ניתן להשפיע על גנים בזמן ההתפתחות של קליפת המוח או ההיפוקמפוס של החולדות באמצעות electroporation ברחם (IUE) בE16, כדי לאפשר שינויים מהירים וממוקד בקישוריות עצבית למחקרים מאוחרים יותר של התנהגות או neuropathology בבעלי חיים מבוגרים. אחרי לידה בתחום ההדמיה vivo על שליטה בהצלחת IUE מתבצעת על ידי פליטת אור של הפעלת לוציפראז transfected השותף.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ב electroporation ברחם (IUE) היא טכניקה המאפשרת שינוי גנטי של תאים במוח לחקר התפתחות עצבית. עד כה, השימוש בIUE לחקירת התנהגות או neuropathology במוח הבוגר היה מוגבל על ידי שיטות מספיקות לניטור ההצלחה transfection IUE ידי טכניקות לא פולשנית בבעלי חיים לאחר לידה של.
לצורך המחקר הנוכחי, חולדות E16 שימשו לIUE. לאחר הזרקה תוך חדרי של חומצות גרעין לעוברים, מיקום של האלקטרודות פינצטה היה קריטי למיקוד או קליפת המוח מתפתח או היפוקמפוס.
חדרית הזרקה משותפת וelectroporation של ניטור גן בלוציפראז מוותר של תאי transfected לאחר לידה לאחר הזרקת וציפרין intraperitoneal בגור P7 החי מורדם על ידי in vivo פליטת אור, תוך שימוש במכשיר IVIS ספקטרום עם תוכנת כימות 3D.
class = "jove_content"> אזור הגדרה על ידי פליטת אור באופן ברור יכולה להבדיל בין electroporations קליפת המוח והיפוקמפוס ולזהות אות אורכים לאורך זמן של עד 5 שבועות לאחר לידה. טכניקת הדמיה זו אפשרה לנו לבחור גורים עם מספר מספק של תאי transfected הנחה הכרחיים למפעילים השפעות ביולוגיות, ולאחר מכן, לבצע חקירות התנהגות ב3 חודשים של גיל. כדוגמא, מחקר זה מוכיח כי IUE עם הגן האנושי באורך מלא DISC1 אל קליפת מוח העכברוש הוביל לרגישות יתר אמפטמין. GFP transfected-Co ניתן היה לזהות בתאי עצב בדואר מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורטם בcryosections המציין ביטוי גנים נוכח ב≥ 6 חודשים לאחר לידה.
אנו מסיקים כי הדמיה פליטת אור לאחר לידה מאפשרת הערכת ההצלחה של transfections החולף עם IUE בחולדות. חקירות על ההשפעה של מניפולציות גנטיות אקטואליים במהלך neurodevelopmenלא במוח הבוגר והקישוריות שלה הם הקלו באופן משמעותי. עבור רבים שאלות מדעיות, טכניקה זו יכולה להשלים או אפילו להחליף את השימוש של חולדות מהונדסים ומספקת טכנולוגיה חדשנית למדעי המוח התנהגותיים.
מבוא
הפיתוח של electroporation ברחם השיטה (IUE) המאפשר אפנון של ביטוי גנים במוח המתפתח, היה פריצת דרך שכן הוא אפשר לומד התפתחות נוירולוגית בקלות יחסית. 1-7 שינויים ברמות ביטוי של גן מטרה ב אזור ספציפי במוח במהלך התפתחות עוברית ו / או סביב הלידה במכרסמים הודגמו לביקורתי התפשטות ההשפעה עצבית, הגירה, arborization, וקישוריות. 8-10
סכיזופרניה היא מחלת נפש מורכבת עם תסמינים חריפים וכרוניים שכבר קשורים להפרעות התפתחותיות 11, 12 ולכן רבים מהגנים שזוהו המועמד לסכיזופרניה נחקרים להשפעות ויסות פוטנציאליות על התפתחות נוירולוגית, כמו למשל לשבש-in-סכיזופרניה גן -1 (DISC1) 13-15.
התפתחות המוח היא regulated על ידי גורמים גנטיים ויחסי הגומלין שלהם עם סביבה אשר ממלאים תפקידים בתקופות טרום, פרי ולאחר לידה התפתחותית. גורם סיכון גנטי אחד עיקרי להפרעות התנהגותיות שונות הוא מוביל מציאה DISC1 16 גן. DISC1 פגמים הגירה בעכברים 13, 17, ומניפולציה של ביטוי DISC1 בקליפת המוח מתפתח על ידי IUE הוכח השפעה על התנהגותם של עכברים בוגרים 18.
