הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

19.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50173

⸱

22 ביוני 2013

 , 
1Department of Emergency Medicine, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Department of Physiology, Wayne State University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

חסימת עורק תרדמה דו צדדית בשילוב עם ירידה בלחץ דם מערכתי מייצרת איסכמיה המוחית העולמית בחולדה, וכתוצאה מכך לנזק ליפוקמפוס בחומרה לשחזור. נושאי בעלי החיים הם לקויים עם דפוסים צפויים של נזק מוחי, הם להתאושש expediently, ושיעורי תמותה הם נמוכים יחסית.

תקציר

דום לב ואחריו החייאה לעתים קרובות תוצאות נזק מוחי שנגרם על ידי איסכמיה דרמטי וreperfusion הבאה של המוח. איסכמיה המוחית העולמית מייצרת נזק לאזורים ספציפיים במוח המוצגים להיות רגיש מאוד לאיסכמיה 1. יש נוירונים בהיפוקמפוס רגישות גבוהה יותר לעלבונות איסכמי בהשוואה לאוכלוסיות תאים אחרים, ובמיוחד באזור CA1 של ההיפוקמפוס הוא פגיע במיוחד לאיסכמיה / reperfusion 2.

העיצוב של התערבויות טיפוליות, או לימוד של מנגנונים המעורבים בנזק מוחי, מחייב מודל שמייצר נזק דומה למצב הקליני ובאופן שחזור. חסימת כלי דם עורק תרדמה דו צדדי עם ירידה בלחץ דם (2VOH) הוא מודל שמייצר מוח קדמי איסכמיה הפיכה, לחקות את האירועים המוחיים שיכול להתרחש בעת מעצר ובהחייאת לב. אנו מתארים מודל שונה מסמית et al. (1984) 2, כפי שהוצג לראשונה במתכונתו הנוכחית בשנת סנדרסון et al. (2008) 3, אשר מייצר פגיעה לשחזור לאזורים במוח פגיע סלקטיבי 3-6. האמינות של הדגם הזה מוכתבת על ידי שליטה מדויקת של לחץ דם תת לחץ דם מערכתי במהלך מוחל, את משך הזמן של איסכמיה, בקרת טמפרטורה קרובה, משטר הרדמה ספציפי, וטיפול שלאחר הניתוח חרוץ. עלבון איסכמי 8 דקות מייצר מוות של תאי CA1 של נוירונים בהיפוקמפוס שמתקדם לאורך המסלול של 6 עד 24 שעות של reperfusion, ואילו אזורים במוח פחות פגיעים הם חסכו. מוות של תאים מתקדמים זה הוא לכמת בקלות לאחר 7-14 ימים של reperfusion, כאובדן מוחלט כמעט של CA1 עצב ניכר בשלב זה.

בנוסף למודל פגיעה מוחית זו, אנו מציגים שיטה לכימות נזק CA1 באמצעות פשוטה, אך יסודית, מתודולוגיה. חשוב מכך, ניתן להשיג כימות באמצעות מיקרוסקופ מצלמה רכוב פשוט,(NIH) תוסף דה החופשי ImageJ תוכנה, מייתר את הצורך בתוכנות Stereology עלות אוסרני ושלב מיקרוסקופי ממונע להערכת נזק.

מבוא

נזק מוחי כתוצאה ממעצר ושבץ לב הוא גורם מוביל של מוות ונכות לטווח ארוך. בעוד החייאה לנפגעי דום הלב מצליחה להשיב את הזרימה ספונטנית בכ -70,000 מטופלים בשנה בארה"ב 7,8 לפחות 60% מהחולים הללו לאחר מכן נפטרו בבית החולים כתוצאה מניזק מוחי נרחב ורק 3-10% החייאה של חולים יכול לחזור לאורח החיים הקודמים שלהם 9,10. ברור, הבנת המנגנונים שיובילו לנזק מוחי בעקבות איסכמיה המוחית העולמית ותכנון התערבויות טיפוליות כדי למזער את טראומת נוירולוגית היא בעל חשיבות קריטית.

יכולה להיות מודל איסכמיה ניצול שיטות מרובות. ברוב המקרים, איסכמיה מיוצרת במכרסם ידי occluding כלי דם גדול במוח, עורק המוח האמצעי, ובכך לייצר שבץ איסכמי 11,12 מוקד. בעוד חשיבות קלינית,איסכמיה מוקד היא לא שיטה מדויקת ללמוד נזק מוחי המיוצר על ידי מעצר / החייאת לב. למודל הפרדיגמה קלינית זו את המוח כולו חייבת להתבצע איסכמי ואחרי חידוש של זרימת דם. כדי לחקות את המצגת קלינית זה מקרוב, חוקרים בניסוי לגרום דום לב ואחריו החייאה עם החייאה ודפיברילציה 13,14. מודל זה הוא רלוונטי מבחינה קלינית, פעמים החייאה אך בלתי צפויות יכולות להגדיל את השונות ועלולות להפוך את ניתוח הנתונים קשה לפרש. בנוסף, מודל זה קשור לשיעור תמותה גבוה, נוסף להגדיל את מספר בעלי החיים דרוש כדי לבדוק את השערה. חוקר את תגובת המוח לאיסכמיה העולמית ו / או בreperfusion עלבון יותר לשחזור, עולה בקנה אחד, ולשרוד עשוי להיות מועדף.

