הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

30.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50168

⸱

14 באוקטובר 2013

 ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

במאמר זה

סיכום

שיעור צמיחת תאים הוא תהליך מוסדר וקובע עיקרי של פיזיולוגיה של תא. culturing הרציף באמצעות chemostats מאפשר שליטה חיצונית של שיעור צמיחת תאים על ידי הגבלה תזונתית להקל על הלימוד של רשתות מולקולריות השולטות צמיחת תאים וכיצד רשתות אלה להתפתח כדי לייעל את צמיחת תאים.

תקציר

תאים לווסת את קצב צמיחה שלהם בתגובה לאותות מהעולם החיצוני. כתא גדל, תהליכים תאיים שונים חייבים להיות מתואמים ביניהם סינתזת macromolecular, חילוף חומרים וסופו של דבר, מחויבת למחזור חלוקת תא. Chemostat, שיטה של ​​ניסוי שליטה שיעור צמיחת תאים, מספקת אמצעי רב עוצמה של שיטתי לומד כיצד תהליכים תאיים משפיע שיעור צמיחה - הכוללים ביטוי גנים וחילוף חומרים - ורשתות רגולטורים ששולטות בקצב גדילת תאים. כאשר נשמר במשך מאות דורות chemostats יכול לשמש כדי לחקור אבולוציה אדפטיבית של חיידקים בתנאים סביבתיים המגבילים את צמיחת תאים. אנו מתארים את העיקרון של תרבויות chemostat, להדגים את פעולתם ולספק דוגמאות של היישומים השונים שלהם. לאחר תקופה של חוסר שימוש לאחר כניסתה שלהם באמצע המאה העשרים, ההתכנסות של מתודולוגיות הגנום בקנה מידה עם מחודשת בterest בויסות גדילת תאים ואת הבסיס המולקולרי של אבולוציה אדפטיבית הוא מגרה רנסנס בשימוש בchemostats במחקר ביולוגי.

מבוא

הצמיחה של תאים מווסתות על ידי רשתות מורכבות של האינטראקציה 1,2 גורמים גנטיים וסביבתיים. הרגולציה multifactorial של צמיחת תאים מחייבת גישה ברמת מערכת למחקר שלה. עם זאת, המחקר הקפדני של צמיחת תאים מוסדרת הוא קרא תיגר על ידי הקושי בניסוי שליטה על הקצב שבו תאים לגדול. יתר על כן, אפילו בניסויים הפשוטים תנאים תאיים הם לעתים קרובות דינמיים ומורכבים כמו תאים ברציפות לשנות את הסביבה שלהם כמו שהם מתרבים. פתרון לבעיות אלו מסופק על ידי chemostat: שיטה של ​​culturing תאים המאפשרת שליטת ניסיוני של שיעורי צמיחת תאים בסביבות מוגדרות, בלתי משתנה ומבוקרות.

השיטה של תרבית רציפה באמצעות chemostat תוארה באופן עצמאי על ידי מונה 3 ונוביק & 4 סילארד ב1950. כמו נולד במקור, תאים גדלים בנפח קבוע של תקשורת שהוא קוןדילול tinually על ידי תוספת של מדיה חדשה וההסרה בו זמנית של אמצעי תקשורת ותאים ישנים (איור 1). משוואות דיפרנציאליות רגילות יחד (איור 2) מתארות את שיעור השינוי בתא צפיפות (x) ואת הריכוז של חומר מזין הגבלת צמיחה (ים) בכלי chemostat. חשוב מכך, מערכת זו של משוואות צופה בודד (שאינו אפס) יציב מצב יציב (איור 3) עם המשמעות יוצאת דופן, כי במצב יציב, קצב הגידול הספציפי של התאים (כלומר קבוע שיעור צמיחה מעריכית) שווה לשיעור שבתרבות בדילול מלא (ד '). על ידי שינוי שיעור דילול זה אפשרי להקים אוכלוסיות מצב יציב של תאים על שיעורי צמיחה שונים ובתנאים שונים של הגבלה תזונתית.