יש מניפולציה ביטוי גנים במוח על ידי IUE מספר יתרונות 19 על הדור של קווי בעלי חיים מהונדסים. ראשית, ביטוי גנים בתוך תחומי העניין יושג בתוך שבועות עד חודשים ולא כמה דורות של רבייה קווי מכרסם מהונדסים. שנית, מנגנוני פיצוי במהלך ההתפתחות מוקדמת שעשויה להגן על פנוטיפים בבעלי חיים מהונדסים בתאי מין 20 נמנעים. שלישית, באמצעות מיקוד רק אוכלוסיית תאים ספציפית או אזור הספציפי של המוח, migratiאו הבדלי התפשטות ניתן להשוות באופן ישיר עם הלא המוטציה או לשלוט בצד נגדי אם electroporations חד צדדי הם נבחרו. מצד השני, IUE אין את הדיוק של cre / תזמון מונחה אמרגן מושרה לקס ביטוי ורק subpopulation של התאים באזור מסוים הוא ממוקד שמוביל לסוג של פסיפס דפוס ביטוי גנים.
עבור רבים יישומים ניסיוניים במכרסמים מבוגרים, transfection חולף של מספר מוגבל של תאים באזור במוח עשוי להיות מספיק, או אפילו רצויה, כך שהיתרון הגדול של מכרסמים יציבים, germline-מהונדס הוא זניח. למעשה, IUE כדאי לבדוק האם חלק מהתאים שפותחו באופן חריג עלולים להשפיע על רשת של תאים או מעגלים שלמה. יתרון נוסף עשוי להיות היכולת להדגים השפעות תאים אוטונומיים שאינן של גן בשל אופי הפסיפס של הלהיט. יתר על כן, הדור של חולדות מהונדסים ונוקאאוט הוא עדיין בחיתוליו והשימוששל IUE במין זה ללימוד השלכות התפתחות המוח סוטה הוא של ריבית גבוהה.
עד כה, מכשול עיקרי של שימוש IUE לחקירת השלכות התערבות באותם בעלי חיים כבוגרים הוא חוסר ההצלחה electroporation ניטור. עד כה, ה-GFP-שיתוף transfected תאי עצב ניאון בגורי חולדה יילוד החי לא ניתן היה להבחין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי משקפת מתאים או עם דימות פלואורסצנטי של ספקטרום IVIS.
כדי להתגבר על מכשול זה, אנו לשתף transfected גן כתב לוציפראז וביצעו הדמיה לחיות פליטת אור של גורים על ידי quantitation 3 ממדים (3D) של האזור במוח IUE.
כדוגמא להוכחת הישימות של שיטה זו בassay פונקציונלי לאחר מכן בודקת את המניפולציה הגנטית התפתחותיות, הזרקה משותפת של פלסמידים המכילים DISC1 אנושי, לוציפראז, וה-GFP לתוך החדר לרוחב של עוברי עכברים 3 ואחריו electroporation עם אלקטרודה פינצטה בוצעו. בעוד אותות הקרינה לא ניתן היה להבחין בשלבי לידה in vivo, אות פליטת אור מוצקה נובעת מחילוף חומרי וציפרין על ידי הגן בלוציפראז transfected השותף זוהתה עד חמישה שבועות לאחר לידה. 3D-מדידות של כימות האזור במוח electroporated אפשר לפיה גורים עם electroporation מספיק או במקום זוהו מלכתחילה, ובכך, מה שמאפשר ההקצאה של בעלי החיים IUE (גן של עניין ומקושקש שליטה) לקבוצות ניסוי עם התאמת אזורים במוח electroporated של השתנות נמוכה . השימוש בחולדות IUE בוגרות בפרדיגמות התנהגותי הודגמה כדוגמא לתועלת של פרוטוקול זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי Landesministerium האחראי für נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301) בהתאם ללאומי וחקיקה אירופאית.
1. ברחם Electroporation
שיטה זו תוארה בפירוט ביופיטר לחולדה על ידי Walantus et al. 3, כמו גם רייס ואח'. 4 והוא כאן סיכם רק לזמן קצר. גודל המלטה של 6-8 גורים מניב תוצאה טובה. לא צריך להיות לפחות שני עוברים שאינם electroporated על מנת להגדיל את שיעור ההישרדות הכולל (ראה להלן).
- הכן את ה-DNA המכילה תערובת 1.5 מיקרוגרם / μl של יעד פלסמיד (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, יוג'ין, או ביטוי יתר / DISC1: pCAX 21), 0.5 מיקרוגרם / μl בלוציפראז המכיל פלסמיד (pCAX), 0.5 מיקרוגרם / μl-GFP המכיל פלסמיד (22 pCAGGS) בBlu אור הפתרון המוכתם 1x PBSדואר עם מהיר גרין דיי.