איסכמיה גלובלית יכולה להיגרם במוח תוך שמירה על כמה זרימת דם מערכתית. זה מפחית את התמותה, ובמקביל לאפשר investigation של המנגנונים של נזק לרקמות במוח 2. כדי לייצר איסכמיה המוחית הגלובלית, יש צורך להפסיק או להגביל באופן משמעותי את הזרימה בכל ארבעת כלי המספקים את המוח, עורקי הראש הפנימיים ועורקי חוליות. כלים אלה מספקים למוח את זרימת דם דרך מבנה כלי דם הנקרא מעגל ויליס, המהווה לולאת anastomotic. ארכיטקטורה זו מאפשרת לכלי דם במוח כדי לשמור זלוף במקרה של חסימת כלי דם הפרוקסימלי. לכן, כדי לגרום לאיסכמיה של המוח, זרימת הדם מלאה בכל כלי התורמים חייבת להתרחש. ניתן להשיג זאת באמצעות חסימת העורק הראשי בצוואר פולשנית הגחון חתך למטה ויישום של קליפים פרצה לתקופה רצויה. הפרעה בזרימת דם דרך העורקים בחוליות יכולה להיות קשה, כפי שהם כלוא בforamina הרוחבי של עמוד השדרה. חוקרים התייחסו לזה על ידי electrocauterizing העורקים בחוליות 24-48 שעות לפני התרדמההחסימה ואיסכמיה (4VO דגם) 15. בניגוד לגישה זו, סמית ואח'. פיתחה שיטה של גרימת איסכמיה מוח הגלובלית על ידי צמצום מתכוון לחץ דם העורקי (MAP) מערכתית עד 40 מ"מ כספית כדי להפחית זלוף דרך העורקים בחוליות לנקודה שבה זרימת דם הולכת לאיבוד או מופחתת במידה ניכרת 2 . כאשר בשילוב עם חסימת עורק תרדמה, שיטה זו מייצרת איסכמיה לאורך המוח הקדמי, וכתוצאה מדפוס של נזק מוחי שמחק באופן הדוק זה של ניצולי דום לב. בחידוד נוסף של שיטה זו, המודל שאנו מציגים כאן דורש רגולציה הדוקה מפה ב30 מ"מ כספית ± 1mHg במהלך דקות 8 השלם של איסכמיה. מצאנו שינוי זה משפר את שחזור של נזק מוחי הנגרם על ידי מודל זה תוך שמירה על שיעור התמותה הנמוך של הטכניקה המקורית שתוכננה על ידי סמית ואח'.

הפנוטיפ המדויק של מוות של תאים והיקף כולל של נזק לרקמות שנגרם על ידיהמודל המוצג כאן תלוי באופן ישיר משך 16 איסכמי. בעקבות 8 דקות של איסכמיה, CA1 נוירונים התערוכה עכבו מוות של תאים, מה שמרמז שיש חלון זמן להתערבות טיפולית בשלב reperfusion 15,17. בתחילת reperfusion, הנוירונים להחזיר במהירות תפקוד ולא מוות של תאים לזיהוי מיידי הוא 18. עם זאת עלבון זה גורם לאינדוקציה של מפלי מוות של תאים (אפופטוזיס) המגיע לשיאה בשחרורו של חלבוני apoptogenic ממיטוכונדריה, כולל ציטוכרום C, בין 4-6 שעות של reperfusion 3,19. בין 6 ל 24 שעות של reperfusion, נוירונים ביפוקמפוס CA1 התחייבו מותו של תא, ואת תכנית המוות של תאי אפופטוטיים מבוצעת 19. יש לציין שהתא פנוטיפ המוות האחראי לפגיעה איסכמית הוא שנוי במחלוקת. מחקרים מוקדמים הראו נמק הוא הפנוטיפ המוות של תאים הראשוני 20,21, בעוד שאחרים ידווחו אחרים apoptOSIS כמנגנון העיקרי 22,23. בסך הכל, ראיות נוכחי מצביעות על כך שהתאים מתים מספקטרום של פנוטיפים מוות של תאים הנעים בין קלאסי לאפופטוזיס נמק. המצב הספציפי של מוות של תאים תלוי בגורמים רבים, במידת התרומה של כל פנוטיפ בהתאם לחומרה של העלבון, בין גורמים אחרים 24,25. ב -24 שעות של reperfusion, תאים מתים בעלי גרעיני pyknotic, cytosol המרוכז עם ראיות ברורות של תוכן סלולרי מצטבר, והפסד של המיטוכונדריה מורפולוגיה פונקציונלית. תאים מתים שבורים עוד יותר למטה, נבלעו על ידי תאי מערכת חיסון כגון מקרופאגים ו / או מיקרוגלים, ופינו מאזור CA1 בהיפוקמפוס. על ידי 4-7 ימים של reperfusion, תאים מתים יוסרו, וכל מה שנשאר הם תאים דלקתיים והופעלו תאי גלייה 17,26. לכן, 7 ימים של reperfusion מייצגים זמן אופטימלי שבו ניתן לכמת CA1 מוות עצבי בהיפוקמפוס באמצעות כתמים סלולריים פשוטים, שאינם ספציפיים בcluding סגול cresyl או hemotoxylin-eosin וספר מבוססים על קריטריוני הכללה המורפולוגיים. תאים שנותרו במרווח reperfusion מאוחר זה יכול להיחשב כתאים ששרדו, ובכך לספק מדד של נזק מוחי.

