מאמר שיטה

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

DOI:

10.3791/50113

⸱

29 בספטמבר 2013

 , 
1Department of Biology, Temple University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גודל מצמד גדול והתפתחות חיצונית של עוברים שקופים אופטי להפוך את דג הזברה מערכת מודל חוליות יוצאת דופן עבור mutagenesis insertional in vivo באמצעות כתבי ניאון לתייג ביטוי של גנים שעברו מוטציה. מספר מעבדות שנבנו ונבדקו וקטורים משפר וגן המלכודת בדג זברה, באמצעות חלבוני ניאון, מפעילי תעתיק מבוסס LexA Gal4-וככתבי 1-7. היו לי וקטורים אלו שני חסרונות פוטנציאליים: ההחמרה הכי מוצלח (למשל חוסר היכולת להבחין בין אירועים משפר וגן המלכודת) והמוטגניות נמוכה (למשל אינטגרציות לגנים לעתים נדירות המיוצרים אללים null). גן Breaking transposon (GBTs) פותחו כדי לטפל בחסרונות הללו 8-10. יש לנו שונה אחד מוקטורי GBT הראשונים, GBT-R15, לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב הראשי של מלכודת גן וכטב"מ הוסיף: eGFP ככתב המשני לגילוי ישיר של אירועי מלכודת הגן.pplication של Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני מספק שני יתרונות עיקריים. ראשית, היא מגבירה את הרגישות לגנים לידי ביטוי ברמות ביטוי נמוכים. שנית, היא מאפשרת לחוקרים להשתמש בקווי מלכודת גן כמו נהגי Gal4 לביטוי ישיר של transgenes האחר ברקמות ספציפיות מאוד. זה רלוונטי במיוחד לגנים עם פונקציות שאינן חיוניות או מיותר, שבו האינטגרציה מלכודת גן עשויה שלא לגרום לפנוטיפים גלויים. החסרון של שימוש Gal4-VP16 ככתב מלכודת הגן העיקרי הוא שהגנים מקודדים לחלבונים עם רצפי אות N-מסוף אינם ניתנים להשמנה, כמו חלבוני היתוך Gal4-VP16 וכתוצאה מכך צפויים להיות מסוגלת להיכנס לגרעין ולהפעיל שעתוק. חשוב מכך, השימוש בGal4-VP16 לא מראש לבחור עבור חלבונים גרעיניים: אנו התאוששו מוטציות מלכודת גן בגני מקודדי חלבונים המתפקדים בגרעין, ציטופלסמה ואת קרום הפלזמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mutagenesis insertional הוכיח להיות גישה רבת עוצמה כדי לנתח תפקוד גן במערכות מודל שונים מיצורים חד תאיים כמו חיידקים ושמרים ליצורים רב תאיים כגון עכברים וצמחים. כל ה-DNA אקסוגני (וירוס, transposon או פלסמיד) עשוי לשמש mutagen ידי לקטוע מרכיבים חיוניים של גנים כגון אקסונים או יזמים. היעד האפקטיבי של גישות פשוטות כזו הוא קטן ביותר בגנום גדול ומורכב, שכן אקסונים מהווים רק 1-3% מהגנום חוליות טיפוסיים. גודל היעד אפקטיבי קטן ניתן להתגבר על ידי שיעורי אינטגרציה גבוהה מאוד וקטורית, כפי שהודגם על ידי ההצלחה האדירה של mutagenesis insertional רטרווירלי ב11,12 דג הזברה. לעומת זאת, אינטרונים מהווים כ 20-30% מהגנום חוליות. בדג זברה, וקטורי mutagenesis insertional מבוסס transposon אשר למעשה להציג null או מוטציות hypomorphic חמורות על השתלבות אינטרונים כבר בשם "transposo גן השבירהNS "(GBTs) 8-10. לאינטגרצית מלכודת גן יעילה, הם משתמשים transposon Tol2 מינימאלי 13,14. Mutagenicity של GBTs מסתמך על acceptor אחוי המופק מדג ורצפי הסיום / polyadenylation תעתיק. האלמנטים אחראים להמוטגניות GBT נמצאים לצד על ידי אתרי loxP ישירים לכריתה על ידי recombinase Cre. לכן, הזרקה של Cre mRNA מובילה להחזרה יעילה של מוטציות הנגרמות GBT, למרות שכמה רצפי transposon יישארו במוקד האינטגרציה 9,10.