- הכן את מחטי הזרקה מתוך נימי זכוכית עם מחט פיפטה פולר. ולעקר מכשירי ניתוח או על ידי מעוקר או דגירה עם חומר חיטוי על בסיס אלכוהול (kodan Tinktur הצד החזק).
- שלו מנה טרום ניתוחית של עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם) 15 דקות לפני הניתוח לחולדה בהריון 16 ימים לאחר ההפריה (E16). ואז להרדים את החיה בחדר isoflurane.
- לאחר ההרדמה, מניח את החולדה בעמדת פרקדן על שולחן ניתוח חימם 37 ° C עם מסכת נשימה מחוברת למכשיר ההרדמה, שימוש בהגדרת חמצן ב0.4 ליטר / דקה וisoflurane ב1.8%.
- לאחר גילוח הבטן, לחטא את האזור המגולח שלוש פעמים עם kodan Tinktur פורטה (חומר חיטוי על בסיס אלכוהול).
- כסה את העכברוש עם בגדים סטריליים, חושף רק את שדה הפעולה המגולח.
- מבצע ב electroporation ברחם.
- חותכים את הבטן עם scissor לאורך alba Linea (~ 2 סנטימטר).
- לחשוף את קרן הרחם בזהירות עם מלקחיים טבעת.
- לדאוג לשמור על קיר הרחם רטוב עם PBS סטרילי התחמם במהלך כל הניתוח.
- הזרק פתרון ה-DNA עם מחט זכוכית דקה לתוך אחד של החדר לרוחב של העוברים.
- מניחים את האלקטרודה 7 מ"מ סביב ראשו של העובר. להכות אוכלוסיית תאים של שכבות העליונות של קליפת המוח, לבצע IUE בE16 23 ולמקם את האלקטרודה החיובית בחצי הכדור מעל החדר המוזרק עם נטייה גב / עדין לצדדים. כדי למקד את התאים בהיפוקמפוס לשנות את מיקום האלקטרודה החיובי לצד השני יותר מאשר החדר הוזרק לרוחב למעט כיוון גב (איור 1).
- בצע electroporation על ידי חמישה 50 פולסים msec ב55 V עם 950 הפסקות אלפיות עם electroporator דופק גל מרובע.
- חילוף העובר הראשון בסוף הנרתיק של כל קרן רחם על מנת להגדיל tהוא סיכויי הישרדות של כל העוברים.
- שים את קרנות הרחם בחזרה לתוך החולדה האם.
- Stich דופן הבטן עם חומר תפר נספג Vicryl כירורגית.
- סגור את העור עם חומר תפר Vicryl או עם קליפים תפר.
- מניחים את החולדה האם חזרה לכלוב בבית ולשמור אותו חם ל2-3 שעות.
- החזק את החולדות לבדו בכלוב בביתם בחדר מתקן בעלי החיים וכרצונך להאכיל. הם נותנים לידה בין E22-24.
- שמור על גורי חולדה עם אמם במשך שלושה שבועות ולהפריד אותם לאחר מכן על ידי מגדר.
2. הדמית חית פליטת אור של התגובה האנזימטית בלוציפראז
שיטה זו משמשת כדי לנתח את המיקום של התאים ברחם transfected. cDNA גחלילית לוציפראז electroporated-Co מתורגם ללוציפראז הפעיל, אשר על חילוף חומרים של D-וציפרין לoxyluciferin, פולט פוטון (איור 2 ). הארה וכתוצאה מכך יכולה להיות מזוהה במוחם של חולדות צעירות electroporated חיוביים בספקטרום IVIS עד גיל סביב 35 ימים לאחר לידה (איור 4).
במחקר הנוכחי, ההדמיה assay לוציפראז ופליטת האור בוצעה החל משעת P7. נקודת זמן זו נבחרה כדי לאפשר לאם וגורים להתאושש מלחץ לידה. כאשר בתחילה לעבוד עם הגורים בP0, הישרדות גור הושפעה באופן חמור שהגורים נמצאו מתים או נאכלו על ידי האם.
בתחילה, גורי חולדה עם electroporation המוצלח מזוהים על ידי תמונת 2D-פליטת אור עם זמן חשיפה של שלוש דקות. בהמשך לכך, גורים חיוביים משמשים ליצירת תמונות 3D כדי לציין את המיקום של אזור electroporated.
- לדלל מלח נתרן D-וציפרין ב PBS לריכוז של 15 מ"ג / מיליליטר ולעקר אותה על ידי סינון דרך מסנן מזרק סטרילי.
- לשקול את הגורים.
- קח את הגור ביד אחת עם הבטן על גבי ולמתוח את הבטן במקצת. הזרק 10 μl / גרם של משקל גוף של intraperitoneal פתרון וציפרין. לאלה ישנים יותר וזריזים יותר, מראש לטשטש את הגורים עם isoflurane בחדר האינדוקציה לפני הזרקת וציפרין.