אם המודל הזה הוא להיות מנוצל כדי לבדוק התערבויות טיפוליות, הוא הציע שעיצוב הניסיון לעקוב אחר קריטריוני מדרגות (תעשייה אקדמית טיפול שבץ שולחן עגול) 27. הנחיות אלה צריכה להיות מלווה בעת תכנון וביצוע מחקר, אולם הם לא נדונו כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה

כל הניסויים בבעלי החיים חייבים להתאים להנחיות מוסדיות ולקבל אישור על ידי ועדה בהתאמה טיפול בבעלי חיים קודם לחניכה. כל הנהלים המוצגים כאן אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ויין סטייט ומשתמשים הוועדה ופעל בהתאם להנחיות בטיפול האתי בבעלי החיים, כפי שנקבעו במדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה ולעקרונות של ממשלת ארה"ב ל ניצול וטיפול של בעלי חיים בעלי חוליות בשימוש בבדיקה, מחקר והדרכה. לפני תחילת ניתוח, להכין חומר ניתוחי הכרחי וכלוב התאוששות ניתוח. הליך זה הוא ניתוח הישרדות ולכן, יש לתרגל טכניקה סטרילית.

  1. כדי להפוך את הקטטר כלי דם, לחתוך אורך 8 סנטימטר של צינורות פוליאתילן 50 (PE50) ולהכניס מחט מד 23 קהה לקצה אחד. ניתן לרכוש בנפרד מראש צנתרים מעוקרים או נרכש בבULK ולאחר מכן עיקור עם אתילן גליקול לפי צורך.
  2. לאבטח את המחט זה על יציאה אחת של דרך ברזלים שלושה ולמקם את דרך ברזלים עוד שלושה על היציאה ההפוכה. Heparinize את הברזים למיניהם וקטטר על ידי הפעלה באמצעות תמיסת מלח הפרין. חבר מזרק מלוח 10 מ"ל על ניצב ודיסטלי לקטטר ברזלים. חבר את ברזלים הדיסטלי לקטטר אל הצינור מתמר לחץ, למלא את המערכת עם מי מלח ולהסיר את כל בועות אוויר.
  3. התקנת כלוב ההתאוששות בהתאם לתקנות שימוש בבעלי חיים. חדר ההתאוששות צריך להיות שקט ויש תנועה מועטת. הפעל חשוב על שולחן משב הרוח או מערכת הדחה גז דומה לפני ניתוח תחילת לסנן isoflurane מתאדה.

2. הכנה כירורגית

ספראג-Dawley חולדות (300-350 גרם) משמשות במודל של איסכמיה 2VOH המוח הקדמי הגלובלית. הרדמה מושרה ומתוחזק עם isoflurane וsupplemented עם מינון תת דיסוציאטיבית של קטמין. יש לנו ציינו כי ההרדמה ומתוחזק על ידי isoflurane לבד גורמת להתרחשות מוגברת של התקף במהלך התאוששות שלאחר ניתוח. התקפים יכולים לתרום לנזק עצבי ותמותה, שישפיע על שחזור של דגם זה. השלמה עם ההרדמה קטאמין מאפשרת מינון נמוך בהרבה של isoflurane להגיע לכיתה של הרדמה כירורגית. שימוש בשמיכת תרמית homeostatic מאפשרת רגולציה קפדנית של טמפרטורת ליבה. ההליך הכירורגי כרוך בעורק הצוואר חתוך כלפי מטה ובידוד, ועורק הירך חתך למטה וcannulation.

הערה חשוב לשמור תיעוד מפורט במהלך כל הליך כירורגי פרט. שינויים בטמפרטורת ליבה, לחץ דם, או משתנה פיסיולוגיים אחרות המתרחשים לפני או במהלך הניתוח עשויים לשנות באופן דרסטי את תוצאות, ויכול להיות מנותחות רשומות על מנת להבטיח שיש עקביות הדיונית בין יחידים וקבוצות. עקביותבפרמטרים פיסיולוגיים של בעלי החיים ניתן לשפר על ידי בעלי החיים צום לפני הניתוח. אנו מעודדים את הנסיינים על מנת לקבוע את השיטה, כי תוצאות בפרמטרים המודינמיים המופעלים מראש העקביים ביותר וריכוז הגלוקוז בסרום ללימודיהם.