וקטורי GBT פורסמו לאחרונה להשתמש mRFP כ9,10 כתב מלכודת הגן, מה שמוביל לשני חסרונות פוטנציאליים. ראשית, זה לא ידוע מה חלק של הגנים דג הזברה באים לידי ביטוי ברמה מספיק גבוהה כדי להיות מזוהה על ידי חלבוני היתוך כתב ניאון ישירים. שנית, קבוצה קטנה בלבד של גנים צפויים להיות להם פונקציות חיוניות. הערכה הוא שיש רק 1,400-2,400 הגנים דרושים developme דג הזברהNT 15,16. רוב מוטציות מלכודת הגן אינן צפויות להציג פנוטיפים גלויים ולכן תהיה בעלת תועלת מוגבלת. כדי להתגבר על שתי המגבלות האלה, יש לנו שונה GBT-R15 9,10 לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני (Balciuniene et al. בהכנה). כמו באוגוסט פחות mRFP בGBT-R15, אתר תחילת התרגום הוסר מGal4-VP16. לגילוי ישיר של אירועי מלכודת גנים, הווקטורים שלנו מכילים כתב eGFP תחת שליטתו של 14x Gal4 כטב"מ 17,18.

כמה תכונות נוספות מתוכננות לוקטור מלכודת גן bipartite שלנו. כטב"מ: קלטת eGFP הוא מוקף אתרים ישירים FRT (דרגות אפורות באיור 1). הזרקה של FLP recombinase mRNA מובילה לכריתה של כטב"מ: קלטת eGFP, עוזבת את המוטציה מלכודת גן סימן וזכרה לקרינה eGFP. זה לאחר מכן ניתן להשתמש בקווים מהונדסים שיסמנו רקמות ספציפיות או אירועים התפתחותיים על ידי הקרינה ה-GFP. כמו באחריםGBTs, כל קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים ישירים loxP (מחומשים פתוחים באיור 1). זה עושה את אירועי מלכודת הגן הפיכים על ידי ביטוי של recombinase Cre, קלות הקמת הוכחת יחסי סיבתיות בין אינטגרציה מלכודת גן ספציפית וציין פנוטיפ (איור 2). לבסוף, את קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים הפוכים I-SCEI meganuclease (משולשים שחורים באיור 1). בדרוזופילה, אינטגרציות transposon נהוגות להמיר למחיקות (ליקויים) על ידי כריתה מדויקת של אלמנט P. אין ראיות לכך שכריתה של transposon Tol2 (או כל transposon אחר הפועל בבעלים חוליות כגון יפהפה נרדמת, PiggyBac או AC / DS) יכולה להוביל למחיקות. לפיכך, אנו כללנו אתרי I-SCEI כשיטה פונדקאית פוטנציאלית לגיוס של מחיקות, למרות שאין כל הוכחה שאני-SCEI יכול לגרום למחיקות בדג זברה. יש לציין כי בעוד שמגה I-SCEInuclease ניתן להשתמש כדי להקל על transgenesis בדג זברה, מחשוף ה-DNA על ידי meganuclease I-SCEI משמש ללמוד מנגנוני תיקון DNA, כוללים מועדת לטעויות שאינן הומולוגיים סוף להצטרף, בשמרים ובתאי יונקים 19-22.