- הפעל את זרם isoflurane של מערכת גז הרדמת XGI-8 בתוך ספקטרום IVIS עם isoflurane 3%.
- שים את החוטם של בעל החיים לתוך הקונוסים האף זכוכית של מערכת ההרדמה.
- להחזיק את בעלי החיים בתנוחת שכיבה עד שהוא בהרדמה עמוקה (2-3 דק '). לאחר מכן להפחית את זרם isoflurane 1.5%.
- בחר מדידת 2D-פליטת אור כדי לבחור גורים חיוביים מכל ההמלטה. השתמש בהגדרות הבאות
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.- הגדר checkmark על צילום עם binning הבינוני וF / עצור בשעה 8, המצלמה לוקחת את התמונה מלמעלה לאחר תחילת המדידה.
- מסנן עירור קבע: בלוק.
- להגדיר מסנן פליטה: פתוח.
- הגדר Binning עד בינוני.
- הגדר F / עצור בבית 1.
- א 'רמת שלב הגדרה
- להגדיר זמן חשיפת הארה 180 שניות.
- ליצירת תמונות 3D על מנת לכמת טוב יותר את אזור electroporated מהגורים החיוביים, להשתמש בהגדרות DLIT הבאות לגחלילית בלוציפראז.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.- הגדר סימן ביקורת על צילום; המצלמה לוקחת את התמונה מלמעלה לאחר תחילת המדידה.
- הגדר סימן ביקורת על מבנה, את פני השטח של החיה נסרק על ידי IVIS לפני מדידת פליטת אור.
- Use הבא מסנני פליטה וגדרות זמן חשיפה עד לגיל שבועיים:
מסנן פליטה 1: 590 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה
פליטת מסנן 2: 600 ננומטר, שניות 240 זמן חשיפה
פליטת מסנן 3: 620 ננומטר, שניות 180 זמן חשיפה
מסנן פליטה 4: 640 ננומטר, שניות 120 זמן חשיפה
לחולדות מבוגרות יותר P20
מסנן פליטה 1: 600 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה
פליטת מסנן 2: 620 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה
פליטת מסנן 3: 640 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
כתוצאה מהירידה בעוצמת אות בבעלי חיים מבוגרים יותר, את זמן החשיפה מוגדל לשלושה מסנני הפליטה הטובים ביותר. - רמת השלב ב 'שנקבע
- הגדר Binning עד בינוני.
- הגדר F / עצור ב1
- לאחר המדידה, mar k החולדות על ידי קוד אוזן של כדי להבדיל אותם אחד מהשני וכדי להתאים אותן לתמונות בשידור חי IVIS ההדמיה
- בסופו של הליך המדידה, לכבות את זרם isoflurane ולשמור את העכברוש על הצלחת מחוממת לכמה דקות לפני שהחזרת אותו לכלוב שלה.
3. ניתוח של תמונות פליטת אור
הדור של תמונות 3D, סרטי 3D והכימות של עוצמת הקול של מקור האות נעשה על ידי תוכנת תמונת חיים מותקנים מראש על ספקטרום IVIS.
- דור של תמונות 3D
- ראשית, לשחזר טופוגרפיה משטח, ולכן נקבע סף שבין 20-30%.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
6 "src =" een / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> - התחל שחזור 3D DLIT עם סף תמונה של 10% לכל אורך גל.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. - ליצור סרטי 3D באמצעות לחצן הנפשת בתוך סרגל הכלים 3D.
- בחר אוריינטציות שונות של תמונת 3D, כמו גם נופי התקרבות כמסגרות מפתח ולחץ על '# שיא &39; כפתור, הקלטת המעבר מתפקיד אחד / נטייה למשנו.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
- ראשית, לשחזר טופוגרפיה משטח, ולכן נקבע סף שבין 20-30%.
4. בדיקת התנהגות
בדיקות התנהגותיות בוצעו על מנת לקבוע אם מניפולציות גנטיות בתיווך IUE בחולדה עשויות ליזום השפעות ארוך טווח שנמשכות אל הבגרות. במקרה הספציפי הנוכחי, ההשפעה חולפת, ביטוי יתר חד צדדי באורך מלא DISC1 אדם קליפת המוח לאחר IUE נחקרה על ידי בדיקת תנועה בשדה פתוח (של), עם ובלי מינון נמוך של אמפטמין, כמבחן ספציפי לדופמין קשור התנהגות 24. בהליך דומה שבוצע על ידי Niwa et al. בעכברי IUE באמצעות מציאה DISC1, עכברי IUE אך לא שולט הראה רגישות יתרלאמפטמין 18.
