Assay המוליזה יכול לשמש כמסך מהיר, תפוקה גבוהה של cytocompatibility "מערכות אספקת סמים ופעילות endosomolytic למסירת מטען תאית. הבדיקה מודדת את השיבוש של קרום כדורי אדום כפונקציה של pH הסביבה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay גופיים תא דם אדום המוליזה להערכת סוכני Endosomolytic pH המגיבים למשלוח cytosolic של סמי Biomacromolecular
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
bilayers פוספוליפידים שמרכיב שלפוחית Endo-lysosomal יכול להוות מכשול למשלוח של תרופות ביולוגיות למטרות תאיות. כדי להתגבר על המכשול הזה, מספר נישאי תרופות סינטטיים כבר מהונדס באופן פעיל כדי לשבש את קרום endosomal ולספק סחורות לציטופלסמה. כאן, אנו מתארים את assay המוליזה, שיכול לשמש גם כמסך מהיר, תפוקה גבוהה ולפעילות cytocompatibility endosomolytic של מערכות אספקת סמים תאיות.
בבדיקת המוליזה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף הדגרו בחוצצים בPHS המוגדר המחקים סביבות תאיות, מוקדם endosomal, ומאוחר Endo-lysosomal. בעקבות צעד צנטריפוגה לתאי דם אדומים שלמים גלולה, כמות ההמוגלובין משתחררת למדיום נמדדה spectrophotometrically (405 ננומטר לטווח דינמי הטוב ביותר). אז שיבוש תאי הדם האדום הוא לכמת אחוזים יחסית לשליטת samp החיוביles lysed עם חומר ניקוי. במערכת מודל זה קרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית Endo-lysosomal. התוצאה הרצויה היא המוליזה זניח ב-pH הפיזיולוגי (7.4) והמוליזה חזקה בטווח pH Endo-lysosomal מכ חומציות 5-6.8.
מבוא
אמנם יש מטרות פוטנציאליות רבות השפעה גבוהה טיפוליות בתוך התא, משלוח תאיים של סוכנים מהווה אתגר משמעותי. לעתים קרובות, תרופות, בעיקר ביולוגי, הם הפנימו על ידי תאים ונסחרים בשלפוחית כי גם להוביל להידרדרות התכנים שלהם דרך מסלול Endo-lysosomal, או מועברים מדלת אחורית של התא דרך exocytosis. 1 בתהליך האחרון, pH הפנימי של השלפוחית היא acidified לכ 5-6, המהווה את ה-pH האופטימלית לפעילות של אנזימים המתפקדים בתא זה, כגון Lysozyme 2.
לאחרונה, מספר החומרים שתוכנן במיוחד כדי למנף את ההחמצה של endosomes להקל על הגשת cytosolic של המטען. אחת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה ועיקור של חוצצים וסוכני מבחן
- 150 חיץ mM NaCl: ממס 4.383 גבישים גרם NaCl ב500 מיליליטר מי nanopure.
- Buffers pH: הכן מאגרי פוספט ב-pH 5.6, 6.2, 6.8, ו -7.4 על ידי ערבוב כמויות מתאימות של monobasic ופוספט נתרן dibasic. אם דגימות שלו תיבחנה בערכים נמוכים יותר (כלומר pH pH <5.6) אז חיץ הולם יותר, כגון חיץ ציטרט, אמור לשמש. מתכוני חיץ זמינים, והתייחסות דוגמה כבר ספקה כאן 12.
- לעקר את כל המאגרים שצוינו לעיל באמצעות מנגנו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדרך כלל, את הסוכנים שמציגים התנהגות המוליטית חומציות תלויה אידיאלית יש את הפוטנציאל הגבוה ביותר למסירת cytosolic של תרופות, חומצות גרעין, או מולקולות ביו אחרות. זה בא לידי הביטוי על ידי סוכן # 1 כפי שהיא מתוארת באיור 2, אשר מציג המוליזה מינימאלי ב-pH 7.4, אך עלייה חדה בהתנהגות המוליטית בטווחי pH endosomal (<6.5). חלק מהסוכנים, עשויים להציג רמות משמעותיות של התנהגות המוליטית בטווחי pH פיסיולוגיים (סוכן # 2 ב 40 מיקרוגרם / מ"ל; איור 2),
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פולימרים המגיבים לרמת חומציות או סוכנים אחרים שנועדו לתפקוד endosomolytic יכולים להיות מוקרן במהירות וביעילות על בסיס תמוגה של תאי דם אדומים בערכי pH נתקלו בendosome (איור 1; pH 6.8 - endosome מוקדם, pH 6.2 - endosome מאוחר, pH 5.6 - lysosome). 14-17 המוליזה חומציות תלויה נעשה שימוש כדי להקרין את היכולת של ספקים לתווך שחרור endosomal של רפוי biomacromolecular (פפטידים למשל, siRNA, ODNs, חלבונים), ותוצאות של בדיקה זו יכולות להיות מנבא של ביצועים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אישור IRB: פרוצדורות הקשורות בבני אדם שאושרו על ידי מועצת המנהלים של האוניברסיטה ונדרבילט המוסדית הסקירה (IRB; פרוטוקול # 111251). אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
החוקרים מכירים במימון באמצעות משרד הגנת תוכניות בימוי congressionally מחקר רפואיים (# W81XWH-10-1-0445), מכונים לאומיים לבריאות (NIH R21 HL110056), ואיגוד לב אמריקאי (# 11SDG4890030).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer צינורות | הפישר סיינטיפיק | 22-253-145 | לאיסוף דם |
| מחטי BD Vacutainer דם אוסף, 20.5-מד | הפישר סיינטיפיק | 02-665-31 | לאיסוף דם |
| בעל / מחט מתאם Tube Vacutainer BD | הפישר סיינטיפיק | 22-289-953 | לאיסוף דם |
| BD מותג איזופרופיל אלכוהול מטליות | הפישר סיינטיפיק | 13-680-63 | לאיסוף דם |
| BD-Vacutainer אטקס חינם חוסם עורק | הפישר סיינטיפיק | 02-657-6 | לאיסוף דם |
| חומצה הידרוכלורית (conc.) | הפישר סיינטיפיק | A144-500 | להתאמה של ה-pH של D-PBS. |
| טריטון X-100 | סיגמה אולדריץ | T8787 | ביקורת חיובית |
| PBS של Dulbecco | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 יחידת סטרילי פנוי בקבוק למעלה עם מסנן SFCA ממברנה | הפישר סיינטיפיק | 09-740-44A | |
| צלחות BD 96-כן, קלקר שטוח תחתית, רקמת תרבות מטופלים | הפישר סיינטיפיק | 08-772-2C | לצלחת קריאה בסוף הבדיקה. |
| צלחות BD 96-כן, קלקר עגולים תחתיות ורקמות התרבות טופלה | הפישר סיינטיפיק | 08-772-17 | לדגירה של תאי דם אדומים עם סוכנים ניסיוניים. |
מקורות
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