שילוב של וקטור מלכודת הגן שלנו יכול להוביל לביטוי eGFP ידי שני מנגנונים שונים. הראשון הוא אירוע מלכודת גן אמיתי (איור 1 ג): הווקטור משתלב גן (IMG לInsertionally מוטציה גנטי), תמליל היתוך בין 5 'לפרוטוקול IMG אנדוגני וGal4-VP16 הוא עשה ותורגם ל חלבון היתוך המכיל N-הסופית של החלבון מקודד על ידי IMG וGal4-VP16. חלבון היתוך זה נקשר ל14x כטב"מ ומפעיל שעתוק של eGFP. האירוע השני, פחות הרצוי הוא מלכודת משפר (1D איור): האמרגן המינימלי מול eGFP נופל תחת שליטתו של משפר סמוך לאתר האינטגרציה, מה שמוביל לייצור של eGFP בabהיגיון של ייצור Gal4-VP16. להערכתנו, 30-50% מאירועי ביטוי eGFP הן בשל מלכודת משפר ו50-70% הם תוצאה של מלכודת גן 23 (Balciuniene et al. בהכנה). כדי להבחין בין שני סוגים של אירועים אלה, עשינו 14xUAS: קו מהונדס mRFP (איור 1), לנוחיות בסימן γCry עדשה ספציפית: (. Balciuniene ואח' בהכנה) ה-GFP. אירועי מלכודת הגן מאומתים על ידי שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP (השווה C ו-D באיור 2).

במסך הטייס שלנו, התאוששו מעל 40 אירועי מלכודת גן לאחר הקרנת 270 דגי F0 הוזרקו תערובת של דנ"א transposon וmRNA transposase. שתיים מאינטגרציות מלכודת הגן שלנו התרחשו בגנים עם מוטציות כימית המושרה שפורסמו בעבר: NSF וFLR. פנוטיפים של tpl6 מוטציות insertional NSF וtpl24 FLR הם נבדלים באופן שטחי מפנוטיפים של מוטציות כימית המושרה המקבילות. אנחנו גם ציינו כי אירועי מלכודת הגן יופיעו עם נטייה לאינטרונים ליד הקצה '5 של גנים, ובכך להגדיל את ההסתברות של אללים null. אנחנו עדיין צופים מידה מסוימת של השתקת כטב"מ (ססגון) בכל קווי מלכודת הגן שלנו, וכמה לוקוסים הם באופן ברור יותר רגישים ססגון יותר מאחרים. אנחנו לא מאמינים שהשתקת כטב"מ היא בעיה משמעותית עבור התפשטות של קווי מלכודת הגן, כפי שהצלחנו להפיץ את כל קווי מלכודת הגן שלנו בקלות דרך לפחות חמישה דורות על ידי בחירה לביטוי של GFP לבד.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור של דור F0 ידי Microinjection של מלכודת ג'ין.

מצאנו כי עוברים של רקע גנטי שונה להציג טולרנסים שונים להליך זה, עם סוג בר המבוסס על חיית המחמד של החנות וטובינגן - ארוך סנפיר (TLF) להיות הסובלני ביותר בזמן שיש לי זני AB ו טובינגן הישרדות עני.