השליטה הניסיונית של שיעור צמיחה באמצעות chemostats הייתה קריטית להתפתחות של הבנה של אופן ששינויים בפיזיולוגיה של תאיםעם שיעורים של 5,6 צמיחה. עם זאת, עמוד התווך לשעבר זה של שיטות מיקרוביולוגיות הפך מעורפל יותר ויותר במהלך הפיצוץ במחקר בביולוגיה מולקולרית בשלהיי המאה העשרים. כיום, עניין מחודש בצמיחת שליטה בשני חיידקים ויצורים רב תאיים וכניסתו של שיטות הגנום בקנה מידה לניתוח ברמת מערכות חידש מוטיבציה לשימוש בchemostats. כאן, אנו מתארים שלושה יישומים שמנצלים את השליטה המדויקת של שיעורי צמיחת תא והסביבה החיצונית, כי הם ייחודי אפשריים באמצעות chemostats. ראשית, אנו מתארים את השימוש של chemostats לחקור כיצד השפע של אלפי ביומולקולות - כגון תמלילים ומטבוליטים - מוסדרים מתואם עם קצב צמיחה. שנית, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש chemostats לקבל אומדנים מדויקים של הבדלי צמיחה בשיעור שבין גנוטיפים שונים בסביבות מוגבלות תזונתיים באמצעות ניסויי תחרות. שלישית, אנו מתארים כיצד chemostats יכוללשמש כדי לחקור אבולוציה אדפטיבית של תאים גדל בסביבות תזונתיות ירודה קבועים. דוגמאות אלה ממחישים את הדרכים שבהן chemostats מאפשרות לחקירות ברמת מערכות של רגולציה צמיחת תאים, גן על ידי אינטראקציות סביבה והתפתחות אדפטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עיקרון culturing הרציף באמצעות chemostat יכול להתממש במגוון רחב של יישומים. בכל chemostats זה חיוני שיהיה לי 1) שיטות לשמירה על סטריליות של כל הרכיבים, 2) תרבות מעורבת היטב, 3) אוורור מתאים של כלי התרבות ו4) אמצעי אמין של תקשורת ובנוסף הסרת התרבות. כאן, אנו מתארים את השימוש של bioreactor Sixfors (INFORS Inc) כchemostat תוך שימוש בשיטות שניתן להתאים בקלות להגדרות חלופיות.

1. להרכבת כלי שייט Chemostat

  1. הפעל את Sixfors באמצעות המתג הראשי.
  2. לשטוף ביסודיות את כלי chemostat, הרכבה בוחש, וצינורות מחוברים עם מים deionized (DI). בדוק את כל צינורות וO-טבעות ולהחליף את כל חלקים שחוקים מחפש.
  3. ודא שבסיס תמיכת פיר הכונן פונה כלפי מעלה בכלי הזכוכית, ושחלקו העליון של פיר הכונן היא התפרצה לדיור שלה בהרכבת הבוחש. הגדר את stirreההרכבה r לתוך כלי הזכוכית להבטיח את החלק התחתון של פיר הכונן יושבת בתמיכת פיר כונן. השתמש במהדק כדי לחזק את מערך stirrer לכלי הזכוכית.
  4. למלא את הכלי עם כ 300 מיליליטר של מים די.
  5. הסר את הפקקים מחמצן מומס (DO 2) בדיקה ובדוק את מפלס האלקטרוליט ידי שחרור המעטפת התחתונה ולוודא כי המעטפת התחתונה מלאה באמצע הדרך עם תמיסת אלקטרוליט. Rescrew המעטפת התחתונה ולהכניס לתוך הנמל בספינת chemostat. בורג עד הדוק אצבע.
  6. קח את הבדיקה ה-pH ולהסיר אותו מהמאגר שלה אחסון (3 M KCl). הסר את מכסה הבדיקה ה-pH ולצרף fermentor 1. שימוש במסך שליטת Sixfors, לנווט לתפריט פרמטר fermentor ובחר באפשרות "לכייל pH". מניחים את חללית ה-pH לחיץ pH 7 סטנדרטי ושיא קריאה כגבוה קראו. חזור על פעולה עם ה-pH 4 חיץ ושיא קריאה כנמוך קראו. לנתק את הבדיקה ה-pH מfermentor, לשטוף עם מים די והכנס את int הבדיקהo היציאה בכלי chemostat. בורג עד הדוק אצבע.
  7. מניחים את כלי chemostat במעמד. הערה על הספינה שfermentor (1-6) הבדיקה ה-pH הייתה קשורה ולמכוילת. מניחים את כובע הבדיקה pH בבדיקת ה-pH. חוזקה באמצעות נייר כסף לכסות את החלק העליון של החללית לעשות 2.
  8. מקפלים נייר כסף מעל הקצוות של צינורות מחוברים לכלי שיט chemostat.
  9. חזור על שלבים 1.2-1.8 לכל כלי.
  10. לעקר את כלי על ידי המעוקר ל15 דקות על מחזור נוזלי.

