה של לויקוציטים מוח המוחרם (מנהלת ליגה) מהמיאלין ופסולת רקמות אחרות. תאים מבודדים אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer ומוכתם עם נוגדני ניאון לניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.

הליך זה מאפשר אפיון הפנוטיפי מקיף של לויקוציטים הדלקתי נודד למוח מחדשsponse לגירויים שונים, כולל שבץ, כמו גם זיהומים נגיפיים או טפילים. השיטה מספקת גם כלי שימושי להערכת טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים.

פרוטוקול

1. זיהום של עכברים עם פ berghei-אנקה

1. להפשיר aliquot של פ cryopreserved berghei האנקה pRBC.
2. לרסן עכבר מוחות מלריה עמיד BALB / ג תורם (8-12 שבועות בן) באמצעות טכניקת האיפוק בשתי ידות. הזרק עכבר עם 100-200 μl של pRBC שימוש במזרק אינסולין מ"ל 1 (28g מחט). באופן שגרתי, 1-2 עכברים תורמים מוזרקים.
3. בימים שלאחר הזיהום 4-5 (פאי) להסיר עכבר תורם מכלוב והנח אותו על תחנת עבודה או משטח עבודה פנויה.
4. עדינות לרסן את העכבר עד סוף הזנב ובאמצעות מספריים קטנים לחתוך את קצה הזנב (כ 1 מ"מ). לחלופין, לנקב זנב קטן באמצעות מחט 25 G יכול להתבצע.
5. הנח טיפת הדם מוריד הזנב של העכבר הקרוב לסוף שקופית מיקרוסקופ המעומם סוף.
6. הנח שקופית שנייה (מפזר) בזווית של 45 °, ולגבות אותו לטיפה של דם. ברגע שהדם מתפשט לאורך הקצה, לדחוף את המפזר-שקופית הערבnly פני שקופית מיקרוסקופ כדי להפוך את הכתם של הדם. אפשר למרוח לייבוש באוויר.
7. תקן את כתמי דם במתנול 100% למשך 30 שניות ולאחר מכן כתם שקופיות בGiemsa המוכן טרי למשך 10 דקות.
8. יש לשטוף את כתם דם במים זורמים במשך דקות 1, לאפשר לאוויר יבש ולבחון שקופיות מתחת למיקרוסקופ (100x, טבילת שמן). למנות pRBC בתוך 1000 אריתרוציטים ולחשב parasitemia אחוזים. עכברים תורמים צריכים להגיע לרמות parasitemia בין 2.5-5% לפני שניתן יהיו דממו הם לזיהום של חיות ניסוי.
9. איסוף דם מעכבר התורם על ידי דימום רטרו מסלולית באמצעות צינור נימי מייקר המטוקריט heparinized. כל הניסויים מבוצעים בעמידה בדרישות וולטר ואלייזה הול המכון בבעלי חי ועדת האתיקה. בהתאם לדרישות ועדת אתיקת בעלי חיים מקומיות נהלי דימום אחרים עשויים להיות בשימוש. להמס כמות הנדרשת של דם במדיום RPMI בריכוז סופי של 1x10 ⁶ pRBC/0.2 מ"ל. תחשוב על זההמטוקריט עכבר רגיל הוא ~ 6x10 ⁹ תאי דם אדומים / מ"ל 1.
10. להדביק C57BL ניסיוני / 6 עכברים (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneally (IP) מיליליטר 1x10 ⁶ pRBC/0.2.
11. כדי לעקוב אחר רמות parasitemia של עכברים נגועים בצע את השלבים 1.3-1.8. Parasitemia צריך להיות נחוש כל 2-3 ימים מתחיל ביום 2 או 3 pi
12. התפרצות של מלריה חמורה בC57BL / 6 עכברים עלולים להתבטא במראה כפוף, ruffed פרווה ופעילות נמוכה. עכברים מסוימים עשויים להתאושש בשלב זה, אך התקדמות לאובדן של רפלקס ליישר עצמי מצביעה על מחלה בלתי הפיכה ובעלי החיים חייבים להיות מורדמים.