  1. הכנה של ה-DNA transposon. הכן GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. בהכנה) פלסמיד דנ"א באמצעות ערכה סטנדרטית miniprep QIAprep (Qiagen 27106). זה חיוני כדי לכלול את צעד PB לשטוף (שהוא אופציונלי בהליך QIAprep), אחרת את ה-DNA miniprep יהיה מזוהם על ידי RNase, שמובילה להידרדרות של mRNA transposase. לפני הזריקה, לדלל את ה-DNA במי RNase חינם (Ambion AM9937) ל10 ng / μl.
  2. הכנה של ה-mRNA transposase. Linearize pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 באמצעות XbaI ולתמלל את ה-DNA לינארית באמצעות T3 מכונת mMessage(Ambion AM1348) בערכת שעתוק במבחנה. יש לנו שונה תגובת שעתוק במבחנה על ידי הוספת 0.5 μl של מעכב RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). לאחר שלב טיפול DNase, לטהר mRNA באמצעות ערכת RNeasy MinElute (Qiagen 74204). להעריך את איכות במבחנה mRNA עיבד ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. לדלל את ה-mRNA במי RNase חינם ל40 ng / μl, וחנות כ2 aliquots μl ב -80 ° C.
  3. הכנת תערובת microinjection. לפני הזריקה, להוסיף 8 μl של ה-DNA transposon המדולל לaliquot 2 μl של mRNA transposase.
  4. Microinjection. הזרק 3 NL של תערובת ה-DNA / RNA לחלמון של 1 עוברי דג הזברה סלולרי תוך שימוש בטכניקות microinjection סטנדרטיים, במטרה לממשק החלמון / blastomere. איסוף עובר כל 20 דקות כדי להבטיח הזרקה בשלב תא 1. מניסיוננו, אדם מיומן יכול בקלות להזריק 1,000 עוברים ב1-1.5 שעה.
  5. לאחר הזרקה, להפעיל 5 μl של שמאלעל פתרון הזרקה על 1% agarose ג'ל לבקרת איכות, על מנת להבטיח כי mRNA transposase לא מושפל.
  6. טיפול עובר מוזרק. בשעתי אחר הצהריים מאוחרות, להסיר עובר מופרה ולא נורמלי ולהפיץ את העוברים ל60-80 ל100 מ"מ צלחת פטרי. עוברים נורמליים ומתים יוסרו ביום 1 לאחר הפריה (DPF), 2 DPF ו3 DPF.
  7. הקרנה לביטוי ה-GFP. עוברי מסך ללא פגמים גלויים לקרינת ה-GFP ב3 DPF (איור 3). הקרנה ניתן לעשות זאת גם בסטראו מצויד בקרינה (אנו משתמשים ניקון SMZ1500) או במיקרוסקופ זקוף (אנו משתמשים AxioImager Zeiss עם מטרת 5X Fluar). ביטוי נמוך של GFP מציין הזרקה או השפלה של RNA transposase כושלים בשל זיהום RNase (איור 3 א). בחר כ 30% מהעוברים המבריקים אשר גם לי הביטוי של GFP ברקמות מרובות או באחוז גבוה של תאים של רקמות ספציפיות (השווה Figures 3B ו 3 ג). מהזרקה של 1,000 עוברים, יש לנו בדרך כלל עד 100 גבוהים-GFP-לבטא עוברים התפתחותית נורמלים,.
  8. הרם עוברי F0 נבחרו באמצעות נהלי גידול דג הזברה רגילים. סביר לצפות כי 20-30% מהעוברים המוזרקים שנבחרו לגידול יגיעו לבגרות.

2. תחזוקה של כטב"מ: mRFP בודק קו.

יש לנו שנוצר 14xUAS: קו mRFP סומן על ידי γCry עדשה ספציפית: ה-GFP. מאז כטב"מ כפוף להשתקה באמצעות מתילציה DNA, חשוב לבחור דגים עם רמות נמוכות של השתקה כדי להפיץ את המניות.

  1. הגדרת כטב"מ בודד: הומוזיגוטים mRFP להזדווגות עם אחד מקווי Gal4 אמין ביותר שלנו מלכודת גן, tpl6 NSF (Balciuniene ואח' בהכנה.).
  2. ביום למחרת, להעביר את כטב"מ: דגי mRFP אשר נתנו עוברים למכלי סטטית בודד, בעוד העוברים נאספיםוניקה.
  3. עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP בDPF 1 ו -3 DPF.
  4. דגי Intercross אשר נתנו עוברים עם ביטוי גבוה mRFP להקים את הדור הבא של כטב"מ: קו mRFP.

3. הקרנה של דגי F0.