חולדות שברחם electroporated עם וקטור ביתר DISC1 נערכו בתנאי מעבדה עם שעות 12 אור 7:00-07:00 והיו כרצונך נמאס. בגיל 3 חודשים, חולדות עברו בדיקות התנהגותיות.
לכימות תנועה כקריאת נתונים של תופעות אמפטמין, השטח פתוח של מערכת פעילות Tru סריקה ממוקמת בתא צליל והאור בודד היה בשימוש. מערכת זו מודדת את משך הזמן ולהרחיק את המהלכים של בעלי החיים, הזמן והמרחק בילו בשוליים או במרכזו של השדה הפתוח, כמו גם גידול התנהגות 25.
- ביום הראשון, לבדוק לאחר הזרקה מי מלח
- לשקול את בעלי החיים.
- הזרק intraperitoneally משקל גוף μl 1 / גרם של תמיסת מלח (1x PBS).
- מייד לאחר ההזרקה, לשים את בעל החיים לתוך השטח הפתוח ולהתחיל את המדידה של מערכת TruScan. שיא 15 דקותד לחלק את הנתונים ל3 X 5 חלקי דקות.
- שים את בעלי החיים בחזרה לכלוב בבית שלה.
- יום שני, מבחן על הזרקת אמפטמין
- לשקול את בעלי החיים.
- הזרק intraperitoneally משקל גוף μl 1 / גרם של 0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון אמפטמין.
- מייד לאחר ההזרקה לשים את בעל החיים לתוך השטח הפתוח ולהתחיל את המדידה של מערכת TruScan. שיא 15 דקות ולחלק את הנתונים ל3 X 5 חלקי דקות.
- להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית שלה.
- ניתוח תנועה והתנהגות גידול שנוצרה על ידי תוכנת Tru סריקה ספציפית. יצירת גרפים עם GraphPad (פריזמה) ולחשב נתונים סטטיסטיים על ידי תוכנת הסטטיסטיקה SPSS.
תוצאות
איור 3 הופעות חי מדידות הדמיה של שלושה גורי חולדה ב P7 לאחר ההזרקה של וציפרין / קילוגרם משקל גוף 150 מ"ג. הבדלים של עוצמת אות מציינים את השונות ביעילות של IUE גלויים. אותות פליטת אור חזקים נרשמו עד P36 (איור 4). באיור 5, את היכולת להגדיר electroporation קליפת המוח (5A דמויות ו5C) והיפוקמפוס (5B דמויות ו5D) על ידי הדמיה פליטת אור מתוארת. קורלציה של אות פליטת אור (איור 7 א) עם אות הקרינה שלה לאחר הסרת גולגולת (איור 7) ותאי ה-GFP-electroporated המקביל במוח cryosectioned (איור 8) בשעה P14 מתוארת באיורים 6-8. ראוי לציין, שלא היה זיהוי של אות הקרינה בחולדות חיות בכל נקודת זמן.
אוהל "> בvivo הדמיה פליטת אור מאפשרת אפליה מקורבת של אזורים במוח electroporated השונים על ידי 2D (5A דמויות ו5 ב) שהוא השתפר מאוד עם תכנית DLIT של תוכנת IVIS ספקטרום יצירת תמונות 3D (5 ג דמויות ו5D). בדוגמאות שמוצגת , Electroporation של קליפת המוח הקדם חזיתית בהיפוקמפוס ויכול להיות מכובד. יש לציין כי בעוד במטרה electroporate ההיפוקמפוס, יכולים להיות גם פגעו בכמה תאי אב לגב הקליפה שוכבת של ההיפוקמפוס (איור 7).חולדות באופן חד צדדי ברחם electroporated עם וקטור pCAX לתוך קליפת המוח, ולאחר מכן ביתר DISC1 האנושי באורך מלא נחקרו על שני ספונטני והיפראקטיביות מושרה אמפטמין כבוגרים. חולדות electroporated עם pCAX-DISC1 היו רגישות למינון נמוך של אמפטמין. חולדות אלה עברו באופן משמעותי את מומחדש לאחר טיפול אמפטמין מאשר לאחר ההזרקה מי מלח, ואילו בעלי שליטה לא (איור 10).
איור 1. ערכה של עמדת אלקטרודה ל) electroporation electroporation קליפת המוח ו-B) בהיפוקמפוס, ירוקה = הזריק DNA-Mix בתוך החדר.
איור 2. תגובת לוציפראז.
איור 3. מדידת הארה של חולדות P7 לאחר ההזרקה של 150 מ"ג / קילוגרם משקל גוף luciferine; זמן חשיפה 180 שניות;) חולדה ללא אות הארה; B) חולדה עם אות פליטת אור חלשה; חולדה C) עם אות הארה חזקה.
