הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay גופיים תא דם אדום המוליזה להערכת סוכני Endosomolytic pH המגיבים למשלוח cytosolic של סמי Biomacromolecular

34.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50166

⸱

9 במרץ 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Institute for Nanoscale Science & Engineering, Vanderbilt University, 3Interdisciplinary Materials Science Program, Vanderbilt University, 4Monroe Carell Jr. Children's Hospital, Vanderbilt University Medical Center, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 6Department of Cancer Biology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

Assay המוליזה יכול לשמש כמסך מהיר, תפוקה גבוהה של cytocompatibility "מערכות אספקת סמים ופעילות endosomolytic למסירת מטען תאית. הבדיקה מודדת את השיבוש של קרום כדורי אדום כפונקציה של pH הסביבה.

תקציר

bilayers פוספוליפידים שמרכיב שלפוחית ​​Endo-lysosomal יכול להוות מכשול למשלוח של תרופות ביולוגיות למטרות תאיות. כדי להתגבר על המכשול הזה, מספר נישאי תרופות סינטטיים כבר מהונדס באופן פעיל כדי לשבש את קרום endosomal ולספק סחורות לציטופלסמה. כאן, אנו מתארים את assay המוליזה, שיכול לשמש גם כמסך מהיר, תפוקה גבוהה ולפעילות cytocompatibility endosomolytic של מערכות אספקת סמים תאיות.

בבדיקת המוליזה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף הדגרו בחוצצים בPHS המוגדר המחקים סביבות תאיות, מוקדם endosomal, ומאוחר Endo-lysosomal. בעקבות צעד צנטריפוגה לתאי דם אדומים שלמים גלולה, כמות ההמוגלובין משתחררת למדיום נמדדה spectrophotometrically (405 ננומטר לטווח דינמי הטוב ביותר). אז שיבוש תאי הדם האדום הוא לכמת אחוזים יחסית לשליטת samp החיוביles lysed עם חומר ניקוי. במערכת מודל זה קרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית ​​Endo-lysosomal. התוצאה הרצויה היא המוליזה זניח ב-pH הפיזיולוגי (7.4) והמוליזה חזקה בטווח pH Endo-lysosomal מכ חומציות 5-6.8.

מבוא

אמנם יש מטרות פוטנציאליות רבות השפעה גבוהה טיפוליות בתוך התא, משלוח תאיים של סוכנים מהווה אתגר משמעותי. לעתים קרובות, תרופות, בעיקר ביולוגי, הם הפנימו על ידי תאים ונסחרים בשלפוחית ​​כי גם להוביל להידרדרות התכנים שלהם דרך מסלול Endo-lysosomal, או מועברים מדלת אחורית של התא דרך exocytosis. 1 בתהליך האחרון, pH הפנימי של השלפוחית ​​היא acidified לכ 5-6, המהווה את ה-pH האופטימלית לפעילות של אנזימים המתפקדים בתא זה, כגון Lysozyme 2.

לאחרונה, מספר החומרים שתוכנן במיוחד כדי למנף את ההחמצה של endosomes להקל על הגשת cytosolic של המטען. אחת דוגמאות לגישה זו משתמשת, חלקיקי פולימר סינטטיים micelle ליבה שלהם הוא zwitterionic ותשלום ניטראלי ב pH הפיזיולוגי (כלומר 7.4). עם זאת, ב6.0 pH- 6.5, הפולימרים הפכו protonated ולרכוש מטען חיובי נטו שמערער ליבת micelle, ומגזרי הפולימרים נחשפו אינטראקציה עם ולשבש את קרום endosomal. פעילות זו הוכחה לקדם את בריחת endosomal של רפוי פפטידים וחומצות גרעין מבוסס, המאפשר להם לגשת למטרות cytosolic. 3,4 דוגמאות נוספות לשיטות שפותחו לתווך בריחת endosomal שישבש את מחסום הקרום כוללים פפטידים 'fusogenic' או חלבונים שיכולים לתווך איחוי או היווצרות נקבובית חולפת בbilayer פוספוליפידים. 5 Homopolymers של חומצות אקריליק אלקיל anionic כגון פולי (חומצת propylacrylic) הם עוד גישה למד היטב, ובפולימרים אלו, מדינת protonation של חומצת carboxylic תליון מכתיבה מעבר לידרופובי, מדינת קרום מפריע בטווחי pH Endo-lysosomal. 6,7

