הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

12.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50145

⸱

12 במרץ 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center (ECRC), Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Medical Department, Division of Cardiology, Campus Virchow-Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Medical Department, Division of Cardiology and Angiology, Campus Mitte, Charité - Universitätsmedizin Berlin

במאמר זה

סיכום

Kv ערוץ התפקוד קשור הפרעות בקצב לב. על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שיובילו להפרעות קצב כאלה אנו מנצלים פרוטוקול שיטתי לבידודה של cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מעכברי KV ערוץ נלווה למקטע בנוקאאוט. cardiomyocytes המבודד יכול מייד לאחר מכן לשמש למחקרים אלקטרו סלולריים, (IF) מבחנים ביוכימיים או immunofluorescence.

תקציר

גני KCNE לקודד למשפחה קטנה של יחידות משנה נלווית ערוץ KV היוצרים קומפלקסי heteromeric עם יחידות משנת KV ערוץ אלפא לשנות את המאפיינים התפקודיים שלהם. מוטציות בגני KCNE כבר נמצא בחולים עם הפרעות בקצב לב, כגון תסמונת QT הארוכה ו / או פרפור פרוזדורים. עם זאת, הפתופיזיולוגיה המולקולרית המדויקת המובילה למחלות אלה נותרת חמקמקה. במחקרים קודמים את תכונות אלקטרו של המחלה גורמת למוטציות בגנים אלו בעיקר נחקרו במערכות ביטוי Heterologous ואנחנו לא יכולים להיות בטוחים אם ניתן לתרגם ישירות את ההשפעות שדווחו לcardiomyocytes ילידים. במעבדה שלנו ולכן אנו משתמשים בגישה שונה. אנחנו ישירות לחקור את ההשפעות של מחיקת גן KCNE בcardiomyocytes המבודד מעכברים בנוקאאוט על ידי סלולרי electrophysiology - טכניקה ייחודית שאנו מתארים בגיליון זה של כתב העת של ניסויים באופן חזותי. את הלב מGeneticaעכברים מהונדסים KCNE lly נכרתו במהירות ומותקן על גבי מכשיר Langendorff ידי cannulation אב עורקים. Ca 2 + חינם בשריר הלב, כבול בEGTA, וניתוק של myocytes הלב ואז הושג על ידי זלוף המדרדר של עורקים הכליליים עם התמחה נמוך Ca + 2 collagenase חיץ המכיל. אטרייה, קיר חופשי חדרית ימין והחדר השמאלי ואז יכולה להיות מופרדת על ידי טכניקות מייקרו. אז סיד חוזר ומוסיף לאט לcardiomyocytes המבודד בצעד מרובה הכולל הליך כביסה. cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים של מראה בריא ללא התכווצויות ספונטניות האז העביר מייד לניתוחים אלקטרופזיולוגים ידי טכניקת תיקון מהדק או ניתוחים ביוכימיים אחרים בתוך 6 השעות הראשונות שלאחר בידוד.

פרוטוקול

1. הרדמת בעלי חיים וקצירת איברים

  1. לטשטש את העכבר באמצעות זריקת intraperitoneal (IP) של קטמין (200 מ"ג / קילו BW) וXylazine (20 מ"ג / קילו BW).
  2. לanticoagulate להזריק IP הפארין 250 יחב"ל כדי למנוע היווצרות קרישי דם וקרישים.
  3. חכה עד ההרדמה עמוקה הוא הגיע, אשר מאופיינת על ידי areflexia. כדי לבדוק areflexia רפלקס, בדיקת קרנית על ידי נגיעה בקרנית או רפלקס טיסת ניסוי על ידי צביטת זנב בעדינות.
  4. העבר את העכבר על שולחן ניתוחים ולתקן אותה במצב שכיבה.
  5. חתוך העור וקיר הבטן מתחת xiphoid ולבצע פתיחת בית חזה צדפה: הארך את הקיצוץ לשני הצדדים לאורך קשת costal ולאחר מכן לחתוך את הצלעות בקו בית השחי המדיאלי, להסיט את בית החזה כלפי מעלה.
  6. פתח קרום לב, אתר כולים נהדרים. לחץ בעדינות על זנב לב טוב יותר כדי להציג את אב העורקים. מהדק את אב העורקים באמצעות מלקחיים.
  7. הנח את הלב בקעירות זוג של cissors וינתח את כל כלי חיבור עם חתך אחד אחד. הקפד לשמור על חלק גדול מספיק של אב עורקים עולים לcannulation Langendorff.
  8. להעביר מייד ללב שחוט צלחת פטרי מלא בקרח קר ופתרון מראש חומצן 1 (לפתרונות, ראה טבלת 1).