2. הכנת מדיה

  1. להקים את מגוון הגבלה של ריכוזים לתזונתיים על ידי גידול תרביות אצווה בריכוזי חומרי הזנה שונים. מזין הוא הגבלה בטווח שבו צפיפות התא הסופית היא פונקציה לינארית של ריכוז החומר המזין הראשוני (איור 4). בחר ריכוז תזונתי גם בתוך הטווח המגביל. דוגמאות להרכב תקשורת סטנדרטית ללימודים עם Saccharomycecerevisiae של זמין ב7-11.
  2. החיטוי בקבוק ריק שהוא הכתיר עם תקע גומי המכיל כניסת אוויר וכלי תקשורת לאחר שווידאת הראשונה כי בסופו של צינור התקשורת מכוסה בנייר כסף.
  3. בכלי נפרד להכין 10 L של מדיה.
  4. צרף כוס מסנן 500 מיליליטר לבקבוק 100 תקשורת מיליליטר. הסר את מסנן הכותנה עם מלקחיים המעוקרים באתנול ומייד לצרף את נמל הסינון על בקבוק התקשורת.
  5. צרף את בקבוק התקשורת למקור ואקום ומסנן לעקר תקשורת ידי הוספתו לכוס המסנן.
  6. כאשר הסינון של תקשורת הוא מוחלט, לסגור את נמל הסינון עם מהדק מתכת.

3. כיול לעשות 2 בדיקות והגדרת Chemostat

  1. לאחר כלי chemostat כבר autoclaved ואפשרו להתקרר מקום הכלי במעיל החום המתאים לו. חבר את הבדיקה הטמפרטורה, הבדיקה ה-pH, ולעשות 2 חללית. בואוכלי לשבת עם העצמה בלפחות 6 שעות כדי לאפשר 2 בדיקות לעשות כדי לקטב.
  2. מניחים את הקצה של כל צינור שפכים לקיבול איסוף נפרד. חבר את אספקת האוויר באמצעות מסנן autoclaved ולהפעיל את זרימת אוויר. המים בכל כלי צריכים לזרום החוצה מצינורות השפכים, אשר מציין כי כל החותמות נוצרות כראוי.
  3. התאם את גובה צינור השפכים בהתאם להיקף העבודה הרצוי (למשל 300 מיליליטר). אנו משתמשים בסרגל שמסומן עם מיקומי צינור מכוילים לנפחי עבודה שונים.
  4. חבר את בקבוק המדיה לכלי שיט chemostat. השימוש באתנול כדי לשמור על הצינור מסתיים סטרילי ככל האפשר. השחל את צינור המשאבה דרך המשאבה והמהדק פתוח. באופן ידני לחץ על המשאבה עד שהתקשורת מתחילה לזרום לתוך כלי chemostat. לשחרר צינורות ממשאבה, תקשורת צריכה לזרום בחופשיות לתוך כלי chemostat. כאשר התקשורת מגיעה לצינור השפכים, חבור מחדש צינורות לשאיבה ולצבוט.
  5. התחל running התכנית הבסיסית עם סט גלגל מניע ל400 סל"ד והטמפרטורה שנקבעה ב30 ° C.
  6. על מנת לכייל את 2 בדיקות לעשות, לכבות את אספקת אוויר ולעבור לשימוש בגז חנקן. חכה לפחות שעה אחת וערך מדד שיא כמו "נמוכה לקריאה". לעבור בחזרה לאספקת אוויר (כלומר המכילה ריכוז חמצן סביבה), לחכות לפחות שעה אחת נוספת ומדידת שיא כמו "גבוהה לקריאה".
  7. ליזום הקלטת נתונים באמצעות תוכנת איריס.

4. חיסון

  1. השתמש 70% אתנול לעקר החלק העליון של כלי התרבות.
  2. הסר את הבורג על גבי כלי שיט ופיפטה 1 מיליליטר של תרבות לילה לתוך כלי chemostat. הדק מחדש את בורג.
  3. לציין את הזמן של חיסון באיריס.
  4. המתן כ24 שעות לתרבויות להגיע לשלב נייח מוקדם. כתרבות גדלה, חמצן וחומציות מומסים יקטנו. במקרה של תקשורת הגבלת גלוקוז, חמצן מומס יחזור בPHA נייח ~ 100%se. למגבלות תזונתיים אחרות חמצן מומס יישאר <100% בשלב נייח.

