מאמר שיטה

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

DOI:

10.3791/50159

⸱

11 ביולי 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomics מחקר חשף את המורכבות מרשימות של proteomes אוקריוטים בפירוט חסר תקדים. עכשיו זה רעיון מקובל שבעיקר חלבונים בתאים לא קיימים כישויות בודדות אלא להפעיל את הפעילות הביולוגית שלהם בשיתוף עם הרבה חלבונים אחרים, בבני אדם עשרה או יותר, ויוצרים קווי הרכבה בתא עבור רוב אם לא את כל הפונקציות החיוניות. 1 , 2 ידע של הפונקציה והאדריכלות של מכלולי multiprotein אלה מחייב מתן שלהם באיכות מעולה ובכמות מספקת לניתוח מפורט. מיעוט של קומפלקסי חלבונים רבים בתאים, במיוחד באאוקריוטים, אוסר על חילוצם ממקורות מקומיים, ומחייב ייצור רקומביננטי. מערכת וקטור ביטוי baculovirus (BEVS) הוכיחה להיות שימושי במיוחד עבור ייצור חלבונים אוקריוטים, הפעילות אשר לעתים קרובות מסתמכת על עיבוד שלאחר translational כי מערכות ביטוי נפוצות אחרות לעתים קרובות יכולהלא תומך. 3 BEVS להשתמש baculovirus רקומביננטי שלתוכו הגן של עניין הוכנס להדביק תרביות תאי חרקים אשר בתורו מייצרים את החלבון של בחירה. MultiBac הוא BEVS כי כבר מותאם במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים המכילים יחידות משנה רבות. 4 תנאי חיוני לייצור יעיל של חלבונים והקומפלקסים שלהם הם פרוטוקולים חזקים לכל המעורבים בניסוי שביטוי אידיאלי יכול להיות מיושם כצעדים נהלים סטנדרטיים (SOPs הפעלה) ולאחר מכן גם על ידי משתמשים שאינם מומחים בקלות יחסית. פלטפורמת MultiBac בביולוגיה המולקולרית המעבדה האירופית (EMBL) משתמשת בכתיבת נהלים לכל המעורבים בניסוי ביטוי מורכב multiprotein השלבים, החל מהחדרת הגנים לתוך הגנום baculoviral מהונדס מותאם למאפייני ייצור חלבון Heterologous לניתוח בקנה מידה קטנה של החלבון דגימות הופקו. 5-8 הפלטפורמהמותקן במצב פתוח גישה בEMBL גרנובל ותמך במדענים רבים מהאקדמיה ומהתעשייה להאצת פרויקטים של מחקר מורכב חלבון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפעילות ביולוגית נשלט על ידי אסיפות של חלבונים ויומולקולות אחרות הפועלות בתיאום כדי לזרז פונקציות סלולריות. דוגמאות בולטות ניתן למנות את המנגנון שמעתיק את המידע התורשתי הכלולים בדנ"א לתוך RNA השליח. בבני אדם, יותר מ -100 חלבונים לבוא יחד בתהליך מוגדר ומוסדר לתמלל גנים, ויוצרים מתחמי multiprotein גדולים עם 10 ויותר יחידות משנה כולל RNA פולימראז II ואת גורמי השעתוק הכלליים כגון TFIID, TFIIH ואחרים. 9 דוגמאות נוספות הם הריבוזום, המורכב מהרבה חלבונים ומולקולות רנ"א, שמזרזים סינתזה של חלבון, או מורכב הנקבובית גרעין האחראית על הלוך ביומולקולות דרך מעטפת הגרעין באאוקריוטים. נתיחה ביוכימי ואדריכלית מפורטת של מהות כל מכונות multicomponent בתא היא חיונית כדי להבין את תפקידם. הבהרת המבנה של פרוקריוטים וeukarהריבוזומים yotic, למשל, היוו סימן ההיכר אירועים מניבים תובנה חסרת תקדים לתוך כמה מכונות macromolecular אלה לבצע את התפקיד המיועד שלהם בתא. 10,11