  1. לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר לתוך תא אינדוקציה ולמלא בתערובת תחמוצת חנקן oxygen/70% -30% ב -5% isoflurane. צנרר עם קטטר מד 12, באמצעות ראי גרון מכרסמים ולאוורר עם 30% תערובת תחמוצת חנקן oxygen/70% עם 2.5% isoflurane. קצב תחלופה אוויר צריכה להיות 80 נשימות לדקה ב2.5 מ"ל לנשימה.
  2. תן זריקה תוך הצפק של קטמין (20 מ"ג / ק"ג) במלח ולהפחית isoflurane ל -1.5%. חשוב זה הכרחי כדי לפקח על הרמה של הרדמה בכל ההליך על מנת להבטיח מטוס כירורגית נאות של הרדמה. כדי לבדוק את עומק הרדמה, קמצוץ בין הספרות אחורי-גפיים, תוך מעקב הדוושה רפלקס. אם רפלקס הואנעדר, ההרדמה היא נאותה. לאחר cannulation של עורק הירך, לחץ דם יכול לשמש כאינדיקציה לרמת הרדמה. שמור על המינון של isoflurane נמוך ככל האפשר, תוך השמירה על מטוס כירורגית של הרדמה כדי להקטין את הסיכון של התקפים לאחר איסכמי.
  3. חתכים ייעשו בצוואר ובאזור האגן. לגלח את הצוואר ובאגן ימין, שבו הירך פוגשת את הבטן. אוריינט העכברוש במצב שכיבה בתרם שמיכת homeostatic ולהכניס את מדחום רקטלי באמצעות סיכה כירורגית. החל סיכה עין מגן. הנורה 60 ואט יכולה לעזור לווסת את הטמפרטורה. אף פעם לא צריכה להיות קרובה יותר מהנורה 8 סנטימטרים מבעלי החיים. טמפרטורות חשובות מעל או מתחת לטמפרטורה פיזיולוגית נורמלית (37 מעלות צלזיוס) יכולות מאוד להשפיע על נזק נוירולוגים סופי. לשמור על טמפרטורת ליבה על 37 מעלות צלזיוס ± 0.5 ° C.
  4. לשפשף את אזורי החתך עם בטאדין ולשטוף עם אתנול 70%. חזור על זה TWo פעמים נוספות. הנח שדה ניתוח על העכברוש, ולחתוך חורים לחשוף את אזורי החתך. יכולים להיות מבודדים עורקי ראש וירך חשובים מבלי לגרום טראומה לשרירים שמסביב, מה שישפר את ההתאוששות ולאחר מכן צורך ממוזער לשיכוך כאבים שלאחר ניתוח.
  5. בהמתנה הרדמה נאותה, להשתמש מס '10 אזמל כדי לעשות חתך קו האמצע לאורך הצוואר, ולאחר מכן, באמצעות hemostats בוטות לנתח בין בלוטות הרוק עד שמגיע לשריר sternohyoid, קבוצת השרירים קו האמצע הבולטת מכסה את קנה הנשימה. שוב שימוש בטכניקה לנתיחה בוטה זהירה, להפריד את קבוצות השרירים העיקריות של sternohyoid מsternomastoid, בילטרלי. שתי קבוצות שרירים אלה יוצרים שקע משולש אשר יכול לשמש כנקודת ציון לאתר את צרור neurovascular המכיל את העורק הראשי. ענפי התרדמה המשותפים לתוך עורקי הראש הפנימיים וחיצוניים. לבודד את עורק התרדמה המשותף הפרוקסימלי לדומזלוג.
  6. בעדינות להפריד בין שני השרירים האלה ולאתר את העורק הראשי. כדי לסייע בזיהוי הכלי הזה נראה את דופק. לבודד את עורקי הראש בשני הצדדים על ידי העברה ~ אורך 5 סנטימטר של תפר 3-0 משי מתחת לכלי השיט. לסלק fascia מכלי הדם. זהירות העצב התועה והשרשרות אוהדות נכללים בחבילת neurovascular צוואר הרחם ויש להקפיד להימנע מגרימת נזק אליו בעת בידוד העורק הראשי.
  7. השתמש במספריים כדי לעשות חתך שני במפשעה, לאורך השקע שבו שרירי ירך אחורי, גפיים פוגש את הבטן. לנתח מתחת לשריר הבטן, לאורך שרירי הירך עד שתגיעו לרצועה מפשעתי. זה יחשוף את צרור neurovascular הירך. בודד בזהירות את עורק הירך על ידי העברה ~ אורך 5 סנטימטר של תפר 3-0 משי מתחת לכלי השיט. לסלק fascia משאיר 5-7 מ"מ של כלי חשוף.
  8. לקשור קשר קבוע בקצה הדיסטלי של העורק החשוף. קשרים קבועים באור צריכים להתחיל עם קשר חיכוך, ואחריו קשר מרובע (כולל של שני קשרים). כלל זה כולל קשרים תפר. הנח תפר עוד 3-0 משי סביב הקצה הפרוקסימלי של העורק ולקשור קשר רופף.
  9. החל מתיחה על התפר בקצה הפרוקסימלי של העורק כדי לחסום את זרימת דם, על ידי משיכת התפרים לימד. לעשות חתך קטן בחלקו העליון של הכלי עם מספריים רפואת עיניים. מתיחה בלתי מספקת על הכלי תגרום לדימום, שניתן לעצור על ידי הפעלת מתיחה כבדה יותר. סגור את הצנתר בברזלים.
  10. באמצעות ההיכרויות כלי דם, הכנס את צינור קטטר לתוך הכלי, 7-9 מ"מ עבר חתך הכלי וכיוון קו האמצע. ברגע שהצנתר ממוקם במרחק הרצוי, לקשור את הקשר הרופף סביב הכלי וקטטר כדי לאבטח אותו במקום. הסר מתיחה מהספינה ולאפשר לו לשקר באופן טבעי.
  11. לנהל 0.3 מ"ל הפרין (100U/ml במלח), דרך הווריד. שטוף את כלדם מהצנתר עם כמות קטנה של מלח כדי למנוע קרישה. הדלק את צג הלחץ ולכייל את הציוד. פתח את הברזים למיניהם, כדי לאפשר את המתמר כדי לזהות את לחץ דם. כדי להשיג מדידות מדויקות של לחץ דם, מיצובה של המערכת לא צריך להיות שונה לאחר כיול.
  12. מינון צריך להיות מותאם isoflurane להניב לחץ דם העורקי ממוצע (MAP) של 110 מ"מ כספית עד 130 מ"מ כספית. מפה זו צריכה להיות אינדיקציה למטוס כירורגית נאות של הרדמה.