איור 4. קו זמן של מדידות פליטת אור ברציפות מאותו העכברוש לאחר ההזרקה של 150 luciferine מ"ג / קילוגרם הוכחת חלון זמן שבו הצלחה גדול IUE ניתן לאתרם.
. איור 5 איור של הבדלים בין electroporation קליפת המוח והיפוקמפוס ב P7) וארוחת בוקר) תמונות 2D;. C) & D) תמונות 3D;) & C) מקליפת המוח; B) & D) מההיפוקמפוס.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 6. איור של electroporation E16 היפוקמפוס של גור חולדה בP14) 2D-תמונה של פליטת אור B) איור 3D של C אות פליטת אור) גזור מוח עם האות D פליטת אור) מוח עם אות EPI-GFP פלואורסצנטי. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 7. פירוט של תמונת הקרינה מסעיף cryo 20 מיקרומטר של אותו מוח החולדה P14 electroporated עם פלסמיד המכיל GFP ולוציפראזוקטור, מכתים גרעינים עם DAPI; CA1-3 = קורנו Ammonis 1-3; DG = המשונן gyrus; FC = Fasciolarum cinereum.
וידאו 1. 3D אנימציה של ההיפוקמפוס electroporated עכברוש בP14.
איור 8. ערכת מבחן אמפטמין: הזרקה מי מלח ביום הראשון לפני משפט 15 דקות, 24 שעות מאוחר יותר אמפטמין הזרקה לפני הבדיקה בתא השטח הפתוח.
איור 9. מבחן אמפטמין. גרף עמודות מראים מרחק שעבר (בסנטימטרים) של בעלי החיים שתועדו על ידי מערכת TrueScan מעל 15 ברים לבנים = קבוצת ביקורת דקות;. פסים אפורים = קבוצת overexpressing DISC1; קבוצת ביקורת n = 10; קבוצת ביטוי יתר DISC1 n = 11; ANOVA: geno * p = טיפול 0.043; מבחן t למלוח זמן כולל לעומת NS אמפטמין = לא pcontrol המשמעותי = 0.172, pDISC1 = 0.001.
דיון
המחקר שלנו מוכיח כי IUE מתאים כדי ליצור חולדות מבוגרים עם נוירונים להביע transgene באזור סלקטיבית של המוח וכי, כתוצאה מהתערבות זו, בעלי חיים אלה מציגים שינויים בהתנהגות המצביעים על הפונקציונליות של המניפולציה שבוצעה. במחקר זה, כדוגמא, חולדות overexpressing DISC1 באופן חד צדדי בחלק קטן של קליפת המוח הקדם חזיתית הראו רגישות יתר כלפי אמפטמין (איור 9).
בחירת חולדות להצלחת electroporation ידי in vivo הדמיה פליטת אור הייתה יעילה בשליטה על השונות הטבועות של transfection תא IUE ויושם כדי ליצור קבוצות עם אזור IUE הומוגנית של השתנות בין נושא נמוכה לחקירות מאוחר יותר.
במחקר זה, שלא הצליחו לבחור גורי Electroporated מההמלטה על ידי זיהוי של הקרינה-Induced GFP electroporated השותף בבעלי החיים שזה עתה נולד, אפילו thoאיכס באותו הזמן ובאותה החיה אות פליטת אור של לוציפראז אותה מידת שיתוף electroporated-ניתן הייתה לזהות לאחר הזרקת וציפרין (איור 6), וה-GFP להביע נוירונים היו עדיין קיימת במוח בגיל שישה חודשים. אנו מסיקים כי, בחולדה, תגובת לוציפראז / וציפרין הוא מתאים היטב כדי לבדל את בעלי חיים עם מוח electroporated המוצלח (איור 3).
ניטור כמותי של הצלחה IUE מתייחס לעוצמת אות פליטת אור הנמדדת על ידי הספירה של פוטונים באותו זמן חשיפה (איור 3) ומתאים לפעילות האנזימטית של בלוציפראז הביע משנה. אותות פליטת אור קטנים הם לגילוי על ידי 100-200 סעיפים של פוטונים, ו, בזוהר של ~ 1,000-2,000 תאים מוכתמים GFP 1x10 4 פוטונים / sec / cm 2 / מופע steradian בהיסטולוגיה במוח החולדה בן 6 חודשים. חד פעמי האות הגבוה ביותרlayed זוהר של עד ~ 5x10 6 פוטונים / השני / / 2 סנטימטר steradian ו~ 64,000 סעיפים.