5. ייזום משאבות והשגת מצב יציב

  1. שיעור הדילול מחושב על ידי חלוקת קצב הזרימה (עד כמה תקשורת זורמת לתוך הכלי לשעה) על ידי תרבות הנפח. לדוגמא, שימוש בנפח של 300 מיליליטר שיעור דילול של 0.1 אומר ש30 מיליליטר של תקשורת מתווסף לתרבות בכל שעה. מכיוון שהמערכת נמצאת בלחץ חיובי באותו הנפח הוא להסיר את הכלי להבטיח שהתרבות היא מדוללת ברציפות. מגוון רחב של שיעורי דילול (ד ') ניתן להשתמש שלא יעלה על השיעור המרבי הצמיחה (מקסימום μ) של התאים, ומעליו התא יהיה דהוי של chemostat.
  2. בחר הגדרות משאבה, אשר מפרט את מספר שניות שהמשאבה היא לסירוגין, כדי לבסס את קצב הזרימה הרצויה. המשאבה מספקת תקשורת בשיעור של ~ 0.11 מיליליטר / שנייה.
  3. הגדרת תכנית באמצעות int Sixforserface המציין את תזמון המשאבה, טמפרטורה ומהירות impellor. הפעל את התכנית.
  4. רוקן את מכלי האיסוף של נוזל ולהקליט את הזמן.
  5. אחרי לפחות שעות, השתמש גליל סיים למדוד כמה תקשורת הוסרה מהכלי. זה יהיה שווה את הנפח שנוסף לכלי שיט chemostat. לחשב את שיעור הדילול (D = השפכים V / V תרבות / שעה). התאם את הגדרות משאבה אם שיעור דילול מחושב אינו תואם את שיעור דילול הרצוי.
  6. במצב יציב, צפיפות תאים בchemostat אינה משתנה לאורך זמן. זו ניתן למדוד ללא מביך את התרבות על ידי דגימת יצוא. אנו מבצעי מגדירים השגת המצב יציב כמדידות צפיפות תאים זהות שמופרדות על ידי הכפלת אוכלוסייה אחת לפחות. להגיע למצב יציב ייקח כשמונה דורות תרבות לאחר תחילת דילול התרבות. במצב יציב, תאים גדלים באופן מעריכי (I.דואר. קצב קבוע צמיחה לאורך זמן) בתנאים מוגבלים בחומרים מזינים. זמן ההכפלה של האוכלוסייה (זמן דור) הוא ln (2) / D.
  7. המשך למדוד מעת לעת כמויות שפכים לתקופת הניסוי, כדי להבטיח ששיעור דילול קבוע נשמר.

6. תאי לימוד גידול בשיעורים שונים בתנאי מצב יציב: יישום 1

  1. במצב יציב בchemostat, קצב הגידול של האוכלוסייה של תאים הוא שווה לשיעור הדילול. באופן שיטתי לשנות את שיעור הדילול שניתן לגדל תאים בשיעורים שונים. זה מאפשר הלימוד השיטתי של פרמטרים פיסיולוגיים המשתנים בקצב צמיחה הכולל נפח תא, שלב מחזור התא והתנגדות ללחץ. בנוסף, פרופילי מצב יציב של mRNA הגלובלי, חלבון ורמות המטבוליט ניתן assayed בתאים הולך וגדל בקצב שונה. ישנן שתי דרכים לרכישת דגימות:
  2. דגימות קטנות יכולות להיות פסיבי obמזרקה על ידי הצבת סוף צינור השפכים לצינור מיליליטר 1.5 מיליליטר או 15. ניתן להשיג מדגם של 1-5 מ"ל בכמה דקות (תלוי בקצב הזרימה). ניתן למדוד פרמטרים פיסיולוגיים רבים מדוגמאות אלה.
  3. ניתוחי ביטוי גנים, או המטבוליט דורשים דגימות גדולות יותר, כי יש לקבל מהר ככל האפשר. מניחים את הקצה של צינור השפכים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. שחרר את הבורג מחזיק את קצה המתכת של צינור השפכים ולדחוף למטה בעדינות. ~ 10 מדגם מיליליטר במהירות ימלא הצינור שלך. יש לזכור כי הנפח בכלי chemostat השתנה. אם רבות דגימות רצופות נלקחות זה עשוי להיות נחוץ כדי להפחית את הזרימה כדי לשמור על שיעור דילול מתמיד.