3. פרוטוקול איסכמיה

כאמור, ארבעה כלי זלוף לספק למוח. חסימה הפרוקסימלי של שני עורקי הראש לא תגרום לאיסכמיה המוחית בגלל עורקי החוליות יפצו באמצעות המעגל של ויליס. הוכח כי חסימת עורק תרדמה, בשילוב עם ירידה בלחץ דם מערכתי מושרה, תגביל זלוף דרך עורקי החוליות וכתוצאה מאיסכמיה. כאן אנו DescrIBE הפרוטוקול למשיכת דם כדי לייצר תת לחץ דם וכיווץ עורקי התרדמה כדי לייצר איסכמיה המבוקרת, הפיכה. ראה איור 1.

חמצן בדם ופחמן דו חמצני, ריכוז סוכר וחומציות יכולים להשתנות בין אנשים בקבוצת המדגם ולגרום לשינוי בפציעה. ניטור משתנים פיסיולוגיים אלה יכול להפחית את ההשתנות של אוטם. כאמור, טמפרטורה היא פרמטר נוסף שחשוב להסדיר, לעומת זאת טמפרטורת המוח לא יכולה מתאימות לטמפרטורת ליבה, כפי זלוף מוגבל מאוד באיסכמיה הניסיונית 28. תוצאות ההתקנה שלנו ספציפי כירורגיות בשינויי הטמפרטורה במוח ששינויים במראה בטמפרטורת הליבה במהלך איסכמיה. עם זאת, חשוב לניסוי כדי לקבוע את זה באופן אמפירי על ידי ניטור טמפרטורת מוח עם צמדים תרמיים או באמצעים אחרים לתקנון את ההליך. אם טמפרטורת ליבה אינה משקפת TEM המוחperature, חשוב כדי לשמור על טמפרטורת מוח normothermic במהלך ההליך כולו, ללא קשר לטמפרטורת ליבה.

אקראי מכתיב כי מנתח randomizes החיה לאיסכמיה או קבוצת ביקורת דמה המופעלים בשלב זה. שאם ניתוח יעברו את כל ההליכים בדיוק כמו חיות איסכמי ללא כל ירידה בלחץ דם וחסימת עורק הראשי. חשוב כי בקרות דמה המופעלים להיות תחת אותו המינון של הרדמה למשך תקופה שתואם לזה של בעלי החיים איסכמי. אם יש קבוצת טיפול נכללה, אשר דורשת הרדמה לפני או אחרי איסכמיה, זיוף וקבוצות שלא טופלו איסכמיה צריך להתאים את מינון ההרדמה ומשך קבוצת הטיפול.

  1. קליפים עוצרים דמום מוכנים ומוליך קליפ. סרטונים צריכים לחסום את הכלי לחלוטין ללא גרימת כל טראומה. יכולה להיגרם איסכמיה כאשר פרמטרים המודינמיים הפכו עקביים. חבר 10 מ"ל heparinized syringe על ברזלים, והניצב הפרוקסימלי לקטטר. לא צריך להיות 0.3 מ"ל (30 יחידות) של heparinized מלוח בתוך המזרק כדי למנוע קרישה של דם מסוגר.
  2. להגדיר טיימר דקות 1 ולפתוח את שסתום למזרק heparinized, ולכן ניתן למשוך דם.
  3. לסגת דם על ידי משיכת בוכנת המזרק. אם יותר מדי יניקה מוחלת, הכלי יקרוס או לאטום נגד פתיחת קטטר ואין דם יהיה נמשך. זה צריך להיות אפשרי כדי להסיר 7-9 מ"ל של דם בדקות 1. אם זה לא המקרה, קידם את הצנתר נוסף לתוך העורק ולנסות שוב. אנו מוצאים כי 7-9 מ"ל של דם יש להסיר כדי להפחית את המפה ליד 30 מ"מ כספית, לחץ הדם כדי להשיג יעד איסכמיה. חשוב ודאו הדם נסוג נשמר על 37 מעלות צלזיוס, כדי למנוע קירור במהלך reinfusion הדם.
  4. אחרי תיקו דם דקה אחת (7-9 מ"ל של דם צריך להיות מסוגר), להחיל קליפים עוצרים דמום לעורקי הראש ולהתחילטיימר ל8 דקות. מייד לבדוק את לחץ דם. אם המפה היא לא ב30 מ"מ כספית, או לסגת להחדיר דם באיטיות כדי להשיג 30 מ"מ כספית ± מ"מ כספית 1. תמשיך את הנוהג הזה לאורך איסכמיה לשמור על מפה של 30 מ"מ כספית. לחץ דם שיא חשוב לאורך כל פרוטוקול איסכמיה. אי להפחית את לחץ דם עד 30 מ"מ כספית עלולים להגביל איסכמיה. צג ליבה ו / או בטמפרטורת המוח צמודה במהלך reinfusion כמו עליות או ירידות בטמפרטורה עשוי להשפיע על נזק מוחי.
  5. בסופו של 8 דקות, יתחיל reperfusion על ידי הסרת קטעים עוצרים דמום וreinfusing הדם באיטיות, 2 מ"ל לדקה.
  6. כאשר הדם כבר reinfused הצינורית ניתן להסיר מעורק הירך. כדי להימנע מכל דימום במהלך שני קשרים מנותחות, מאובטחים נפרדים הפרוקסימלי לחתך בעורק.
  7. תפר את החתכים עם דפוס רציף באמצעות מחט חיתוך הפוכה, עם 5-0 תפר Vicryl. התפר הזה יתמוסס, כך שזה לא Require ההסרה. הערה במהלך ההליך, אם לא ניתן להגיע להרדמה מספיק עם רמות נמוכות יותר של isoflurane, לנהל מנה נוספת של קטמין.