בזן העכברים ספראג Dawley משמש, צפינו היחלשות אות פליטת אור אורכים עם עלייה בגיל והאות נעלמה מעבר לגיל P35 (איור 4). בשלב זה, אנחנו לא יודעים אם גם הארעיים, ביטוי הווקטור מבוסס פלסמיד של בלוציפראז פוחת, או אם אות פליטת אור מחלישה בשל מסת הגדלת מוח, או שניהם גורמים לאות נעלמת. עבור assay הפונקציונלי קיימים בחולדות המבוגרים, מבחר למחקרים התנהגותיים שרק עשה המבוסס על מיקומו של האות, אבל לא על ידי עוצמת אות פליטת אור.
למרות שניטור פליטת אור כמותיים 3D אפשר הבחנה בין אזורי electroporated השונים (איור 5), accurateness היה מוגבל לתאים הנמצאים באגורת העומקnsion של המוח. איור 6 מראה דוגמא של electroporation בהיפוקמפוס שבו מדידת פליטת אור ב2D and 3D התמונה מצויינים מיקום טוב של electroporation. במוח שלאחר המוות גזור, אות ה-GFP-הקרינה זוהתה בערך באותו המצב כמו אות פליטת אור, המצביעה על מיקוד נכון של ההיפוקמפוס. אבל תוכניות היסטולוגיה שגם תאים בקליפת המוח הגבית של ההיפוקמפוס היו ממוקדים (איור 7). זה מצביע על כך assay פליטת אור הוא כלי שימושי כדי לזהות גורים חיוביים, IUE וגם יש לי רעיון של אזור electroporated, אבל סופו של דבר, הדמיה לא יכולה להחליף היסטולוגיה מורטם הודעה בדיוק למקם תאים ממוקדים באופן חיובי.
ההפגנה שלנו מצביעה על הבטחה ליישום של טכנולוגית IUE ליצור מניפולציות ממוקדות עדינות של אזורים במוח בקליפת המוח או בהיפוקמפוס כדי לדמות aberrances בגהגירת ortical או פגמים התפתחותיות אחרים שעשוי להשפיע על בעלי החיים המבוגרים. בעוד electroporation הבילטראליים 26 יש את היתרון של השפעה צפויה גדולה יותר על התנהגות, יש גם יותר תמותה של עוברים. electroporation חד צדדי נבחר כדי להשוות בין שתי ההמיספרות עם אחד כבקרה פנימית, כמו גם להצגה שאפילו מניפולציה IUE באזור חד צדדי, קטן מספיק כדי לשנות את ההתנהגות. שינויים הנגרמים IUE בקישוריות או בארכיטקטורה בין הנוירונים ניתן אפוא להיגרם מבלי לעורר נגע וההתאמה הנדרשת של האזור להיות-מניפולציות-IUE עם מבחן התנהגותי המתאים תלוי בשאלה המדעית.
ירי צרות
גודל המלטה מופחת ישנן מספר הצעות בנוגע להגדלת ההישרדות של גורי IUE. ראשית, השימוש בנימי זכוכית דקות מאוד במהלך electroporation כדי למזער lesio רקמהn מומלץ. שנית, לא electroporate את העובר הראשון בסוף הנרתיק של כל קרן רחם: מותו של העובר שנולד הראשון מגדיל את הסיכוי של להפיל של כל עוברים האחרים. שלישית, לאחר לידה, חולדות אימהות לעתים קרובות להרוג חלק מצאצאיהם עקב מתח סביב הלידה. על מנת להפחית את לחץ נוסף, אל תתחילו עם ההדמיה לחיות מייד לאחר לידה, אבל לחכות לשבעה ימים.
גילוי ה-GFP הקרינה של הגורים
בשבוע לאחר לידה, אין אות של הקרינה או על ידי שימוש בהדמיה מיקרוסקופית הקרינה משקפת חי או דימות פלואורסצנטי עם IVIS הספקטרום (מצבי epifluorescence וtransfluorescence; לעירור ה-GFP / פליטה: 465/520 ננומטר ו500/540 ננומטר). יתכן ששניהם, ההולכה המוגבלת של אור עירור באורך גל והפליטה קצר דרך רקמות כמו הגולגולת ורקע autofluorescence הגבוה של העור למנוע באמצעות הקרינה תחת יורדribed תנאים בחולדה. כפי שניתן לראות באיור 6, אות לוציפראז בחי יכולה גם להתגלות במוח גזור (בלי גולגולת) ושם, גם אות הקרינה ניתן לזהות (איור 6 ד ').
בידול של פליטת אור באזורים במוח צפופים
גם באיור 3D מיקומו של אזור פליטת אור לא ניתן לחזות ל100%. במיוחד תאים על גבי או מתחת לאזור חזה גם יכולים להיות ממוקדים בטעות וtransfected. המיקום המדויק צריך להיות נשלט על ידי היסטולוגיה נתיחה שלאחר המוות (הקרינה) (ראה איור 7).