2. הכנת זלוף לב וLangendorff

  1. Cannulate אב העורקים עם צינורית פלדת 1.8F. הקפד להימנע מתסחיף אוויר.
  2. לקבע אב עורקים בצינורית עם תפר כירורגית והתקפי לב, מפוצץ ב1 מ"ל של פתרון 1.
  3. חבר צינורית עם מנגנון Langendorff.
  4. ודא זמן מפתיחת בית החזה לcannulation Langendorff אינה עולה על 120 שניות כדי למנוע פציעה ממושכת איסכמיה / reperfusion לשריר הלב.
  5. לב ינקב עם 10 מ"ל של Ca 2 + ללא פתרון 2 (4 מ"ל / דקה).
  6. לב ינקב עם פתרון collagenase 3 דקות ל8 (4 מ"ל / דקה).
"> 3. מייקר דיסוציאציה le של הלב צ'יימברס

  1. לב העברה לתוך צלחת שחוממה מראש 100-מ"מ פטרי המכיל Ca 2 הנמוך פתרון + 4.
  2. מוציא בזהירות את אב עורקים ורקמות אחרות שאינן לבביות עם מספריים והשליכו אותו.
  3. אטרייה נפרדת וחדרי לב ולהמשיך בכל תא בנפרד. שמור על תאים שקועים בפתרון 4. השתמש בכמויות קטנות (פחות מ 5 מ"ל).

4. דיסוציאציה נוספת של cardiomyocytes

  1. cardiomyocytes פרוזדורים:
    1. כדי לייחד cardiomyocytes פרוזדורים להעביר אטרייה לתוך צלחת תרבות נפרדת מראש מחוממת 100-מ"מ ולנתק את הרקמה באמצעות משייכתו בעדינות אותו לגזרים עם מלקחיים עדינים. ודא ניתוק כמעט מוחלט של הרקמה.
    2. השתמש פיפטה 1 מ"ל עם קצה מוגדל אש מלוטשת פיפטה פלסטיק להשעות את התאים ב1 מ"ל של פתרון 5 למשך 5 דקות.
    3. הפרד את התאים מפסולת באמצעות מסנן תא (200 מיקרומטר גודל רשת).
    4. הוסף פתרון 5 מ"ל 5 עד השעית התא וצנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר.
    5. השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. בטל supernatant מחדש הושעה-גלול ב 5 מ"ל של פתרון 6.
    6. לאחר שקיעה על ידי כוח הכביד למשך 10 דקות בצינור מ"ל 15, סרכזת לדקות 1 בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant. Re-להשעות התאים בהתאם לכמותם ב1-5 מ"ל של פתרון 6.
  2. cardiomyocytes חדרית:
    1. לנתח את אזור החדר השמאלי של עניין עם מלקחיים עדינים ב5 מ"ל של פתרון 4.
    2. להשעות את תאים על ידי pipetting בעדינות עד שרוב התאים המופרדים. להעביר את פתרון התא לאחר הסינון (200 גודל רשת מיקרומטר) לתוך צינור מ"ל 50, להוסיף נפח של 25 מ"ל.
    3. צנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר.
    4. השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. הסרת supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 25 מ"ל שלפתרון 6 ולאפשר שקיעה של התאים למשך 10 דקות.
    5. ספירת התאים ולהסיר את supernatant, להוסיף 25 - 50 מיליליטר פתרון 6 בתאים.

5. הכנת cardiomyocytes לאלקטרופיזיולוגיה הניידת, או אם מחקרים ביוכימיים

  1. ללימודי electrophysiology, לשמור על myocytes בפתרון 6 בצינור מ"ל 50 ומעכב את השקיעה.
  2. למחקרים ביוכימיים, הדמית סיד למשל, myocytes צלחת על צלחת תרבות laminin מצופית תא (20 מיקרוגרם / המ"ל laminin ב PBS ריכוז סופי).
  3. להכתמת immunofluorescence להכין צלחת צלחת תרבית תאים עם תלושי כיסוי זכוכית ומצופית בפתרון laminin (ריכוז סופי 50 מיקרוגרם / המ"ל laminin ב PBS).
    1. הסר את הפתרון לפני myocytes ציפוי. פלייט התאים ולשלוט בצפיפות התאים באמצעות מיקרוסקופ.
    2. תן myocytes לדבוק לכסות להחליק לשעת 1 ב 37 ° C ב2% CO 2, להסיר את הפתרוןולהתחיל מייד בפרוטוקול הליך הכתמה סטנדרטית.
    3. דגירה עם מקבע, למשל 4% PFA ב PBS (pH 7.5) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ופעל עם שלושה שלבי כביסת PBS עבור 5 דקות כל אחד.
    4. לpermeabilize התאים ולעכב נוגדן מחייב נוקב דגירת myocytes עם סרום 10%, טריטון 0.3%, 0.2% BSA ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    5. דגירה עם הנוגדן הראשוני לשעה 1 ב 37 ° C ולשטוף כפי שתואר קודם לכן.
    6. דגירה עם הנוגדן המשני לשעה 1 בטמפרטורת חדר. לcounterstain גרעינים וα-actinin השימוש DAPI וphalloidin מצומדת fluorochrome (אלקסה פלואוריד 488, Invitrogen).
    7. לאחר שטיפה, להעביר את כיסוי הזכוכית מחליק בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ silane טופלו ותאים להטביע בהרכבה בינונית פלואורסצנטי.