4. שיכוך כאבים ושחזור

רווחת בעלי החיים היא בעדיפות במהלך התאוששות, כמו גם את ההליך הכירורגי. טיפול שלאחר הניתוח צריך לעקוב אחר ההנחיות הספציפיות של המוסד. בעלי חיים שעוברים איסכמיה המוחית העולמית מועדים להתקפים. כדי למזער את התרחשות התקף חשוב שיש חדר התאוששות גירוי מינימאלי, כלומר רעשים והפרעות ראייה. לפי פרוטוקול השימוש בבעלי החיים שלנו, אנחנו בית חיות שלאחר ניתוח עבור 72 שעות בחדר מבודד למטרה זו.

  1. לאחר שנתפרו חתכי העכברוש יכול להיות נגמל ממכונת ההנשמה. כבה את isoflurane ולהמשיך אוורור ב30% תחמוצות חנקן oxygen/70% עד החולדה מתחילה לנשום נגד מכונת ההנשמה.
  2. לנהל 0.5 מ"ג / kbutorphanol גרם בתמיסת מלח 5 מ"ל, תת עורי בין השכמות.
  3. מהירות reinfusing דם עלול להגביר preload החדר ממני. זה מגביר את לחץ זרימת דם ריאתי ויכול לגרום לבצקת ריאות. סימנים לכך כולל עמלו קולות נשימה ופצפוצים במהלך נשימה. החלת סוף חיובי לחץ נשיפה תסייע לשפר בצקת ריאות.
  4. כאשר שליטה רצונית של נשימה הוא חזר, extubate, להסיר את המדחום ולכבות את שמיכת החימום. בשלב זה בעל החיים יכולים להיות ממוקם בתוך כלוב התאוששות. כלוב ההתאוששות צריך להיות ממוקם כך שחצי הכלוב הוא בראש במחזור שמיכת מים (34 מעלות צלזיוס) במשך 24 שעות הראשונה של reperfusion. מניחים את החיה בחלק מהקומה מעל כלוב שמיכת החימום כדי לסייע בתחזוקת טמפרטורה. ברגע שהחיה מתחילה להתאושש מהרדמה ושיכוך כאבים, זה יעבור סביב הכלוב לthermoregulate עצמו. בעלי חיים יהיו שוכנו בנפרד במהלך אחרי הניתוח.
  5. צריכה להיות החיה גישה בלתי מוגבלת למים. במשך יומיים מנותחים, מים זה אמורים להכיל פתרון טיילנול נוזל מ"ג / ק"ג 4. בנוסף למכרסם צ'או, דגני בוקר ממותקים מסופקים בכלוב כדי לעורר אכילה ולמנוע ירידה במשקל.
  6. כיסוי מחצית הכלוב עם וילון ולפקח על התאוששות לאחר הניתוח באופן הדוק.
  7. כחיה מתאוששת מהרדמה שזה חשוב לעקוב אחר סימנים של מצוקה. עמל או בנשימה עולה בקנה אחד יכולה להיות סימן למצוקה, נגרם ככל הנראה על ידי בצקת ריאות או גירוי דרכי הנשימה במהלך אינטובציה. Butorphenol יהיה רגועים בעלי החיים, צמצום הפעילות, עם זאת פעילות מתונה צריכה להיות משוחזרת בשעה 1. אנו מוצאים את החיות תתחיל לאכול פינוקים ושתייה בתוך 4 שעות של האקסטובציה. ב -12 שעות, יש לחדש התנהגות נורמלית ופעילות האכלה. סימן נוסף למצוקה היא ירידה במשקל; חיה צריכה להפסיד לא יותר מ 20% ממשקל גוף מקורי בכל פרק שעה 48, אם ירידה במשקל מוגזמת אניים שנצפה צריכים להיות מורדמים בבעלי החיים.
  8. התערבות הומנית היא הכרחית אם התקפים מתרחשים. סוג זה של פעילות התקפים בדרך כלל ראה 24 עד 48 שעות לאחר reperfusion. התקפים יכולים לגרום לניזק מוחי מוגבר שאינו תלויה בעלבון איסכמי כשלעצמה, ובכך פעילות התקפים צריכה להיחשב קריטריוני פסילה שנקבעו במקום לפני תחילת המחקר 29. התקפים יכולים להתרחש כאשר אף אחד לא קיים, ולכן חשוב לזהות את הסימנים. מצעים יהיו מוטרדים ואולי גורשו מהכלוב. עכברוש postictal יהיה אופי נרפה עם מהיר, נשימה מאומצת ו / או שיש לי האף חבול או מדמם.