ניתן להשיג הריבוזומים באיכות ובכמות מספיקות למחקר מפורט על ידי מטהר את חומר אנדוגני מהתאים בתרבית, בשל העובדה כי עד 30% מהמסה התאית מורכבת של הריבוזומים. RNA פולימראז II הוא כבר פחות נפוץ בסדרי גודל, והרבה אלף ליטרים של תרבית שמרים הייתי צריך להיות מעובד כדי לקבל תצוגה מפורטת של האטום מורכב חיוני זה מרכזי לשעתוק. 12 רובם המכריע של מתחמים החיוניים האחרים נמצאים באולם סכומים נמוכים בהרבה בתאים מקומיים, ולכן לא יכולים להיות מטוהרים במידה מספקת ממקור חומר מקורי. כדי להבהיר מתחמים כאלה נגישים לניתוח מבני ותפקודי מפורט דורש ייצור Heterologous באמצעות te רקומביננטיchniques.

היה לי ייצור חלבון רקומביננטי השפעה גדולה על מחקר במדעי חיים. חלבונים רבים יוצרו recombinantly, והמבנה והתפקוד שלהם גזורים ברזולוציה גבוהה. תוכניות גנומיקה מבניות ניצלו ההבהרה את הגנום של אורגניזמים רבים כדי לטפל ברפרטואר מוצר הגן של אורגניזמים שלמים במצב תפוקה גבוהה (HT). אלפי מבנים חלבוניים יש בכך נקבעו. עד כה, המערכת הנפוצה ביותר prolifically לייצור חלבון רקומביננטי כבר E. coli, ומערכות ביטוי רבות פותחו ושוכללו במשך השנים לייצור Heterologous בשורה זו. פלסמידים מחסה שפע של פונקציות כדי לאפשר ייצור חלבון בE. coli למלא קטלוגים שלמים של ספקים מסחריים.

עם זאת, א ' יש coli מגבלות מסוימות שהופכות אותו מתאימה לייצור חלבונים אוקריוטים רבים ובעמ 'קומפלקסי חלבונים במפרק עם יחידות משנה רבות. לכן, ייצור חלבון במארחים אוקריוטים הפך יותר ויותר את שיטת הבחירה בשנים האחרונות. מערכת המתאימה במיוחד היטב כדי לייצר חלבונים אוקריוטים היא מערכת וקטור baculovirus הביטוי (BEVS) המסתמכת על baculovirus רקומביננטי נושא את הגנים Heterologous להדביק תרביות תאי חרקים שגדלו במעבדה. מערכת MultiBac היא BEVS פותחה לאחרונה המותאמים במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים עם יחידות משנה רבות (איור 1). MultiBac הוצג לראשונה בשנת 2004. -13 מאז השקתו, MultiBac שוכלל ברציפות והזרם בשורה כדי לפשט את הטיפול, לשפר את איכות חלבון המטרה, ובדרך כלל מה שהופך את המערכת נגישה למשתמשים שאינם מומחים על ידי עיצוב נהלי עבודה סטנדרטי (SOPs יעילים). 4 MultiBac יושם במעבדות רבות ברחבי העולם, בACademia ותעשייה. בEMBL בגרנובל, תוכניות לגישה רב לאומיים היו לשים במקום על ידי הנציבות האירופית לספק הכשרה מקצועית בפלטפורמת MultiBac למדענים, שבקשו להשתמש במערכת הייצור הזה לקידום המחקר שלהם. המבנה והתפקוד של קומפלקסי חלבונים רבים שהיו עד כה לא היו נגישים הובהרו על ידי שימוש בדגימות המיוצרות עם MultiBac. 4 בחלק הבא, את הצעדים החיוניים של ייצור MultiBac מסוכמים בפרוטוקולים כפי שהם במבצע במתקן MultiBac ב EMBL גרנובל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Recombineering טנדם (CT) ליצירת בונה ביטוי Multigene