גילויים
המחברים של מחקר זה אינו בעלי עניין כספי במחקר זה ולא קבלו את חסותם על ידי תעשייה למחקר זה. דמי גישה פתוחה היו שנתרמו על ידי הודעה פרסום PerkinElmer בע"מ.
תודות
המחברים מודים טרייסי יאנג-פירס וAtsushi קאמיה למתן פלסמידים.
עבודה זו מומנה על ידי נוירון Eranet לגלות או וCK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) לCK, ו( DE 792/2-4) למיסה
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>שם מגיב | |||
| תמיסת מלח פוספט (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | ללא סידן, ללא מגנזיום |
| D-לוציפרין, מלח נתרן | SynChem OHG, גרמניה | BC218 | מספר CAS: 103404-75-7 מצע לגחלילית-לוציפראז |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, ארה"ב | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 |
| D-Amphetamine | Sigma Aldrich, ארה"ב | A 5880 | CAS: 51-63-8 |
| kodan Tinktur forte | Schü lke Mayr GmbH, גרמניה | 104 005 | |
| <חזק>חומר / מוצר< / חזק> | |||
| נימי זכוכית | Sutter Instrument | Novato, קליפורניה, ארה"ב | זכוכית בורוסיליקט OD: 1 מ"מ, תעודת זהות: 0.78 מ"מ |
| חולץ פיפטה | מחט דיוויד קופף מכשירים | Tujunga, קליפורניה, ארה"ב | |
| אלקטרודה פינצטה | Nepa Gene Co., LTD. | שיויאקי, איצ'יקאווה, צ'יבה, יפן | אלקטרודות דיסק פלטינה בקוטר 7 מ"מ (CUY650P7) |
| מספריים כירורגיים - כלים מדעיים עדינים חדים | היידלברג, גרמניה | ישר, 12 ס"מ (14002-12) | |
| מלקחיים טבעתיים | כלים מדעיים עדינים | היידלברג, גרמניה | 2.2 מ"מ ID, 3 מ"מ OD (11021-12) |
| אלקטרופורטור דופק גל מרובע (CUY21SC) | Nepa Gene Co., LTD. | שיויאקי, איצ'יקאווה, צ'יבה, יפן | (CUY21SC) |
| חומר תפר כירורגי ויקריל | Ethicon | Norderstedt, גרמניה | 3-0; 2 Ph. Eur; |
| מוליך קליפ פצע | Fine Science Tools | היידלברג, גרמניה | רפלקס 9 מ"מ (12032-09) |
| מסנן מזרק | VWR | דרמשטדט, גרמניה | 0.45 μ m תאית אצטט |
| IVIS ספקטרום | קליפר מדעי החיים / פרקיןאלמר | וולת'ם, מסצ'וסטסארה"ב | |
| XGI-8 מערכת הרדמה בגז | פרקיןאלמר | וולת'ם, מסצ'וסט בארה"ב | |
| שדה פתוח | קולבורן אינסטרומנטס | אלנטאון, ארה"ב | (40 x 40 x 39 ס"מ) |
| מערכת פעילות סריקה טרו | קולבורן אינסטרומנטס | אלנטאון, ארה"ב | |
| טבלת מתכונים | |||
| Number | Buffer name | Content | הערות |
| 1 | תערובת DNA עבור DISC-1 overexpressing | 1.5 μ g/μ l pCAX humanDISC-1, 0.5 μ g/μ l pCAX-luciferase, 10x PBS (10%) צבע ירוק מהיר (0.5%) להוסיף H2O | 100 μ l מהתערובת מספיקה ל-~5 IUE |
| 2 | DNA-Mixure לשליטה | 0,75 μ g/μ l שליטה shRNA1, 0,75 μ g/μ l שליטה shRNA2, 0.5 μ g/μ l pCAX-luciferase, 0.5 μ g/μ l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) צבע ירוק מהיר (0,5%) הוסף H2O | 100 μ l של הערבוב מספיק ל ~ 5 IUE< / td> < / tr> |
| 3< / td> | צבע ירוק מהיר < / td> | 10 מ"ג / מ"ל FCF ירוק מהיר ב- ddH2< / sub>O< / td> | < / td> < / tr> |
| 4< / td> תמיסת | D-luciferin | 15 מ"ג/מ"ל D-לוציפרין, מלח נתרן ב-PBS | |
| 5 | תמיסת אמפטמין | 0.5 מ"ג/מ"ל D-אמפטמין ב-PBS |
מקורות
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236(2007).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).
- Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155(2002).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
- Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
- Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
- Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
- Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
- Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
- Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
הדפסות חוזרות והרשאות