הערה כל סימנים של כאב או מצוקה היא להקל מייד עם משככי כאבים. אם sympotoms לא להקל עם מנה אחת של משככי כאבים או להתמיד לאחר המנה הרביעית ברציפות של שיכוך כאבים, בעלי החיים יהיו מורדמים ולא נכללו במחקר. וו כירורגיתunds צריך להיבדק לריפוי תקין לשמונה ימים מנותחים.

5. אוסף רקמות ועיבוד

המוח הוא קבוע על ידי עירוי של Transcardial paraformaldehyde. לאחר חתך וcryoprotection גולמי, אנחנו הצמד להקפיא את המוח ואת הקטע על cryostat. אלו חלקים במוח מגואלות סגול cresyl וצלמו במיקרוסקופ אור.

  1. לגרום הרדמה על ידי הצבת את בעל חיים לתוך תא האינדוקציה ומילוי עם חמצן 30% / 70% תחמוצות חנקן עם 5% isoflurane. צנרר החיה ולאוורר בחמצן 30% / 70% תחמוצות חנקן עם 5% isoflurane.
  2. הכן את החומר להליך זלוף. מלא כוס אחת עם 100 מ"ל של 1x פוספט שנאגרו מלוח (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס ובכוס אחת עם 100 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 ° C. המוח הוא הסמיק עם PBS ואחריו PFA, באמצעות משאבת זלוף. שרוול יוצב לתוך כל כוס ומחובר על ידי ברזלים השלוש דרךllow מעבר חלק מPBS לזלוף PFA. הנח מחט מד 18 קהה על גבי צינורות ולמלא את הקו עם PBS. ודא שאין בועות במחט וצינורות כמו אוויר עלול להיוצר תסחיף, אשר יכול למנוע זלוף. כמו כן, המכל קטן מוכן עם PFA לקיבעון טבילה של המוח.
  3. השתמש במגש איסוף נוזלים, עם מספיק יכולת להחזיק לפחות 200 מ"ל של נוזל. בשלב זה היה צריכה להיות החיה מאווררת עם isoflurane למספיק זמן (לפחות 3 דקות) כדי להגיע להרדמה עמוקה.
  4. חשוב להבטיח את המטוס של הרדמה כירורגית הוא הגיע.
  5. המשך על ידי ביצוע חתך לגשת חלל בית החזה דרך הבטן. הצמד את אב העורקים היורדים. כאשר הלב חשוף, הכנס את מחט מד 18 הקהה דרך הקודקוד של הלב לאב העורקים. ביצוע חתך קטן באפרכסת ימין כדי לאפשר perfusate כדי לצאת מבעלי החיים.
  6. הפעל את המשאבה ב50 מ"ל / דקה, מתחיל עם PBS. לאחר pumping 100 מ"ל של PBS, לעבור את שסתום לperfuse 100 מ"ל של PFA.
  7. הסר את המוח, נזהר שלא לפגוע ברקמות.
  8. מניחים את המוח לתוך מטריצת רקמה ולחתוך בין המוח הקטן והמוח הגדול. סעיף המוח הקדמי; ~ 3 מילימטרים מקדמיים והאחורי של קליפת המוח. זה יהיה לייצר שלושה חלקים, החלק האמצעי יכיל היפוקמפוס.
  9. מניחים את החלקים במוח לתוך צנצנת עם מספיק PFA לטבילה מלאה. טבילה לתקן את המוח במשך שעה 2 בדיוק.
  10. כדי להגן על הרקמות מפני נזק הנגרם על ידי הקפאה, המוח cryoproteced על ידי החלפת PFA עם סוכרוז 30% ב-PBS. Cryoprotection הוא להשלים עם דגימות הרקמה לשקוע בתמיסת סוכרוז (~ 24-48 שעות).
  11. לצלם להקפיא את החלקים במוח, הנח כוס בקרח יבש ולמלא עם 2-methylbutanol במשך עשר דקות. מניחים את פרוסות המוח לmethylbutanol במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר למכל סגר ולאחסן ב -80 ° C עד cryostבחתך.
  12. סעיף cryostat המוח ב20 מיקרומטר, איסוף לפחות 3 סעיפים ב3 מוח אטלס קואורדינטות (מוח החולדה בקואורדינטות Stereotaxic. Paxinos ווטסון, קטעי צלחת 29, 31, 33 או גבחת -2.8 מ"מ, -3.3 מ"מ, ו-3.8 מ"מ). הסעיפים מונחים על שקופיות מיקרוסקופ טעונות ולהתייבש לפני האחסון ב -80 ° C.
  13. סגול cresyl (0.1% ב-pH 3.5) כתם חלקים במוח 9, 3 בכל מוח אטלס קואורדינטות.
  14. תמונה באזור CA1 של ההיפוקמפוס ב40x עם מיקרוסקופ רכוב מצלמה ולהכניס במקביל סרגל קנה מידה מיקרומטר 300 עם המטוס העצבי CA1. לשמור את תמונות כקבצי TIFF.

6. כימות נזק מוחית

ImageJ, תכנית חינם המוצעת על ידי המכון הלאומי לבריאות, ניתן להשתמש בו כדי לספור ולכמת את הנוירונים קיימא, אשר מייצגים את מידת נזק מוחי.