  1. לחצות F0 הפרטני עם כטב"מ הומוזיגוטים: דגי mRFP (איור 4). אנחנו בדרך כלל להזריק GBTs לקווים עם דפוסי wild-type או פיגמנטציה נמר, וכטב"מ הומוזיגוטים שלנו: קו mRFP הוא ברקע פליז. לכן דגי F0 הזריקו-GBT ניתן להבחין בקלות מכטב"מ: דגי mRFP, ומבטל את הצורך ברישום אם F0 שהוקרן היה זכר או נקבה, כמו גם שגיאות אפשריות הנובעות מטעויות בהקלטה ו / או לקביעת מינו של כל דגים. אנשים עם ניסיון מוגבל מאוד, סטודנטים לתואר הראשונים כאלה, ולכן הם מסוגלים להקים ולפרק את הזדווגויות דגים. גישה זו יש חסרון, כי שני רקע גנטי שונהבשימוש, שעלול לסבך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה.
  2. ביום למחרת, להחזיר את כטב"מ פליז: דגי mRFP לטנק שלהם. מניחים את דגי F0 אשר נתנו עוברים למכלי סטטית בודד (אנו משתמשים Hagen Exo Terra Faunarium קטן, אבל כל טנק קטן יכול לשמש למטרה זו) בזמן שעוברים נאספים והוקרנו.
  3. עוברים נקיים והעברה נאספו לתוך צלחות פטרי חדשות (<100 לכל צלחת) בשעתי אחר הצהריים של יום: 0.
  4. עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP ב1 DPF, 2 DPF ו3 DPF. משוך עוברים חיוביים עבור שניהם ה-GFP ו RFP החוצה, למיין אותם לפי ה-GFP / דפוס ביטוי RFP (אם תבנית יותר מפעם אחת הוא ציין במצמד) ולגדל אותם להקים דור F1.
  5. להרדים את דגי F0 אשר מיוצרים רק עוברים שליליים (מתוך מספר כולל של 50-100 עוברים).
  6. לחצות את דגי F0 שהפיק ה-GFP / צאצאי RFP חיובי שוב כדי לקבל את מנה שנייה של תוצאות חיוביות.

4.הקרנה של דגי F1.

דגי F1 מוקרנים להקים משפחות F2, כדי לתעד את דפוס ביטוי מלכודת הגן ולהקפיא קבוצות של עוברים לזיהוי מולקולרי של לוקוסי מלכודת גן על ידי 5 גזע 'והפוך ה-PCR.

  1. לחצות דגי F1 פרטניים עם כטב"מ הומוזיגוטים: דגי mRFP (איור 4).
  2. למחרת, הנח את דג F1 שנתן עוברים למכלי סטטית בודד ואילו העוברים נאספים והוקרנו.
  3. עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP ב1 DPF, 2 DPF ו3 DPF. עוברים נפרדים ולצלם חיוביים עבור שני GFP ו24 RFP.
  4. בשעת 5 DPF, להקפיא קבוצות של RACE 20 GFP / RFP-חיובי ו20 GFP / עוברי RFP-שלילי לזיהוי גנים שעברו מוטציה insertionally ידי PCR ההפוך ו5 '9,10. להעלות את ה-GFP / עוברי RFP חיובי שנותרו להקים דור F2.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזריקה מוצלחת, לפחות 80% מהעוברים הוזרקו תערובת mRNA מלכודת גן ה-DNA / Tol2 transposase להציג מידה מסוימת של הקרינה ה-GFP (איור 3). כאשר עוברי GFP החיובי הבהירים (איור 3 ג) נבחרו להקים את בריכת F0, אחד מכל 10 דגי F0 הוקרנו יניבו צאצאי מלכודת גן. בין דגי F0 ממנו אירועי מלכודת הגן הם התאוששו, רוב לשדר אירוע מלכודת גן יחיד, בנוסף לכמה אינטגרציות transposon שאינו מבטאות. עם זאת, יש לנו שהוקמו עד ארבעה קווי מלכודת גן מאדם F0 אחת. דפוסי ביטוי של GFP / RFP בקווי מלכודת גן נעים בין מאוד רקמות ספציפיות (לדוגמא בנורות חוש הריח) לכל מקום בצורה הוגנת.

figure-results-1
איור 1. Tהוא Gal4 המכיל וקטור מלכודת גן bipartite GBT-B1 והיישומים שלה. א רכיבים של וקטור מלכודת גן Gal4 המכיל: Tol2 5 'וTol2 3', transposon Tol2 המינימלי מסתיים 13; acceptor אחוי β-אקטין CSA, קרפיון 8; ^ Gal4-VP16, Gal4-VP16 אוגוסט פחות; זף ( א), β-אקטין UTR '3 דג הזברה ופולי () אלמנטים מGBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP וp SV40 () הם מרכיבים של כטב"מים: 17,18 קלטת ביטוי eGFP. החץ מציין הפעלה של כטב"מ: eGFP ידי Gal4-VP16 מיוצר על ידי מלכודת הגן ב 14XUAS:. Transgene mRFP סומן על ידי γCry עדשה ספציפית: קלטת ה-GFP. החץ מציין הפעלה של כטב"מ: mRFP ידי Gal4-VP16 באירוע מלכודת ג 'ין טראנס.. קופסות כחולים הן אקסונים. שחבור מצויינים על ידי קו מקווקו. אירוע מלכודת ד Enhancer. אינטגרציה של הווקטור ליד משפר (קופסא חומה) עשויה להציב אמרגן eGFP המינימלי תחת שליטתו של משפר זו (חץ חום ). הדבר יביא לביטוי רקמות הספציפיות של eGFP, אבל מאז Gal4-VP16 לא נעשה, ביטוי mRFP לא יופעל.

