קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Proteomics מחקר חשף את המורכבות מרשימות של proteomes אוקריוטים בפירוט חסר תקדים. עכשיו זה רעיון מקובל שבעיקר חלבונים בתאים לא קיימים כישויות בודדות אלא להפעיל את הפעילות הביולוגית שלהם בשיתוף עם הרבה חלבונים אחרים, בבני אדם עשרה או יותר, ויוצרים קווי הרכבה בתא עבור רוב אם לא את כל הפונקציות החיוניות. 1 , 2 ידע של הפונקציה והאדריכלות של מכלולי multiprotein אלה מחייב מתן שלהם באיכות מעולה ובכמות מספקת לניתוח מפורט. מיעוט של קומפלקסי חלבונים רבים בתאים, במיוחד באאוקריוטים, אוסר על חילוצם ממקורות מקומיים, ומחייב ייצור רקומביננטי. מערכת וקטור ביטוי baculovirus (BEVS) הוכיחה להיות שימושי במיוחד עבור ייצור חלבונים אוקריוטים, הפעילות אשר לעתים קרובות מסתמכת על עיבוד שלאחר translational כי מערכות ביטוי נפוצות אחרות לעתים קרובות יכולהלא תומך. 3 BEVS להשתמש baculovirus רקומביננטי שלתוכו הגן של עניין הוכנס להדביק תרביות תאי חרקים אשר בתורו מייצרים את החלבון של בחירה. MultiBac הוא BEVS כי כבר מותאם במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים המכילים יחידות משנה רבות. 4 תנאי חיוני לייצור יעיל של חלבונים והקומפלקסים שלהם הם פרוטוקולים חזקים לכל המעורבים בניסוי שביטוי אידיאלי יכול להיות מיושם כצעדים נהלים סטנדרטיים (SOPs הפעלה) ולאחר מכן גם על ידי משתמשים שאינם מומחים בקלות יחסית. פלטפורמת MultiBac בביולוגיה המולקולרית המעבדה האירופית (EMBL) משתמשת בכתיבת נהלים לכל המעורבים בניסוי ביטוי מורכב multiprotein השלבים, החל מהחדרת הגנים לתוך הגנום baculoviral מהונדס מותאם למאפייני ייצור חלבון Heterologous לניתוח בקנה מידה קטנה של החלבון דגימות הופקו. 5-8 הפלטפורמהמותקן במצב פתוח גישה בEMBL גרנובל ותמך במדענים רבים מהאקדמיה ומהתעשייה להאצת פרויקטים של מחקר מורכב חלבון.
מבוא
הפעילות ביולוגית נשלט על ידי אסיפות של חלבונים ויומולקולות אחרות הפועלות בתיאום כדי לזרז פונקציות סלולריות. דוגמאות בולטות ניתן למנות את המנגנון שמעתיק את המידע התורשתי הכלולים בדנ"א לתוך RNA השליח. בבני אדם, יותר מ -100 חלבונים לבוא יחד בתהליך מוגדר ומוסדר לתמלל גנים, ויוצרים מתחמי multiprotein גדולים עם 10 ויותר יחידות משנה כולל RNA פולימראז II ואת גורמי השעתוק הכלליים כגון TFIID, TFIIH ואחרים. 9 דוגמאות נוספות הם הריבוזום, המורכב מהרבה חלבונים ומולקולות רנ"א, שמזרזים סינתזה של חלבון, או מורכב הנקבובית גרעין האחראית על הלוך ביומולקולות דרך מעטפת הגרעין באאוקריוטים. נתיחה ביוכימי ואדריכלית מפורטת של מהות כל מכונות m....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. Recombineering טנדם (CT) ליצירת בונה ביטוי Multigene
- תכנון אסטרטגיית שיתוף הביטוי. גישת תכנון להחדרת גני העניין שלך לתורמי acceptors. submodules הפיזיולוגי המורכב הפוטנציאלי שלך צריך להיות מקובצים יחד על acceptors ותורמים ספציפיים. השתמש במודול כפל היקף של endonuclease ביות (HE) - זוגות BstXI לשלב קלטות ביטוי בתורם פרט ופלסמידים acceptor 7,8 ליצור את כל המבנים הרלוונטיים בסיליקון ואסטרטגיה ולאמת באופן יסודי לפני שתמשיך לעבודה ניסויית.. לדוגמה, הגנים של עניין יש לבדוק שלא מכילים הוא או אתרי הגבלה אחר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיתוף ביטוי חזק של חלבוני Heterologous שהושגו על ידי מערכת MultiBac מוצג באיור 1D (בדיקות שנלקחו 48 שעות לאחר הדבקת תרבית תאי השעיה). להקות חלבון overexpressed הם בבירור להבחין בכל תמצית התא (SNP) וlysate פינה (SN). האיכות והכמות של חומר החלבון המיוצר היא לעתים קרובות מספיק כדי לאפשר קביעת מבנה של קומפלקסי חלבונים, כגון mitotic המחסום המורכב MCC שמוצגת באיור 1E. 17
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
וידאו Snap-יריות באיורים 2 ו -3 ממחישות את התהליך כולו מדור רובוט בסיוע מcDNA ביטוי multigene בונה את כל הדרך לזיהום של תרביות תאי חרקים לייצור חלבון. ריאגנטים חדשים (פלסמידים ווירוס) ופרוטוקולים חזקים פותחו כדי לאפשר לצינור להסתמך על כתיבת נהלים. כל הצנרת כבר מיושם כפלטפורמה טכנולוגית בEMBL בגרנובל. פלטפורמת MultiBac נצפה על ידי מדענים רבים מהאקדמיה והתעשייה העוסקים במחקר multiprotein. הגישה ההכשרה נתמכת על ידי תוכניות לגישה ייעודיות הממומנות על .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
IB הוא ממציא על פטנטים ובקשות לפטנטים המפרטים חלקים של הטכנולוגיה שתוארה כאן.