  1. תמונות TIFF מיקרוסקופ פתוחות עם התוסף "דלפק התא 'של ImageJ. בחרסימון צבע ונוירונים ספירה בתוך הגבולות של סרגל קנה המידה. נוירונים נספרים מבוססים על קריטריוני הכללה פשוטים המבוססים על מורפולוגיה עצבית (צורה גדולה, פירמידה) או קריטריוני פסילה למורפולוגיה microglial / astrocyte (עגול קטן או צורת צינורי ארוכה).
    חשוב להיות עקבי עם קריטריונים להכללה / הדרה בין שקופיות, ויחידים בספירת תאי עצב.
  2. ספירת נוירון להקליט ולשמור את חלון דלפק התא.
  3. Neuron הספירה אמורה להסתיים על ידי שני אנשים נפרדים להשגת עקביות, ספירת תאי עצב מדויקת.
  4. הממוצע של כל 9 תמונות מכל חיה יספק אומר "ספירת נוירון" אחד, שהוא המדד כמותי לנזק בהיפוקמפוס CA1 לשימוש בניתוח סטטיסטי. ניתן להשוות קבוצות סטטי באמצעות ניתוח שונה חד כיווני ואחרי הבדיקה של Tukey HSD להודעה הוק ניתוח, או, שבו בדיקת תקינות נכשלה, ANOVA חד כיווני קרוסקל-אליס בשורות אחרי PO של דאןרח הוק ניתוח כדי להעריך הבדלים בין קבוצות מבחינה סטטיסטית. ניתוח סטטיסטי מסוים צריך להיות מוכתב על ידי עיצוב המחקר הבודד, אחד שהוצג כאן לא יכול להיות מתאים להשערות הספציפיות הנבדקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מודל 2VOH של איסכמיה / reperfusion הגלובלית גורם למוות עצבי באזור CA1 של ההיפוקמפוס. איור 2 מייצג את פגיעה המיוצרת על ידי 8 דקות של איסכמיה המוחית העולמית, מעובד 14 ימים לאחר reperfusion. איורים 2 א ו -2 להשוות hippocampi מאחיזת העיניים ו מוחות פוסט איסכמי, מוכתמים עם סגול cresyl. 2A איור מראה מההיפוקמפוס חולדת דמה המופעלים אשר מציגה מורפולוגיה נורמלית, כולל CA1 ללא פגע. איור 2 מדגים את נושא ההיפוקמפוס לאיסכמיה / ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המודל שתואר כאן מייצר עלבון איסכמי למוח, אשר יכול להתרחש כתוצאה ממעצרו וההחייאה, מתן פציעה דומה לזו שנמצאה בבני אדם. שיטה זו להפקת איסכמיה המוח הגלובלית היא אחד מפרוטוקולים מרובים. אנו משתמשים בפרוטוקול זה ובראשונה לשיעורה הנמוך comparably התמותה, התאוששות מהירה, ותוצאות לשחזור. מודל המעצר / החייאת הלב הוא לטעון את המודל הכי הרלוונטי מבחינה קלינית, לעומת זאת מבחינה טכנית הקשה ביותר להתרבות כל הזמן. מודל 4VO של איסכמיה המוחית העולמית הוא עוד פרוטוקול נפוץ, רב ערך בעובדה שכל ארבעת כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש החוקרים אין סכסוכים כספיים של עניין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>שם החומר
5-0 VICRYL תפר, חיתוך הפוך EthiconJ391H
אזמל, מס' 10Swann-Morton6601
ספוגי גזהפישר22-362-178
18G x 1 ½ במחטBD305201
23G x 1 במחטBD305145
26 גרם x 3/8 במחטBD305110
18 גרם x 1 & #188; קטטרEXEL26735
1 מ"ל מזרקBD309659
10 מ"למזרק BD309604
60 מ"ל מזרקBD309653
SurgilubeHenry Schein1152666.9
% מי מלח, פלסטיק IV תיקהנרי שיין1537468
תפר 3-0 משיהנרי שיין1007842
משחת עיניים Puralubeהנרי שיין3390017
בטדיןהנרי שיין6903564
מגבת סטרילית וילוןMoore Medical14170
צינורות פוליאתילן, 50427411אינטרמדיקי
Stopcock, 3 waySmiths medicalMX9311L
שם התרופה
AERRANE (isoflurane)Henry Schein2091966
Mapap Liquid (Tylenol)Major Pharmaceuticals1556
Kedavet (ketamine)Ketathesia ButneyNDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)Lloyd Labs4881
HeparinAPP Pharmaceuticals504011
שם כימי
Paraformaldehyde prillsElecron Microscopy Sci.19202
2-מתילבוטןסיגמא270342
קרזיל סגול אצטטסיגמאC5042
סוכרוזסיגמאS9378
<חזק>תוכנה
ImageJNIH

מקורות

  1. Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
  2. Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
  3. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
  4. Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
  5. Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
  6. Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
  7. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
  8. Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
  9. Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
  10. Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
  12. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978(2011).
  13. Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
  14. Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
  15. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
  16. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
  17. Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
  18. Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
  19. Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39(1999).
  20. Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
  21. Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
  22. Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
  23. Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
  24. Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
  25. Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
  26. Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
  27. Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
  28. Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
  29. Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
  30. Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
  31. Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
  32. Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חסימת עורק הקרוטיסקנולציה של עורק הפמורליהיפוטנזיה סיסטמיתנוירונים בהיפוקמפוס באזור CA1כימות נזק נוירונליImageJ Cell Counterניטור המודינמירפרפוזיה פוסט-איסכמית
ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.