  1. תכנון אסטרטגיית שיתוף הביטוי. גישת תכנון להחדרת גני העניין שלך לתורמי acceptors. submodules הפיזיולוגי המורכב הפוטנציאלי שלך צריך להיות מקובצים יחד על acceptors ותורמים ספציפיים. השתמש במודול כפל היקף של endonuclease ביות (HE) - זוגות BstXI לשלב קלטות ביטוי בתורם פרט ופלסמידים acceptor 7,8 ליצור את כל המבנים הרלוונטיים בסיליקון ואסטרטגיה ולאמת באופן יסודי לפני שתמשיך לעבודה ניסויית.. לדוגמה, הגנים של עניין יש לבדוק שלא מכילים הוא או אתרי הגבלה אחרים ואת הנוכחות של מסגרות קריאה פתוחות נכונות (ORFs) צריכים להיות מאומתים. לשקול הזמנת גנים סינטטיים מותאמים לשימוש קודון תא חרק ומבנה המשני mRNA כדי לשפר את רמות ייצור חלבון, כמו גם להסרת של כל exiעוקץ אתרים מהגנים של עניין. לשקול הצבת תגי טיהור המבוסס על נתונים מהספרות על N-או גמישים או חשוף C-Termini של החלבונים על פי בחירתך. לשקול יישום אסטרטגיות polyprotein שמטרה בהפקה כמה יחידות משנה חלבון במתחם שלך, אם את הכמויות היחסיות של חלבונים בודדים צריכים להיות מבוקרות עקב בעיות stoichiometry במתחם. 4 כן מפורט "כיצד לבצע" מסמך (ספר אלקטרוני מעבדה מומלץ) המכיל כל צעדי הניסוי הצפויים של הפרויקט שהובילו למבנה multigene המלא (ים). יצירת קבצים אלקטרוניים של פלסמידים התמזגו Cre-loxP למשל על ידי שימוש בתוכנת Cre-ACEMBLER אשר ניתן להוריד מדף הבית של קבוצת ברגר (multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler).
  2. הכנס הגנים של עניין שלך לתורמים ונבחריםAcceptors באמצעות אנזימי הגבלה ואנזים, או, לחלופין, על ידי שימוש בשיטות עצמאיות קשירת בעקבות פרוטוקולים שפורסמו. 5,6,14 אם יש לך גישה לטיפול נוזלי תחנת עבודה ואם אתה מתכנן מספר גדול של מבנים שיופקו ( למשל לגישות קומבינטורית) לשקול השימוש ברובוטיקה תסריטים שפותחו ומיושמים על ידי קבוצת ברגר (איור 2). 14,15 אם טיפול נוזלי תחנת עבודה אינו זמין, להפעלה ידנית באמצעות צלחות microtitre מאפשרת החדרת הגן בHT כמו אופנה.
  3. אילוצים שהוטלו על ידי הצורך לשלוט בהרכב של יחידות מהשנה הביעה להתממש. במקרה של רמות ביטוי לא מאוזנים של יחידות משנה stoichiometrically בודדות של חלבון מורכב, לשקול יישום אסטרטגיות polyprotein לconjoin כמה יחידות משנה שלך מורכב ופרוטאז ספציפי (למשל הטבק לחרוט NIA פרוטאז וירוס) בORFs גדול בודד במרווחים על ידי Sאתרי proteolytic pecific. 4,8 שקלו שיתוף עם קלטות להביע ביטוי יחידה polyproteins אחד או כמה אם יש לך מורכב מאוד גדול עם יחידות משנה רבות ונרחב הנע משקולות מולקולריות של יחידות משנה נפרדות. לשקול שיתוף להביע כמה הגנים מקודדים לחלבון באותו polyprotein או כמספר קלטות ביטוי זהות אם החלבון שמאופיין בתשואה נמוכה ייצור. 4,13
  4. לאמת את כל מבני תורם acceptor המשובטים על ידי מיפוי הגבלה (אופציונלית בתפוקה גבוהה) וסדר. המשך הפתיל שילובי התורם acceptor ידי רקומבינציה Cre-LoxP כדי ליצור את בונה ביטוי multigene של בחירה. לאמת מטוהר פלסמידים היתוך Acceptor תורם על ידי מיפוי הגבלה, השתמש רצפים אלקטרוניים שנוצרו על ידי תוכניות דומות כמו התייחסות Cre-ACEMBLER או.
  5. אחסנו מטוהרים ומאומתים תורמים, וacceptors fusions-acceptor התורם ב -20 ° C או -80 ° C. ארכיון plasmids והרצפים שלהם (Microsoft Excel, Filemaker, אחרים) בזהירות לשימוש מאוחר יותר.