מערכת מודל שימושית אחד לסינון התנהגות endosomolytic היא הדוארassay x vivo החומציות התלויה המוליזה. 8 במערכת מודל זה, הקרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית ​​Endo-lysosomal. מודל הכללה זו נעשה שימוש על ידי אחרים כדי להעריך את התנהגות endosomolytic של פפטידים תא חודרים ומערכות אספקה ​​אחרות פולימריים גנים. 8-11 בניסוי זה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף מודגרות-בחוצצים בPHS המוגדר המחקים תאיות (7.4), מוקדם endosomal (6.8), ומאוחר Endo-lysosomal (<6.8) הסביבות. כמות ההמוגלובין שפורסם במהלך תקופת הדגירה היא לכמת כמדד לתמוגה תאי דם אדומה, שמנורמלת לכמות ההמוגלובין פרסמה בדגימות בקרה חיוביות lysed עם חומר ניקוי.

מהקרנת ספרייה קטנה של חומרי בדיקת הפוטנציאל endosomolytic, ניתן להסיק כי דגימות שמייצרות לא המוליזה ב-pH 7.4, אבל שולים גבוהים באופן משמעותיolysis ב-pH <6.5, יהיה המועמדים היעילים וcytocompatible ביותר עבור משלוח סמים cytosolic. חומרים המתאימים לקריטריונים אלו יהיו צפויים להישאר אדישים ולא להרוס ללא הבחנה קרומי bilayer שומנים (כלומר שעלולה לגרום cytotoxicity) עד שנחשף לירידה ברמת החומציות המקומית בעקבות הפנמה לתאי אנדו-lysosomal.

בפרוטוקול זה, אריתרוציטים מבודדים מתורם אנושי ושיתוף מודגרות-ב-pH 5.6, 6.2, 6.8, או 7.4 עם סוכני משלוח ניסיוניים endosomolytic סמים. אריתרוציטים שלמים pelleted, וsupernatants (המכיל המוגלובין שוחרר מאריתרוציטים lysed) מנותח לספיגה האופיינית למוגלובין באמצעות קורא צלחת (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה ועיקור של חוצצים וסוכני מבחן

  1. 150 חיץ mM NaCl: ממס 4.383 גבישים גרם NaCl ב500 מיליליטר מי nanopure.
  2. Buffers pH: הכן מאגרי פוספט ב-pH 5.6, 6.2, 6.8, ו -7.4 על ידי ערבוב כמויות מתאימות של monobasic ופוספט נתרן dibasic. אם דגימות שלו תיבחנה בערכים נמוכים יותר (כלומר pH pH <5.6) אז חיץ הולם יותר, כגון חיץ ציטרט, אמור לשמש. מתכוני חיץ זמינים, והתייחסות דוגמה כבר ספקה כאן 12.
  3. לעקר את כל המאגרים שצוינו לעיל באמצעות מנגנון בקבוק עליון ואקום סינון ומחדש לבדוק pH של חיץ.
  4. 20% טריטון X-100 (ביקורת חיובית): מערבבי 20 מ"ל טהור טריטון X-100 ב 80 מיליליטר מי nanopure. מערבולת במרץ וsonicate לפזר. השאר בטמפרטורת חדר למשך לילה לפני השימוש.

2. הכנת אריתרוציטים

  1. השג 25 מ"ל של הדם frאום תורם אנונימי אנושי, נשאב היישר לתוך K צינורות Vacutainer 2-EDTA מצופים למניעת קרישה.

הערה: כל הנהלים יש לקבל אישור מראש על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי המתאים (IRB), וvenipuncture ואיסוף דם חייב להיעשות על ידי phlebotomist מיומן כדי למזער את הסיכון לתורם. נהלי phlebotomy סטנדרטיים כבר פורסם במקום אחר 13.