7. יישום 2: מדידה מדויקת של הבדלים בשיעורי צמיחה בין גנוטיפים בסביבות מבוקרות באמצעות מבחני תחרות מבוססות Cytometry הזרימה

  1. Chemostats יכול לשמש כדי לכמת את ההשפעה של ריכוז חומר מזין באופן מדויקעל הבדלים בשיעורי צמיחה (כלומר כושר) בין רקע גנטי שונה. על ידי זני שיתוף culturing שכותרתו עם חלבוני ניאון שונים שיעור השינוי בשפע יחסי בגידול מעריכי נקבע. ביצוע assay זה בשיעורים שונים דילול (D) מאפשר הלימוד של השפעות של ריכוז חומר מזין (ים) על הבדלי כושר.
  2. להקים תרבויות מצב יציבה של שני הזנים בכלי chemostat נפרדים עם שיעורי דילול זהים ונפח של 300 מיליליטר.
  3. באופן פסיבי לדוגמא 1 מיליליטר מכל כלי. ספין למטה תאים, resuspend ב פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ומקום ב 4 ° C. דגימות אלה מכילות דגימות תאים הומוגנית, שהם שולט על ניתוח התזרים cytometry שלאחר מכן.
  4. מניחים את צינור השפכים מכלי שיט אחד לautoclaved גליל סיים. שחרר את הבורג מחזיק את קצה המתכת של צינור השפכים ובעדינות לדחוף למטה לגרש תאים מchemostat. כאשרהנפח מגיע 150 מיליליטר, להחזיר את סוף המתכת של צינור השפכים למיקום המקורי שלה (300 מיליליטר). חזור עם הכלי השני, באמצעות גליל סיים שונה.
  5. השתמש 70% אתנול כדי לשמור על סטריליות בעת הסרת בורג בחלק העליון של כלי chemostat. מניחים משפך בפתיחה ויוצקים 150 מיליליטר מהתרבות אחרת לתוך כלי chemostat. הדק מחדש את בורג. חזור עם הכלי השני, תוך שימוש במשפך השני. כל כלי chemostat כעת מכיל תערובת של שני הזנים.
  6. להשיג מדגם מיליליטר 1 מכל כלי שיט באמצעות דגימה פסיבית בכל שעות 2-6. ספין למטה תאים, resuspend ב PBS ולאחסן ב 4 ° C. המשך נטילת דגימות להקלטת הזמן כל דגימה נלקחה 2-3 ימים בזהירות.
  7. בסוף הניסוי, sonicate ולדלל דגימות ל~ 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. באמצעות cytometry זרימה, למדוד את חלקן של שני הזנים במדגם זה. כשני הזנים גדלים באופן אקספוננציאלי, הבדל שיעור גידול היחסי הואנקבע על ידי רגרסיה ליניארית של ln (strain1/strain2) נגד זמן (נמדד בדורות). השיפוע של רגרסיה הוא ההבדל היחסי בקצב צמיחה (כלומר יתרון הכושר) של אחד זן ביחס לאחרים.
  8. כתרבות המעורבת יכולה לקחת קצת זמן כדי להגיע למצב יציב חדש, נקודות זמן המוקדם עשויות להתאים היטב לרגרסיה. בעיה זו נפתרה על ידי המיטב המאפשר 2-3 דורות לחלוף לפני תחילת דגימה או הסרת נקודות מוקדם כי הם חריגים ברורים. לעומת זאת, ברגע שזן אחד outcompeted אחר נתונים הם כבר לא שימושיים ולא לכלול את הנקודות הללו.