2. Composite Multigene דור baculovirus, הגברה ואחסון

  1. לשלב וקטורי העברת multigene הגנום baculoviral MultiBac ע"י הפיכה לDH10 תאי מחסה הגנום הנגיפי ואת הפונקציות הנדרשות לTn7 טרנספוזיציה. שים לב שהגנום baculoviral Multibac ניתן מראש עם גנים מסוימים של עניין (YFP סמן, מלווים, וכו ') באתר שלו (LoxP הונדס לתוך הגנום הדיסטלי לאתר המצורף Tn7) על ידי בתגובת vivo Cre קדמה Tn7 אינטגרציה. 13 לאחר Tn7 טרנספוזיציה, תאים עם baculovirus מורכב המכיל את הגנים של עניין נבחרים על ידי הקרנה כחולה / לבן (תוצאות טרנספוזיציה Tn7 מוצלחות בהפסד של α-שלמה של β-גלקטוזידאז, ולכן, עם מושבות Tn7 טרנספוזיציה נכונה להישאר לבנים על סלקטיביתצלחות גאר המכילים X-גל) והוא הוכן על ידי הגנום תמוגה ואתנול / ממטרים isopropanol אלקליין. 5,6
  2. Transfection וייצור וירוס ראשוני. מקום צלחת תרבית רקמה 6 היטב לתוך מכסה המנוע סטרילית. מתרבית תאי חרקים Sf21 יומן שלב, זרע החוצה aliquots של תאים בבארות וtransfect ידי הוספת הגנום baculoviral מטוהר ומגיב transfection מעורב בתקשורת ובתרבות כפי שתואר. 6 קציר וירוס ראשוני לאחר 48-60 שעות על ידי הסרת בתקשורת ( איכות גבוהה, וירוס כייל נמוך 0 V, בדרך כלל 3 מ"ל לכל טוב). מוסף תקשורת טרי, ולבדוק לייצור חלבון (ואם סמן YFP הוא הווה, לקרינה) לאחר 2-3 ימים נוספים. 6,7
  3. הגברה של נגיף, נמוך משרד הפנים משטר. השתמש וירוס V 0 להדביק 25-50 מ"ל של תאים בשלב יומן (צפיפות תאים <1x10 6 תאים למ"ל) בקטן (100-250 מ"ל) Erlenmeyer ייקר צלוחיות נסערותעל המלשינים פלטפורמת מסלולית (איור 3). ספירת תאים ולפצל כל 24 שעות עד שתאים להפסיק הכפלה (מעצר הפצה). עקוב משטר נמוך משרד הפנים (ריבוי של זיהום כלומר מספר של חלקיקי וירוסים לכל תא): תאים חייבים להכפיל (לפחות) פעם אחת (משרד הפנים <1), אחרת יחזרו על ניסוי בהיקף קטן יותר של V 0 הוסיף. בדרך כלל, 3 מ"ל של V 0 משמשים להדביק 25 מ"ל של Sf21 תאי חרקים בצפיפות של 0.5x10 6 תאים / מ"ל. זה חיוני כדי למנוע מזיק על ההגברה ומחיקה האוטומטית של וירוס שיכול לגרום לאובדן של גני Heterologous של עניין. קציר וירוס V 1 (25-50 מ"ל) אחרי 48-60 שעות על ידי pelleting תאים והסרה של התקשורת המכיל את הנגיף. להשלים עם תקשורת ולבדוק הטריים לYFP וייצור חלבון על ידי הסרת 1x10 6 תאים בכל שעה 12 או 24, pelleting ואימות ייצור חלבון וחלבון אות סמן (YFP). 6, להגביר את הווירוס (לV 2) עוד יותר אם כרכי ביטוי גדולים יותר מכוונים על ידי הדבקה של עד 400 מ"ל בתאים 2 ליטר שייקר צלוחיות עם וירוס V 1 מכבד את משרד הפנים הנמוך מעל המשטר (תאים חייבים להכפיל לפחות פעם אחת לאחר הדבקה עם 1 V). מקפידים לבדוק את ייצור חלבון וחלבון אות סמן במהלך ההגברה, כדי למנוע הצטברות של וירוסים פגומים כבר לא מכילים את הגנים של עניין שלך. כדורי תא השתמש 5-7 צבירה בכל צעד amplifications כבר להקמת פרוטוקולים לטיהור החלבון המורכבת הביע עניין.
  4. אחסון BIIC של וירוס ייצור. אנו ממליצים בחום לאחסון וירוס V 2 כוירוס ייצור באמצעות BIIC (B-aculovirus אני nfected אני nsect ג אמות) שיטה, כדי למנוע שינויים (לדוגמא אובדן של הגן של עניין) של נגיף רקומביננטי ולשמר ביטוי גבוה רמהשל 16 תאים נגועים גלולה 24 שעות לאחר מעצרו הוא ציין - התפשטות. בתאי שלב זה מכילים חלקיקים נגיפיים שלמים רגע לפני שהם ישוחררו (בניצנים) לכלי התקשורת. הסירו תקשורת וaliquots הקפאה של התא גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן לזמן בלתי מוגבל. 7,16