תודות
אנו מודים לכריסטוף Bieniossek, סיימון Trowitzsch, דניאל פיצג'רלד, Yuichiro טאקאגי, כריסטיאן Schaffitzel, איבון Hunziker, טימותי ריצ'מונד וכל חברים בעבר ובהווה של המעבדה ברגר לעזרה ועצה. פלטפורמת MultiBac והפיתוח שלה היו ונתמכים בנדיבות על ידי סוכנויות מימון כולל שוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNSF), סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר (ANR) והמרכז הלאומי de משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS) והנציבות האירופית (EC) במסגרת תוכניות (FP) 6 ו -7. תמיכה בגישה חוצה גבולות מסופקת על ידי FP7 פרויקטי EC P-Cube (www.p-cube.eu) וBioStruct-X
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 גרם) | |
| טטרציקלין | Euromedex | UT2965-B (25 גרם) | 1,000X ב-10 מ"ג/מ"ל |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 גרם) | 1,000X ב-50 מ"ג/מ"ל |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 גרם) | 1,000X ב-10 מ"ג/מ"ל |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 גרם) | 1,000X ב-1M |
| Cre-recombinase | ניו אינגלנד BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE מגיב טרנספקציה HP | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| צלחת 6 בארות פלקון | דומיניק דוטשר | 353046 | |
| פיפטה 2 מ"ל פלקון | דומיניק דוצ'ר | 357507 | |
| פיפטה 5 מ"ל פלקון | דומיניק דוטשר | 357543 | |
| פיפטה 10 מ"ל פלקון | דומיניק דוטשר | 357551 | |
| פיפטה 25 מ"ל פלקון | דומיניק דוטשר | 357535 | |
| פיפטה 50 מ"ל פלקון | דומיניק דוטשר | 357550 | |
| שפופרת 50 מ"ל פלקון | דומיניק דוטשר | 352070 | |
| שפופרת 15 מ"ל פלקון | דומיניק דוטשר | ||
| 1.8 מ"ל Cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| צלוחיות שייקר 100 מ"ל פיירקס | דומיניק דוטשר | 211917 | |
| 250 מ"ל צלוחיות שייקר פיירקס | דומיניק דוטשר | 211918 | |
| 500 מ"ל צלוחיות שייקר פיירקס | דומיניק דוטשר | 211919 | |
| 2 ליטר צלוחיות שייקר פיירקס | דומיניק דוטשר | ||
| Certomat Orbital Shaker + Plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| מיכל חנקן נוזלי dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| ארון בטיחות ביולוגי מהיר יותר | Sodipro | FASV20000606 | |
| מיקרוסקופ אופטי | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 תאי | |||
| חרקיםתאי חרקים Hi5 | Invitrogen | B855-02 | |
| חופש Tecan EVO המריץ Evoware בתוספת | TECAN | ||
| 10 μ l טיפים מוליכים (שחור), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μ l טיפים מוליכים (שחור) | TECAN | 10 612 510 | |
| שוקת חד פעמית לריאגנטים, 100 מ"ל | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, חצאית | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 באר V תחתון, | בז BD | 353263 | |
| 96 צלחת עמוקה צבע טבעי, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 ובכן תחתון שטוח | גריינר | 655101 | |
| 96 צלחת עמוקה | תרמו מדעי | AB-0932 | |
| 24 בלוקים באר RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI הגבלת אנזים | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | תוצרת בית | 7.5% גליצרול, 0.031% ברומופנול כחול, 0.031% קסילן ציאנול FF | |
| סולם מסת DNA גבוה עבור e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| סולם מסת DNA נמוך עבור e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| ערכת פלסמיד Nucleo Spin- רובוט-96 | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR ערכת ניקוי, תמצית Nucleospin Robot-96 | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA פולימראז, מוסמך | LIC Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | תוצרת בית | ||
| אוריאה 2 מ ' | תוצרת בית | ||
| EDTA 500 מ"מ pH 8.0 | תוצרת בית | ||
| (מילר) 500 גרם | אתנה ES | 103 |
מקורות
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