6. הנייד אלקטרופיזיולוגיה

  1. לבצע הקלטות כל תא תיקון-מהדק בfreמבודד cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים shly בטמפרטורת חדר.
  2. העברת cardiomyocytes מופיע בריא לתא זלוף מלא בנפח מוגדר של פתרון אמבטיה תאית. 117 mM NaCl, 4 המ"מ KCl, 1 mM KH 2 4 ת.ד., 4 המ"מ 3 NaHCO, 1.7 המ"מ MgCl 2, 3 המ"מ CoCl 2, 10 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מימ, וTetrodotoxin 0.02 מ"מ (TTX), (pH 7.4) . השתמש NaOH להתאמת ערך ה-pH.
  3. השתמש בציוד מהדק תיקון ראוי (IX71 מיקרוסקופ כלומר הפוך, מגבר 700B Multiclamp, מערכת Digidata 1440A רכישה ומחשב עם pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים)).
  4. השתמש pipettes תיקון עם התנגדויות של 3-5 MΩ כאשר התמלא פתרון תאי המכיל 130 מ"מ KCl, 2 המ"מ MgCl 2, HEPES 11 מ"מ, 11 המ"מ EGTA, 5 המ"מ Na 2 ATP, 0.4 המ"מ Na 2 GTP, 5 מ"מ Na 2 CP ו -4.9 mM CaCl 2 (pH 7.2). השתמש KOH להתאמת ערך ה-pH.
  5. לעורר החוצה K + זרמי duצעדי טבעת 4.5-sec מתח לבחון פוטנציאלים בין -60 ו50 mV במרווחי 10-MV מפוטנציאל החזקת -70 mV לאחר 20-msec prepulse לmV -40.
  6. ודא זרמי דליפה תמיד <100 הרשות פלסטינית.
  7. לנתיחה של K + זרמים השונות להשתמש במעכבים ספציפיים כמו 4-aminopyridine (4-AP: Biomedicals ICN, אירווין, קליפורניה, ארה"ב), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) או Tetraethylammonium (תה; סיגמא). פתרוני מניות צריכים להיות מוכנים בפתרון אמבטיה תאי, ולהחיל ישירות על הסביבה הקרובה ביותר האפשרית של התא דרך microtip לאחר הקלטות "בסיסיות". האיזון צריך להיות מותר ל2-3 דקות לפני הקלטות "סמים".
  8. לניתוח לנרמל אמפליטודות נוכחית בתאים בודדים לגודל תא (קרום קיבול כל תאים). לנתח נתונים מחוברים באמצעות pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים) או תוכנה דומה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד של cardiomyocytes Murine הבוגר מעכברים מהונדסים גנטי כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים של עניין במבחנה הפך לכלי רב עצמה עוד יותר להבין פתופיזיולוגיה לב. שיטה זו משמשת כיום על ידי מספר קטן, אך גדל רק במעבדות מדע בסיסיות ברחבי העולם. עם זאת, בידוד של cardiomyocytes Murine חדרית בוגרים יכול להיות מסובך וצריך להיעשות ביסודיות ושוב ושוב על ידי ידות מנוסות. איור 1 מציג cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מבודדי מופת טריה. לcardiomyocytes חדרית אנו ממליצים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עם ההתפתחות הגוברת של זני עכבר מהונדס גנטי כדי ללמוד תפקוד לב ולב הפתולוגיה הקשור למחיקת גן יש גם עניין גובר בשיטות מיוחדות כדי ללמוד השפעות של מחיקת הגן הספציפית במבחנה. במעבדתנו אנו לומדים את התפקידים של משפחה של תת יחידות עזר ערוץ KV על repolarization לב. גני KCNE מהווים משפחה של 5 גנים (KCNE1-5) שממלאים תפקידים חשובים בחדרית האנושית וrepolarization פרוזדורי 11, 15. KCNEs הם יחידות בודדות הטרנסממברני תחום KV ערוץ עזר שאינו עוברים כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה למסור.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), פריץ תיסן-Stiftung וCharité / MDC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה
Tetrodotoxin Alomone
4-aminopyridine Biomedicals ICN
Heteropodatoxin 2 Alomone
Tetraethylammonium כימיקלי סיגמה
סוג collagenase 2 וורטינגטון

מקורות

  1. Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs? Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
  2. Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
  3. Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels? Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
  4. Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
  5. Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
  6. Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
  7. Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
  8. Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
  9. Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
  10. McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
  11. Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
  12. Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
  13. Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
  14. Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
  15. Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
  16. Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
  17. Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
  18. Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
  19. Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
  20. Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Whole Cell Patch ClampKCNELangendorffP Clamp
בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.