3. ייצור חלבון ועיבוד במורד זרם

  1. הדבקה (r) תרבויות גדולות וYFP ניטור. השתמש 1 V, V 2 או aliquots BIIC קפוא להדביק תרביות תאים גדולות יותר לריצות ייצור (בדרך כלל 400 מ"ל ב2 צלוחיות L). לדבוק במשטר נמוך משרד הפנים (להתאים את עוצמת קול וירוס המשמש לזיהום התרבות נגועה כזה שמכפילה לפחות פעם אחת). הגדלת נפחי תרבות נגועים במידת צורך על ידי הכפלת מספר צלוחיות. אם חלבון סמן YFP הוא הווה, לסגת במרווחים מוגדרים 6 תאי 1x10, גלולה וlyse תאים ולעקוב אחר התפתחות של אות YFP עד רמה הוא הגיע indicating ייצור חלבון רקומביננטי מרבי. רמות YFP ניתן למדוד בקורא גם 96 סטנדרטי צלחת מסוגל להקליט אותות הקרינה (למשל טקאן SPECTRAFluor). קציר תאים בשלב זה. כדורי תא לאחסן ב -20 ° C (טווח קצר) או -80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך).
  2. תמוגה תא וחלוקה. Lyse תאים בשיטה האהובה עליך של בחירה, המותאמים לדרישות החלבון שלך (בהקפאת הפשרה, sonication, עיתונות צרפתית, ואחרים). Cytosol fractionate 5-7 וגרעינים ולבדוק את הימצאותם של חלבוני עניין שלך. לפתח פרוטוקולי טיהור המבוססים על התוצאות כדי לפשט טיהור חלבונים. לשקול יישום נהלי שרייה לחלץ החלבון שלך מהשבריר הגרעיני בתנאי KCl גבוהים אם החלבונים שלך מתגוררים בגרעין. 7,18
  3. טיהור חלבונים (בקנה מידה מיקרו, בקנה מידה גדול). שימו לב שלעתים קרובות כמויות קטנות (10 או 25 מ"ל) של תרבית תאים הן sufficient לקבלת כדורי תא לטיהור כמויות ניכרות של חלבוני העניין שלך בשל רמות הייצור בדרך כלל הגבוהות או גבוהות מאוד של חלבוני Heterologous במערכות הסלולריים baculovirus / חרק (לעתים קרובות 10-100 מ"ג של חלבון לכל תרבות ויותר לליטר). בשילוב עם מיקרו טיהור (multiwell צלחות, שיטות microtip, מערכת GE Healthcare ÄKTAmicro, אחרים) אפשר לקבל נתונים ביוכימיים ופעילות ולעתים קרובות גם כמות מספקת של החלבונים והמתחמים הרצויים להתגבשות תפוקה גבוהה nanoliter קנה מידה (HTX ). שקול להשתמש בטיהור זיקת מתכת (Clonetech Takara טאלון, שרפי Qiagen NiNTA מתכת chelator) ותג אוליגו-היסטידין (6-10 שאריות) ביחידות משנה חשופות של החלבון שלך מורכבות כדי להקל על טיהור, בשיתוף עם חילוף יונים וכרומטוגרפיה הדרת גודל בקטן כרכים באמצעות למשל ÄKTAmicro או מכונה טיהור דומה קטנה נפח (איור 4 ). צעדי טיהור זיקה אחרים והחלפת יונים (IEX) צעדים נוספים לטיהור הזיקה עם תגי אוליגו-היסטידין או תגיות אחרות (בחירת GST, MBP, CBP, אחרים) יכולים וצריכים להיחשב, על פי המאפיינים ביוכימיים של החלבונים של עניין והעדפותיו. קחו למשל תיוג מקטע אחד או יותר עם תגי זיקה כדי לשפר את יעילות טיהור. להתרכז קומפלקסי החלבונים המטוהרים שלך ולהקים פרוטוקולי אחסון כגון הקפאה עם או בלי גליצרול. לפתח קריטריוני בקרת איכות שניתן ליישם standardly (מבחני פעילות, בדיקות ביוכימיות וbiophysical) כדי להעריך את הווריאציה אצווה לקבוצה של החלבונים המטוהרים שלך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיתוף ביטוי חזק של חלבוני Heterologous שהושגו על ידי מערכת MultiBac מוצג באיור 1D (בדיקות שנלקחו 48 שעות לאחר הדבקת תרבית תאי השעיה). להקות חלבון overexpressed הם בבירור להבחין בכל תמצית התא (SNP) וlysate פינה (SN). האיכות והכמות של חומר החלבון המיוצר היא לעתים קרובות מספיק כדי לאפשר קביעת מבנה של קומפלקסי חלבונים, כגון mitotic המחסום המורכב MCC שמוצגת באיור 1E. 17