2. זלוף Intracardial של עכברים ומיצוי המוח

1. להרכיב מערכת זלוף הכביד ידנית על ידי הבטחת מאגר 500 מ"ל לבעל טור המחובר לחלקו העליון של מעמד עמודה 60 סנטימטרים. חבר צינור פלסטיק לקצה התחתון של המאגר ולאבטח מהדק צינורות לשלוט בזרימת חיץ. צרף צינורית למחט 23 G. Fill את המאגר עם PBS (החזיק ב22 מעלות צלזיוס), פתח לצבוט ולאפשר חיץ לרוץ דרך הצינורות כדי להסיר את כל בועות האוויר.
2. להרדים פ עכבר berghei אנקה נגועה על ידי ₂ משאיפת CO. לאשר את המוות בהעדר הדוושה, מסלולית ותגובות בדרכי נשימה.
3. הצמד עכבר להרדים על ידי כפות האחוריות וקדמיות dorsally על קרש חיתוך קלקר הכלול במגש פלסטיק. בהתאם להרדמה מקומית Animal אתיקת ועדת דרישות יכולים להינתן בתחילה מוקדמת של pefusion intracardial.
4. נגב צד הגחוני עם אתנול 70%.
5. השתמש במספריים ומלקחיים גדולים כדי לפתוח עור לאורך קו האמצע על מנת לחשוף את חלל בית החזה. עור לקפל ולהדק את הצדדים.
6. החזק את עצם החזה עם מלקחיים עדינים ולחתוך את הסרעפת ולאורך שני צידי עצם חזה ניתוק הצלעות. הקפד שלא לפגוע בשום כלי דם גדולים.
7. להצמיד לצלעות בחזה באופן רופף לצד הראש.
8. החזק שנינות חדרי לבמלקחי h דקים ועלייה ימנית בזהירות חתוך במספריים עדינים.
9. הכנס מחט 23 ז המחובר למערכת זלוף הכביד לתוך חדר שמאלי לכיוון אב העורקים עולה תוך PBS פועל. הכנס רק 0.5 סנטימטר של קצה המחט.
10. תנקב את העכבר למשך 5 דקות או עד ששפכים הוא ברור.
11. עכבר הסר ולהניח אותה על הבטן שלה. נגב את הראש עם אתנול 70%.
12. בעזרת מספריים גדולים, עושה חתך מעל לאזור חוט השדרה הצווארי.
13. השתמש במספריים מצוינים לעשות חתך החציוני זנב-מקורי מתחיל בבסיס הגולגולת ולקלף את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
14. מחזיק את הראש, הנח את הלהבים של מספריים קטנים לתוך כל חלל מסלולית ולעשות חתך בין המסלולים.
15. לעשות חתך אורכים לאורך תפר sagittal ומקלף בזהירות את הגולגולת באונה כל מוח כלפי חוץ.
16. בעזרת מרית, בעדינות להרים את המוח ולמקם אותו לתוך צינור צנטריפוגה 10 מ"ל המכיל בינוני RPMI.

3. בידוד של מוח Leukocytes-מוחרם (מנהלת ליגה)

1. עבודה בקבינט ביטחון, מקום שנקטף מוח טרי על גבי מסננת נירוסטת תא (40-60 גודל רשת) בצלחת פטרי המכילה 3-5 מ"ל של מדיום תרבות רקמות RPMI.
2. חיתוך ברקמת מוח לחתיכות קטנות.
3. לדחוף חתיכות קטנות של רקמת מוח דרך מסננת התא באמצעות בוכנת גביש.
4. העברת homogenate המוח לשפופרת 10 מ"ל וצנטריפוגה XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
5. ממס גלול ב 3 מ"ל של מדיום RPMI, המכיל 0.05% collagenase D ו2U/ml DNAse I.
6. סובב תערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. להסיר שאריות של תאים על ידי דחיפת התערובת באמצעות מסננת 70 מיקרומטר ניילון תא ו / או על ידי דוגר על קרח למשך 5 דקות.
7. שכב homogenate מוח על 30% מיליליטר כרית 7 Percoll וצנטריפוגה XG ב 400 (ללא ברקסים) למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
8. Resuspend גלול ב 1 מ"ל של חיץ תאי דם האדום תמוגה ולדגור על קרח למשך 5 דקות כדיlyse pRBC חסיד, שלא ניתן להסירו מהמוח על ידי זלוף intracardial.
9. הוסף 9 מ"ל של מדיום RPMI, לשטוף תאים וצנטריפוגות XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
10. מנהלת הליגה resuspend המכיל גלולה ב50-100 μl של מדיום RPMI ותאים להעברת צינור אפנדורף.
11. מדולל aliquot 5-10 μl של מדגם התא 01:02 בTrypan כחול לזיהוי של תאי קיימא.
12. ספירת תאי קיימא תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. מגיל 6 ואילך pi יום, כאשר פ עכברי berghei אנקה נגועה להציג סימנים נוירולוגיים, 20,000-100,000 BSLs ניתן לשחזר.