8. יישום 3: אבולוציה ניסויית

  1. אבולוציה ניסיונית שבוצעה בchemostats בוחרת עבור מוטציות שהם גדלו בכושר בסביבה מוגבל בחומרים המזינה. בחירה מתבצעת בדרך כלל על פני מאות דורות.
  2. להקים תרבות chemostat מצב יציב באמצעות מתחגנוטיפ של ידוע (ורצף הגנום רצוי ידוע) ומזין הגבלה מוגדרת.
  3. כדי לשמור על "המאובנים" של אוכלוסיית ההסתגלות פסיבית לטעום chemostat כל 2-3 ימים ולאחסן את הדגימה בגליצרול 15% ב -80 ° C.
  4. לפקח על מאגר המדיה ולחדש עם מדיה חדשה לפי צורך.
  5. לשמור על התרבות גדלה באופן אקספוננציאלי לכמה מאה דורות.
  6. לאחר השלמת את צלחת בחירת מדגם של תאים על צלחות אגר מוצקות. לאחר התאים גדלו לתוך מושבות, לבחור מדגם מוטה של ​​מושבות באמצעות קיסמים ולחסן שיבוטים לתוך בארות בודדות של צלחת 96 היטב המכילה המדיה 100 μl. לאפשר דגימות משובטים לגדול בין לילה, להוסיף של גליצרול 30% וחנות 100 μl ב-80 ° C.
  7. לאפיין שיבוטים על ידי רצף הגנום כולו וביצוע מבחני פנוטיפי כולל הערכה של כושר, באמצעות מתח התייחסות שכותרתו fluorescently משותף, כפי שמתוארים ביישום 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יתרון עיקרי של chemostats הוא היכולת לשלוט על קצב הצמיחה של תאים בניסוי על ידי שינוי שיעור הדילול. בשמרי ניצנים, שמר אפייה, המורפולוגיה של תא הוא אינפורמטיבי של השלב שלה במחזור חלוקת תא. אוכלוסיות עם שיעורי צמיחה גבוהים יותר מכילות שיעור גבוה יותר של תאים המתחלקים באופן פעיל, כפי שנקבע על ידי מדידת החלק היחסי של תאי unbudded (איור 5 א). ניתוח של ביטוי mRNA העולמי בתרבויות chemostat הוכיח כי הביטוי של גנים רבים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי כפונקציה של שיעור צמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Chemostats לאפשר הטיפוח של חיידקים בתנאי מצב יציב בשליטת צמיחה. התאים גדלים ברציפות בקצב קבוע וכתוצאה מכך סביבה חיצונית משתנה. זאת בניגוד לשיטות התרבות אצווה שבסביבה החיצונית משתנית ללא הרף ובקצב צמיחת תאים נקבע על ידי האינטראקציה המורכבת של הסביבה וגנוטיפ. לפיכך, יתרון עיקרי של culturing חיידקים בchemostats על תרבויות אצווה הוא היכולת לשלוט באופן ניסיוני את קצב הגידול של תאים.