figure-results-2
איור 2. חזרה של אירועי מלכודת הגן באמצעות recombinase Cre. , ב 'תרשים של מוטציה מלכודת גן () ואלל מלכודת הגן חזר-Cre (ב'). C, D. שיתוף ביטוי של ה-GFP (C) וRFP (ד ') במערכת העצבים של גן tpl6 NSF שורת מלכודת. E, הזרקת פ של Cre-RNA לעוברי tpl6 NSF מובילה לאובדן של ה-GFP (E) וRFP ביטוי (F). שים לב שאין ירידה של ביטוי ה-GFP בעדשה, כצפוי.

r.within-page = "תמיד"> figure-results-3
איור 3. עוברים מוזרק עם מלכודת גן GBT-B1 (pDB783). . א עוברים הוזרקו pGBT-B1 GFP הקרינה קטנה תצוגה לבד בגוף B (pDB783), ק העוברים הוזרקו mRNA pGBT-B1 וTol2 transposase: קבוצה אקראית של עוברים (ב ') וגבוה expressors שנבחר לגידול (C).

figure-results-4
איור 4. מתווה ניסוי להקמת קווי מלכודת גן Gal4. מבני אדום / ירוק חלקית חופפים מצביעים על שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP, בעוד ירוק לבד מציין פסיפס לאירועי מלכודת גן או מלכודת משפר.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וקטורי מלכודת הגן והמתודולוגיה מתוארים כאן כבר נמצאים בשימוש במספר מעבדות עצמאיות. מניסיוננו, יש שני שלבים קריטיים בתהליך. הצעד הקריטי הראשון הוא להשיג שיעור גבוה של אינטגרציה מלכודת גן בעוברי F0 מוזרק. כישלון בשלב זה לעתים קרובות ניתן לייחס לזיהום RNase של ריאגנטים ההזרקה, במיוחד את ה-DNA miniprep. זה גם מאוד חשוב להזריק עוברים בשלב התא 1 לניסויי מלכודת גן. מניסיוננו, transgenesis בתיווך Tol2 הוא יעיל מאוד, מה שהופך אותו ניתן להשיג קווים מהונדסים גם כאשר הזרקה תאוחר משלב התא 1 או עם ה-DNA באיכות נמוכה יותר. זריקות ירודים הן הרבה יותר בעייתי בעת ביצוע mutagenesis מלכודת גן, שכן רק חלק קטן של אינטגרציות וקטור לגרום לאירועי מלכודת גן יעילים. השלב הקריטי השני הוא לברר אירועי מלכודת גן על ידי חצייה לכטב"מ שלנו: קו mRFP. העדר ביטוי mRFP הואכמעט תמיד מעיד על אירוע מלכודת משפר. עם זאת, לעתים חוסר ביטוי mRFP עשוי להצביע על השתקה של 14x כטב"מ. לכן חשוב לשמור על כטב"מ: קו mRFP במדינה שאינה מושתק על ידי הפצת הדור הבא באמצעות אנשים עם ביטוי הגבוה RFP כאשר חצו לtpl6 NSF.