  1. צנטריפוגה דם ב 500 XG למשך 5 דקות, ורמות אות המטוקריט (אדום, שכבה תחתונה) ופלזמה (שכבה צהבהבה, עליונה) בצינור.
  2. לשאוב בעדינות דרך פלזמת micropipettor, להוסיף לאקונומיקה, והשלך לפסולת ביולוגית מסוכנת.
  3. מלא צינור המטוקריט לקו מסומן (רמה המקורית של פלזמה) עם פתרון NaCl 150 מ"מ. כובע ולהפוך כמה פעמים בעדינות לתערובת. צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5 דקות.
  4. חזור על שלב 2.3-2.4 לשטוף תאי דם שוב. אז לשאוב supernatנמלה ולהחליף עם PBS ב-pH 7.4. הפוך לערבב.
  5. פיצול דם באופן שווה לארבעה צינורות, מתאים לכל רמת חומציות שתיבחן. תייג את הצינורות על פי כל pH שנבדק (5.6, 6.2, 6.8, 7.4).
  6. צנטריפוגה צינורות דם ב 500 XG למשך 5 דקות. סמן רמות על צינורות, ואז לשאוב supernatant.
  7. ממלא כל צינור לקו מסומן בחיץ של pH המתאים (כמצוין ב2.6).
  8. 4 50 צינורות חרוטי מ"ל ייבל (אחד בכל רמת חומציות למבחן), ו49 מ"ל של PBS pipet של pH המתאים לכל צינור חרוטים.
  9. הוסף 1 מ"ל של אריתרוציטים (אותו pH) לתוך צינור מקביל ל1:50 דילול. חזותי לבדוק את הדם בדילול המלא, אשר אמור להיות עכור ויסתפק אם נותר באין מפריע. אם אין טפסי גלולה, תאים לי lysed.

3. התקנת תמוגה Assay 96 ובכן פלייט וכימות

  1. הכינו פתרוני מניות של כל סוכני אספקת התרופה הניסיוניים, ב20x הריכוז הסופי הרצוי להיבדק (Assayייקח 10 μl של סוכן משלוח סמים + 190 תאי μl מדולל דם אדום, שהובילו לדילול 1/20 של סוכן משלוח התרופה המקורי לתוך תערובת המבחן הסופית). מניות של 20, 100, ו 800 מיקרוגרם / מ"ל ​​מוצעות, וכתוצאה מריכוזי בדיקה סופיות של 1, 5, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה.
  2. 10 μl Pipet של כל פתרון למניית V-תחתון צלחות 96-כן. לקבלת תוצאות אופטימליות, טען כל דגימה בשלושה עותקים או ארבע פעמים.

הערה: על מנת להקל, מומלץ שצלחת נפרדת 96-גם צריכה להיות מוכנה לכל pH שנבדק, עם כל מדגם (בכל ריכוז) נטען בn = 3-4 לצלחת.

  1. לבארות בקרה חיוביות, להוסיף 10 μl של טריטון 20% X-100.
  2. לבארות בקרה שליליות, להוסיף 10 μl של חיץ פוספט. השתמש במאגר באותו pH שנבדק.
  3. 190 μl Pipet של אריתרוציטים המדוללים (ראה 2.10) לכל באר, מה שהופך פתרון מניות תא בטוח נשארהומוגנית במהלך העברה. רמז: שימוש מרובים ערוצים פיפטה כדי לפשט משימה זו.
  4. דגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת (אופציונלי: השתמש בהקפה ייקרה או נדנדה).
  5. צנטריפוגה צלחות עבור 5 דקות ב 500 XG לאריתרוציטים השלמים הגלולה. הערה: בעת הסרת הצלחת מצנטריפוגה והובלתו לשלב הבא, יש לטפל בזהירות ולהיות בטוחים שלא לשבש את התא הגלול.
  6. שימוש pipet רב, להעביר 100 μl של supernatant מכל באר לתוך צלחת ברורה, עם תחתית שטוחה 96-כן. הערה: אם תא הגלולה מופרת בטעות לכל דוגמה (ו), אפשר מחדש סרכזת צלחת ולאחר מכן להמשיך בהעברת supernatant.
  7. מדוד ספיגת supernatants עם קורא צלחת. שים לב שטווח של אורכי גל יכול לשמש (400-541 ננומטר).

הערה: קוראי צלחת שונים עשויים להיות נקודות רוויות ורגישויות שונות, ולכן הבחירה של אורך גל עבוריasurements תלויה אם או לא נתוני המוליזה מדגימות ניסיוניות ניתן מנורמלים אמינים נגד המוליזה מרבי הנגרמים על ידי טיפול חומר ניקוי. זה דורש מדידה מדויקת של ערכי ספיגה של דגימות בקרה החיוביות.