הקצב שבו תא גדל הוא התוצאה של יחסי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי להתחיל את כספים בצורה של אוניברסיטת ניו יורק. אנו מודים מאטרייה דאנהם ומאט בראואר, שפתח בתחילה את השימוש בbioreactors Sixfors כchemostats.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Infors-HT Sixfors Chemostatמשאבים טכניים מתאימים, בע"מ 
בקבוק זכוכית 9.5 ליטרפישר סיינטיפיק02-887-1לכלי מדיה וצינור
פינצ'קוקפישר סיינטיפיק05-867לכלי מדיה ופקק צינור
גודל 12, ניאופרן ירוקקול-פאלמרEW-62991-42לכלי מדיה וצינור
מחבר ישרקול-פאלמרEW-30703-02לכלי מדיה וצינור
כללי קשרי מטרה 4 ב-FisherScientificNC9557052לכלי מדיה וצינורות צינורות
, גומי סיליקוןחלקים קטניםB000FMWTDEלכלי מדיה וצינורות צינור
, סיליקון, 3/8 ב-ODFisher Scientific02-587-1Qלכלי מדיה וצינורות צינור
, סיליקון, 7/32 ב-ODFisher Scientific02-587-1Eלכלי מדיה וצינורות
צינורות, נירוסטה, 3/16 ב-ODMcMaster-Carr6100K164לכלי מדיה וצינורות צינור
נירוסטה, 3/8 ב-ODMcMaster-Carr6100K161לכלי מדיה
ומחברי וופישר סיינטיפיק14-66-18Qלכלי מדיה וצינור
מהדק מחגרקול-פאלמרEW-06403-11לכלי מדיה וצינור
לוארנקבהקול-פאלמרEW-45512-34לכלי מדיה וצינור
לואר, זכרקול-פאלמרEW-45513-04לכלי מדיה וצינור
Millipore Aervent MTGR05010 מסנן 62 מ"מ, 0.2 μ, mפישר סיינטיפיקMTGR05010לכלי מדיה וצינור
PTFE Acrodisc CR מסנני 13 מ"מ, 0.2 μ mFisher ScientificNC9131037לכלי מדיה וצינור
לקריאה ישירה עבור AirCole-PalmerEW-32047-77להגדרת גז חנקן
צינור זרימה לקריאה ישירה עבור חנקןCole-PalmerEW-32048-63להגדרת גז חנקן
פרופורציונל גז מסגרות MultitubeCole-PalmerEW-03218-50להגדרת
גז חנקןרגולטור, דו-שלבי אנליטיגז אווירY12-N145D580צינור הגדרת גז חנקן
, נירוסטהAirgasY99-26450עבור צינור הגדרת גז חנקן
מתאם זכר AirgasWES544להתקנת גז חנקן
צינורות נורפרןפלסטיק ארה"57280להגדרת גז חנקן
בסיס חצובהCole-PalmerEW-03218-58עבור מחסניות שסתום להגדרת גז חנקן
Cole-PalmerEW-03217-92להגדרת גז חנקן
Carboy 10 LFisher Scientific02-963-2Aעבור הכנת מדיה
מסנני בקבוק ואקום סטריליים Steritop, 1,000 מ"ל, קרום PES; עבור גודל צוואר 45 מ"מפישר סיינטיפיקSCGP-T10-REהכנה
100 מ"ל, גודל צוואר 45 מ"מפישר סיינטיפיקFB-800-100להכנה למדיה
סידן כלורי ומידות; 2H2OFisher ScientificC79-500מדיה ריאגנטים
נתרן כלורי FisherScientificBP358-1מדיה ריאגנטים
מגנזיום גופרתי · 7H2Oסיגמא אולדריץ'230391ריאגנטים למדיה
אשלגן פוספט מונו-בסיסיפישרAC424205000ריאגנטים למדיה
אמוניום סולפטפישר AC423400010ריאגנטים למדיה
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P9541ריאגנטים למדיה
חומצה בוריתסיגמא אולדריץ'B6768ריאגנטים למדיה
נחושת סולפט · 5H2Oסיגמא אולדריץ'209198ריאגנטים למדיה
אשלגן יודידסיגמא אולדריץ'60400ריאגנטים למדיה
ברזל כלוריד ומידוט; 6H2OFisher ScientificI88-100ריאגנטים למדיה
מנגן גופרתי· H2Oסיגמא אולדריץ'230391מדיה ריאגנטים
נתרן מוליבדט ומידוט; 2H2OSigma AldrichM7634ריאגנטים למדיה
אבץ גופרתי· 7H2OFisher ScientificZ68-500ריאגנטים למדיה
ביוטיןFisher ScientificBP232-1ריאגנטים למדיה
סידן פנטותנטFisher ScientificAC24330-1000ריאגנטים למדיה
חומצה פוליתSigma AldrichF7876ריאגנטים למדיה
אינוזיטול (הידוע גם בשם מיו-אינוזיטול)Fisher ScientificAC12226-1000ריאגנטים למדיה
ניאצין (המכונה גם חומצה ניקוטינית)סיגמא אולדריץ'N4126ריאגנטים למדיה
p-חומצה אמינובנזואיתפישר סיינטיפיקAC14621-2500ריאגנטים למדיה
פירידוקסין הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'P9755ריאגנטים למדיה
ריבופלביןסיגמא אולדריץ'R4500-25Gריאגנטים למדיה
תיאמין HClפישר סיינטיפיקBP892-100ריאגנטים למדיה
לאוציןסיגמא אולדריץ'L8000-100Gריאגנטים למדיה
UracilSigma AldrichU0750ריאגנטים למדיה
דקסטרוזפישר סיינטיפיקDF0155-08-5ריאגנטים למדיה
, , צינור זרימה עבור מתאם ב עבור בקבוק מדיה

מקורות

  1. Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
  2. Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
  3. Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  4. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
  5. Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
  6. Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
  7. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  8. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
  9. Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  10. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
  11. Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
  12. Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107(2006).
  13. Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4(2007).
  14. Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
  15. Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
  16. Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325(2012).
  17. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  18. Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303(2008).
  19. Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202(2011).
  20. Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
  21. Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
  22. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).
  23. Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
  24. Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
  25. Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
  26. Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
  27. Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
  28. Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית בכימסטטבקרת קצב גדילהניתוח ביטוי גניםאבולוציה אדפטיביתציטומטריה זרימההגבלת חומרים מזיניםתרבית במצב יציבחישוב קצב דילולבדיקת כשירות תחרותית
השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.