אנחנו יכולים לחזות מה שהופך את מספר שיפורים לוקטורי מלכודת הגן שלנו ופרוטוקול. הראשון הוא להשתמש בכטב"מ פחות חוזר על עצמו במבנה מלכודת הגן. הוכח שכטב"מ 5x מספיק כדי להשיג הפעלה מלאה בניסויי תרבית תאים, וכי רצפי כטב"מ פחות חוזר על עצמו הם פחות רגישים למתילציה והשתקת 6,25. זה יכול להיות גם אפשרי לעצב וקטורי מלכודת גן לmutagenesis המותנה באופן מלא, באנלוגיה לווקטורים בשימוש על ידי קונסורציום מלכודת גן העכבר הבינלאומי ולאחרונה מותאמים לדג זברה 2,26,27. שיפור נוסף יהיה להשתמש t שונהמערכת ransposon, למשל יפהפה נרדמת 28, כדי לייצר כטב"מ: קו כתב mRFP. זה יאפשר הזרקה של מלכודות גן מבוססות Tol2 ישירות לתוך קו הכתב וההקרנה של F0s ידי incrossing. יתר על כן, זה היה מונע את השימוש בשני רקע גנטי שונה, מה שהופך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה פשוטה יותר. אפילו עם שיפורים אלה, פרוטוקול מלכודת גן הכללי Gal4 הוצג כאן עדיין יהיה ישים באופן מלא.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים אלה אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ג'ניפר Emtage לקריאה ביקורתית של כתב היד, ריאן גיל לקבלת סיוע טכני ולעזור בטיפול דג הזברה וד"ר סטיבן ג Ekker (Mayo Clinic, Rochster, מינסוטה) לחומרים כימיים. העבודה שלנו כבר נתמכה על ידי אוניברסיטת טמפל המכללה למדע והטכנולוגיה והמכון הלאומי לבריאות (R01-HD061749).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת MiniprepQiagen27104שלב כביסה PB אופציונלי הוא
חובה אנזים הגבלת XbaIThermoFisherER0681
mMessage Machine T3AmbionAM1348
RiboLock RNase מעכבThermoFisherEO0381
RNeasy MinEluteQiagen74204ניתן להחלפה במיצוי פנול ו משקעים. אין להשתמש ב-LiCl!
מים ללא נוקלאזאמביוןAM9937חייב להיות לא מטופל ב-DEPC
כבולי זכוכית בורוסיליקט למחטי מיקרו-הזרקהWorld Precision Instruments1B100F-4
מיקרו-קפילאריים לכיולDrummond Scientific1-000-0010
קצות מיקרו-מטעןEppendorf5242 956.003
חולץ מחט *Sutter מכשיריםP-87
למיקרו-הזרקה * ניקוןSMZ1500אנו משתמשים גם ב-Wild 5M ו-Olympus SZ61 עם מעמד אור משודר
Picoinjector *Harvard InstrumentsPli-90אנו משתמשים גם במיקרוסקופ הקרנה Pli-100
עם פלואורסצנטי GFP/RFP *לאובייקט ZeissZeiss AxioImager5X Fluar יש מרחק
עבודה מספיקמיקרוסקופ סינון עם פלואורסצנטיות GFP/RFP *NikonSMZ1500
* אנו מציעים ציוד זה רק מכיוון שאנו משתמשים בו בהצלחה במעבדה שלנו. בכל קטגוריה זמינות מספר אפשרויות דומות ממספר יצרנים.
סטריאומיקרוסקופ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62(2004).
  2. Trinh le, A., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  3. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  4. Emelyanov, A., Parinov, S. Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish. Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).
  5. Ellingsen, S., et al. Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome. Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).
  6. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
  7. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).
  8. Sivasubbu, S., et al. Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development. Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).
  9. Clark, K. J., et al. In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome. Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).
  10. Petzold, A. M., et al. Nicotine response genetics in the zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).
  11. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).
  12. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).
  13. Balciunas, D., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169(2006).
  14. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  15. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  16. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  17. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).
  18. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  19. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  22. Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
  23. Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells. Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).
  24. Petzold, A. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
  25. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
  26. Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish. Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).
  27. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).
  28. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gene TrappingGal4 VP16Zebrafish EmbryosGene Breaking TransposonUAS eGFP ReporterMicroinjection TechniqueGermline Transmission ScreeningInverse PCR AnalysisFive Prime RACECre loxP Reversibility

מאמרים קשורים