  1. השימוש ב-Microsoft Excel או תוכנת ניתוח נתונים דומה, מוצא את הממוצע של קריאות ספיגת הרקע מן דגימות בקרה השליליות להגדיר עבור כל רמת חומציות (שלב 3.4). לחסר ערך ספיגה זה רקע מכל המדגמים האחרים שנמדדו שבדרגת החומציות.
  2. לאחר רקע חיסור, למצוא את הספיגה הממוצעת של השליטה החיובית דגימות חומר ניקוי שטופל (שלב 3.3). אז לנרמל את כל נקודתי נתונים הניסיוניות לשווי ספיגה זה אומר, שאמור לייצג המוליזה של 100%. לבסוף, יש להכפיל כל ערך גם על ידי 100% כדי לחשב המוליזה% שחלו בכל פרט ופרט גם ביחס לשליטת חומר הניקוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדרך כלל, את הסוכנים שמציגים התנהגות המוליטית חומציות תלויה אידיאלית יש את הפוטנציאל הגבוה ביותר למסירת cytosolic של תרופות, חומצות גרעין, או מולקולות ביו אחרות. זה בא לידי הביטוי על ידי סוכן # 1 כפי שהיא מתוארת באיור 2, אשר מציג המוליזה מינימאלי ב-pH 7.4, אך עלייה חדה בהתנהגות המוליטית בטווחי pH endosomal (<6.5). חלק מהסוכנים, עשויים להציג רמות משמעותיות של התנהגות המוליטית בטווחי pH פיסיולוגיים (סוכן # 2 ב 40 מיקרוגרם / מ"ל; איור 2),

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פולימרים המגיבים לרמת חומציות או סוכנים אחרים שנועדו לתפקוד endosomolytic יכולים להיות מוקרן במהירות וביעילות על בסיס תמוגה של תאי דם אדומים בערכי pH נתקלו בendosome (איור 1; pH 6.8 - endosome מוקדם, pH 6.2 - endosome מאוחר, pH 5.6 - lysosome). 14-17 המוליזה חומציות תלויה נעשה שימוש כדי להקרין את היכולת של ספקים לתווך שחרור endosomal של רפוי biomacromolecular (פפטידים למשל, siRNA, ODNs, חלבונים), ותוצאות של בדיקה זו יכולות להיות מנבא של ביצועים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אישור IRB: פרוצדורות הקשורות בבני אדם שאושרו על ידי מועצת המנהלים של האוניברסיטה ונדרבילט המוסדית הסקירה (IRB; פרוטוקול # 111251). אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

החוקרים מכירים במימון באמצעות משרד הגנת תוכניות בימוי congressionally מחקר רפואיים (# W81XWH-10-1-0445), מכונים לאומיים לבריאות (NIH R21 HL110056), ואיגוד לב אמריקאי (# 11SDG4890030).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer צינורות הפישר סיינטיפיק 22-253-145 לאיסוף דם
מחטי BD Vacutainer דם אוסף, 20.5-מד הפישר סיינטיפיק 02-665-31 לאיסוף דם
בעל / מחט מתאם Tube Vacutainer BD הפישר סיינטיפיק 22-289-953 לאיסוף דם
BD מותג איזופרופיל אלכוהול מטליות הפישר סיינטיפיק 13-680-63 לאיסוף דם
BD-Vacutainer אטקס חינם חוסם עורק הפישר סיינטיפיק 02-657-6 לאיסוף דם
חומצה הידרוכלורית (conc.) הפישר סיינטיפיק A144-500 להתאמה של ה-pH של D-PBS.
טריטון X-100 סיגמה אולדריץ T8787 ביקורת חיובית
PBS של Dulbecco Invitrogen 14190
Nalgene MF75 יחידת סטרילי פנוי בקבוק למעלה עם מסנן SFCA ממברנה הפישר סיינטיפיק 09-740-44A
צלחות BD 96-כן, קלקר שטוח תחתית, רקמת תרבות מטופלים הפישר סיינטיפיק 08-772-2C לצלחת קריאה בסוף הבדיקה.
צלחות BD 96-כן, קלקר עגולים תחתיות ורקמות התרבות טופלה הפישר סיינטיפיק 08-772-17 לדגירה של תאי דם אדומים עם סוכנים ניסיוניים.

מקורות

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
  2. Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
  3. Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
  4. Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
  5. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  6. Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
  7. Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
  8. Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
  9. Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
  10. Behr, J. -P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
  11. Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. Data for Biochemical Research. , 3rd, Oxford University Press. (1986).
  12. Ernst, D. J. Applied Phlebotomy. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).
  13. Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
  14. Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
  15. Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
  16. Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
  17. Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
  18. Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
  19. Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
  20. Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
  21. Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
  22. Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
  23. Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
  24. Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הובלה תאית של תרופות לציטוזולהפרעה לממברנה אנדוזומליתמדידת שחרור המוגלוביןאנליזה ספקטרופוטומטריתבקרת Triton XpH פיזיולוגי 7.4טווח pH אנדוזומליסריקת נשאי תרופות
Assay גופיים תא דם אדום המוליזה להערכת סוכני Endosomolytic pH המגיבים למשלוח cytosolic של סמי Biomacromolecular
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.