4. Immunophenotyping של מנהלת ליגה על ידי cytometry זרימה הססגונית

1. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C, לשאוב supernatant ו resuspend גלול ב 50 μl של חיץ מכתים (PBS, 1% עוברי עגל בסרום (FCS), 2 המ"מ EDTA).
2. הוסף μl 1 מתוך מטוהר anti-CD16/32 נוגדן (Fcblock).
3. דגירת תאים עבור 10 דקות על קרח.
4. שטוף תאים עם 1 מ"ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant.
5. תאי resuspend ב 50 μl של הכתמת המאגר המכיל דילולים שנקבעו מראש אופטימליים של נוגדני ניאון הנדרשים, CD4 נגד כלומר, אנטי CD8, אנטי TCR ואנטי NK1.1.
6. דגירה במשך שעה 1 על קרח.
7. שטוף תאים עם 1 מ"ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant.
8. Resuspend תאים ב100 μl של PBS.
9. העברת תאים לצינור פלסטיק cytometry זרימה.
10. שימוש cytometer זרימה, לרכוש לפחות 5,000-10,000 אירועים. פקדים מתאימים בתוליים תאים ודגימות פיצויי fluorochrome צריכים להיכלל כנדרשים.
11. לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת cytometry זרימה מתאימה.

תוצאות

התוצאות באיור. 2 אחוזים מהופעות ולמספרים מוחלטים של אוכלוסיות שונות מנהלות התאוששו ממוחם של עכברי perfused או unperfused בקרה נגועה מלריה, ונאיביים. מנהלת הליגה מבודדת הוכתמה PE-אנטי NK1.1 ונוגדני APC-אנטי TCR-β כפי שצוינה בפרוטוקול הטקסט. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים ^7-9, αβTCR ⁺ תאי T מורכב שיעור גבוה של ברכת מנהלת הליגה במוחם של עכברים נגועים במלרית perfused (היום 6 פאי). אוכלוסייה זו שנראית באופן משמעותי ייצוג במוחם של בעלי חיים שאינם perfused (איור 2A-...

דיון

הבידוד והאנליזה של מנהלת הליגה הוא שיטה המאפשרת אפיון וכימות של תאים דלקתיים הנודדים למוח בתגובה לפגיעה ברקמות או זיהום במודלים של עכברי ניסוי. ההקדמה של צעד זלוף intracardial להסרת תא הדם לפני חילוץ איברים ובידוד התא הבא היא שימושית כדי למנוע זיהום של תאים דלקתיים עם לויקוציטים במחזור שאינו דלקתי. זה לא יכול להיות דרישה הכרחית בזיהומי neurotropic כגון וירוס Encephalomyelitis עכברי שבתאים דלקתיים לחדור למוח parenchyma ^5, אך רלוונטי במיוחד במלרית מכרסם, בי אריתרוציטים נג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
			פתרונות וחוצצים
הפתרון של Giemsa Azur eosin תילן הכחול	מרק Millipore	1.09204.0500	דילול 1:10 במים מזוקקים
RPMI בינוני			העכבר tonicity
עכבר tonicity PBS			פוספט 20 מ"מ נתרן, 0.149 NaCl, 7.3 pH
0.4% Trypan הכחול	סיגמה אולדריץ	T-8154	01:02 דילול
Collagenase D	ורטינגטון יוכימית
Deoxyribonuclease (DNAse) אני	סיגמה אולדריץ	D4263-5VL	מלבלב שור
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% בפתרון PBS
Ultrapure טריס	Invitrogen	15505-020
כלוריד אמוניום (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
מאגר תמוגה תא אדום			17 המ"מ טריס, 4 Cl 14nM NH, 7.2 pH
FCS	Gibco	1009
EDTA disodium מלח	מרק	10093.5V	0.1M, 7.2 pH
			נוגדנים וconjugates
אנטי עכבר CD16/CD32 (FC בלוק), השיבוט 2.4G2	BD Pharmingen	553142	μl 1 בחיץ מכתים 50 μl (0.5mg/50 מ"ל)
CD4 FITC-אנטי עכבר, השיבוט H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-אנטי עכבר NK1.1, PK136 שיבוט	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-אנטי עכבר CD8, 53-6-7 שיבוט	BD Pharmingen	551162
APC-אנטי עכבר TCR-β, שיבוט H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-אנטי עכבר CXCR3, 220803 שיבוט	מו"פ מערכות	FAB1685P
Biotinylated-אנטי עכבר CCR5, שיבוט C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			ציוד וחומרים
שקופית מיקרוסקופ SuperFrost	Lomb Menzel-גלזר
מלקחי נתיחה, מספריים	רידא Instrumente
500 מ"ל PBS מאגר	Nalgene
צינור גומי
מחט 23 ז	BD PrecisionGlide	302008
תא דיסוציאציה ערכה המכילה מתכת מסננת	סיגמה אולדריץ	תקליטור-1
מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר	BD פלקון	352350
Hemocytometer	GmbH נויבאואר	717810
צינורות זרימה cytometry	Bד פלקון	352008