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וידאו Snap-יריות באיורים 2 ו -3 ממחישות את התהליך כולו מדור רובוט בסיוע מcDNA ביטוי multigene בונה את כל הדרך לזיהום של תרביות תאי חרקים לייצור חלבון. ריאגנטים חדשים (פלסמידים ווירוס) ופרוטוקולים חזקים פותחו כדי לאפשר לצינור להסתמך על כתיבת נהלים. כל הצנרת כבר מיושם כפלטפורמה טכנולוגית בEMBL בגרנובל. פלטפורמת MultiBac נצפה על ידי מדענים רבים מהאקדמיה והתעשייה העוסקים במחקר multiprotein. הגישה ההכשרה נתמכת על ידי תוכניות לגישה ייעודיות הממומנות על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IB הוא ממציא על פטנטים ובקשות לפטנטים המפרטים חלקים של הטכנולוגיה שתוארה כאן.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכריסטוף Bieniossek, סיימון Trowitzsch, דניאל פיצג'רלד, Yuichiro טאקאגי, כריסטיאן Schaffitzel, איבון Hunziker, טימותי ריצ'מונד וכל חברים בעבר ובהווה של המעבדה ברגר לעזרה ועצה. פלטפורמת MultiBac והפיתוח שלה היו ונתמכים בנדיבות על ידי סוכנויות מימון כולל שוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNSF), סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר (ANR) והמרכז הלאומי de משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS) והנציבות האירופית (EC) במסגרת תוכניות (FP) 6 ו -7. תמיכה בגישה חוצה גבולות מסופקת על ידי FP7 פרויקטי EC P-Cube (www.p-cube.eu) וBioStruct-X (www.biostruct-x.eu). המשרד הצרפתי למדע הוא הודה במיוחד לתמיכה בפלטפורמת MultiBac בEMBL דרך Investissement d'Avenir פרויקט FRISBI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bluo-GalInvitrogen15519-028 (1 גרם)
טטרציקליןEuromedexUT2965-B (25 גרם)1,000X ב-10 מ"ג/מ"ל
KanamycineEuromedexEU0420 (25 גרם)1,000X ב-50 מ"ג/מ"ל
GentamycineSIGMAG3632 (5 גרם)1,000X ב-10 מ"ג/מ"ל
IPTGEuromedexEU0008-B (5 גרם)1,000X ב-1M
Cre-recombinaseניו אינגלנד BioLabsM0298
X-Treme GENE מגיב טרנספקציה HPRoche06 366 236 001
Hyclone SFM4 InsectThermo ScientificSH 30913.02
צלחת 6 בארות פלקוןדומיניק דוטשר353046
פיפטה 2 מ"ל פלקוןדומיניק דוצ'ר357507
פיפטה 5 מ"ל פלקוןדומיניק דוטשר357543
פיפטה 10 מ"ל פלקוןדומיניק דוטשר357551
פיפטה 25 מ"ל פלקוןדומיניק דוטשר357535
פיפטה 50 מ"ל פלקוןדומיניק דוטשר357550
שפופרת 50 מ"ל פלקוןדומיניק דוטשר352070
שפופרת 15 מ"ל פלקוןדומיניק דוטשר
1.8 מ"ל Cryotube NuncDominique Dutscher55005
צלוחיות שייקר 100 מ"ל פיירקסדומיניק דוטשר211917
250 מ"ל צלוחיות שייקר פיירקסדומיניק דוטשר211918
500 מ"ל צלוחיות שייקר פיירקסדומיניק דוטשר211919
2 ליטר צלוחיות שייקר פיירקסדומיניק דוטשר
Certomat Orbital Shaker + PlateauSartorius4445110, 4445233
מיכל חנקן נוזלי dewar 35 LFisher ScientificM76801
ארון בטיחות ביולוגי מהיר יותרSodiproFASV20000606
מיקרוסקופ אופטיZeiss451207
Sf21 תאי
חרקיםתאי חרקים Hi5InvitrogenB855-02
חופש Tecan EVO המריץ Evoware בתוספתTECAN
10 μ l טיפים מוליכים (שחור),TECAN10 612 516
200 μ l טיפים מוליכים (שחור)TECAN10 612 510
שוקת חד פעמית לריאגנטים, 100 מ"לTECAN10 613 049
twin.tec PCR plate 96, חצאיתEppendorf0030 128.648
96 באר V תחתון,בז BD353263
96 צלחת עמוקה צבע טבעי, PP)FisherM3752M
PS microplate, 96 ובכן תחתון שטוחגריינר655101
96 צלחת עמוקהתרמו מדעיAB-0932
24 בלוקים באר RBQiagen19583
DpnI הגבלת אנזיםNEBR0176L20 U/uL
NEBuffer 4 10XNEBB7004S
2X phusion mastermix HFFinnzymeref F-531L
2X phusion mastermix GCFinnzymeref F-532L
DGLB 1.5Xתוצרת בית7.5% גליצרול, 0.031% ברומופנול כחול, 0.031% קסילן ציאנול FF
סולם מסת DNA גבוה עבור e-gelLife Technologies10496-016
סולם מסת DNA נמוך עבור e-gelLife Technologies10068-013
E-gel 48 1% agarose GPLife TechnologiesG8008-01
ערכת פלסמיד Nucleo Spin- רובוט-96Macherey Nagel740 708.24
PCR ערכת ניקוי, תמצית Nucleospin Robot-96Macherey Nagel740 707.2
Gotaq green master mixPromegaM7113
T4 DNA פולימראז, מוסמךLIC Novagen70099-3
DTT 100 mMתוצרת בית
אוריאה 2 מ 'תוצרת בית
EDTA 500 מ"מ pH 8.0תוצרת בית
(מילר) 500 גרםאתנה ES103
352096211921 לא סטרילי מרק LB

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  2. Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
  3. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
  4. Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
  5. Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  6. Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20(2008).
  7. Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
  8. Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
  9. Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
  10. Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
  11. Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
  12. Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
  13. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
  14. Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  15. Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
  16. Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
  17. Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
  18. Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MultiBac

מאמרים קשורים