מאמר שיטה

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/50176

⸱

1 במרץ 2013

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת"ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסירת גן ללא ויראלי באמצעות חלקיקים פולימריים התפתחה כגישה אטרקטיבית לריפוי גנטי לטיפול במחלות גנטיות 1 וכטכנולוגיה לרפואת רגנרטיבית 2. בניגוד לוירוסים, אשר יש להם בעיות בטיחות משמעותיות, חלקיקים פולימריים ניתן תוכנן להיות רעיל, אינו immunogenic, הלא מוטגניות, קל לסנתז, כימי תכליתי, מסוגל לשאת מטען גדול יותר חומצות גרעין ומתכלה ו / או לסביבה מגיב. פולימרי קטיוני עצמי להרכיב עם DNA הטעון שלילי באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית ליצירת קומפלקסים על בסדר הגודל של 100 ננומטר, מכונות חלקיקים פולימריים נפוצים. דוגמאות לחומרים ביולוגיים המשמשים ליצירת חלקיקים ננומטריים משלוח polycationic גן כוללות, polyphosphoesters polylysine, פולי (amidoamines) של וpolyethylenimine (PEI), שהוא מהמדף את שאינם מתכלה, פולימר קטיוני הנפוץ למסירת חומצות גרעין 1,3. פולי (בטא אמיניתאסתר) של (PBAEs) הוא סוג חדש יותר של פולימרי 4 קטיוני שhydrolytically מתכלה 5,6 והוכחו כיעילים במשלוח גן לסוגי תאים קשים לtransfect כגון תאים אנושיים רשתית האנדותל (HRECs) 7, תאי עכבר חלב אפיתל 8, תאי אדם סרטני במוח 9 ו macrovascular (וריד טבור אנושי, HUVECs) תאי אנדותל 10.

פרוטוקול חדש לאפיון חלקיקים פולימריים ניצול Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) מתואר. בגישה זו, היא התפלגות גודל החלקיקים וההפצה של מספר פלסמידים לחלקיק מתקבלות 11. בנוסף, בדיקת תפוקה גבוהה 96 היטב צלחת transfection לסינון מהיר של יעילות transfection של חלקיקים פולימריים מוצגת. בפרוטוקול זה, (אסתר בטא אמינו) של פולי (PBAEs) משמשים כמודל פולימרים ותאי האנדותל רשתית אנושיים (HRECs) משמש כמותאים אנושיים דלים. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להעריך כל nanoparticle פולימרים וכל סוג תא של עניין בפורמט צלחת רבה כן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קביעת מספר פלסמידים והמורכבים לnanoparticle חשובה לתכנן אסטרטגיות יעילות nanoparticle מבוססות גני מסירה, במיוחד לשיתוף מסירה של פלסמידים מרובים לאותו יעד תא, לעתים קרובות יש צורך בתכנות מחדש של תאי גזע מחקרים 12. גישות אחדות כדי לחשב את מספר פלסמידים הקשורים nanoparticle אחת כבר תאר, וכל גישה יש חסרונות בטכניקות המשמשות להערכה 13-16. תיוג נקודה קוונטית (QD) בשילוב עם TEM נעשה שימוש כדי לאמוד פלסמידים לחלקיקי חלקיקי chitosan מבוססים. הערכה עם טכניקת QD זה היא מסובך בשל הצורך לתייג את ה-DNA, שעשוי לשנות את תכונותיו הרכבה עצמית: האפשרות שהדנ"א ללא תווית הכמוס הוא אינו מזוהה באופן ישיר; פלסמידים וQDs בתמונות TEM 2D של חלקיקי פוטנציאל חופפים; ו הנחות מפשטות אחרות 13. גישה חלופית שהיאpplicable כאשר microdomains הורה קיים בחלקיקים נעשה שימוש כדי ללמוד מתחמי Lipopolyamine-DNA באמצעות מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון הולכה (cryo-TEM), פיזור קרן ה-X, ופיזור אור דינמי (DLS) 14,15. למרבה הצער, חומרים כגון החלקיקים פולימריים נחקרו כאן אינם ישימים בשיטה זו. . במחקר אחר, קולינס ואח' השתמש בטכניקת זרימת חלקיקי תמונת ניתוח ללמוד (יס) 16 מתחמים המכיל פפטיד / דנ"א, אולם השיטה שלהם יכולה רק להעריך חלקיקים גדולים יותר, בגודל 16 מיקרון. לפיכך, לאחרונה פותח בדיקה חדשה וגמישה כדי לכמת את מספר פלסמידים לnanoparticle 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זריעת תאים

  1. אל תאפשרו לתאים לגדול ל overconfluency. השתמש בתאי מעבר מוקדמים כאשר transfecting תאים ראשוניים.
  2. עשרים וארבע שעות לפני transfection, trypsinize התאים, ספירת התאים באמצעות hemocytometer, ולדלל את השעית התא עם תקשורת כדי להשיג צפיפות התאים הרצויים (תאים / נפח). תאי זרע לתוך רקמה ברורה התרבות טופלו צלחות שטוחות תחתונות 96-כן באמצעות מאגר וpipettes הרב ערוציים. הצפיפות שנבחרה צריכה לתת 70-80% confluency ביום transfection. לדוגמה, כפי שמוצג בטבלת המס '1, התאים דוללו ל25-50 תאים / μl לנתוני transfection מוצגים כאן.

2. Transfection תא

  1. דילול של פולימר ומניות ה-DNA. הפשר פתרוני מניות DNA ופולימר בטמפרטורת חדר (RT). לדלל פתרון מניית DNA פתרון פולימר מניות ו, בנפרד בצלחות 96-כן ברורות באמצעות 12 ערוצי פיפטה, עם הממס המתאים לריכוזים הנדרשים כדי להשיג את משקל הפולימר הרצוי ליחסים שבין משקל DNA (wt / wt). במקרה זה, נבחר הממס הוא 25 מ"מ חיץ נתרן יצטט (pH = 5.2).
    1. דנ"א דילול. בדרך כלל, ה-DNA מאוחסנת ב1 מ"ג / מ"ל מדולל בחיץ נתרן יצטטו לריכוז של 0.03-0.06 מ"ג / מ"ל בצלחת ברורה שאינה רקמת תרבות מטופלים-96-היטב (אחד גם לניסוח אחת). לוח 2 מראה פרוטוקול ה-DNA האופייני לדילול ניסוח בודד המשמש לtransfect ארבע בארות לשכפל בצלחת 96 היטב נזרעה עם תאים מהשלב 1.
    2. דילול פולימר. פתרון 100 מ"ג / מיליליטר הפולימר / DMSO מדולל בחיץ נתרן יצטט פי הריכוז הנדרש כדי להשיג את הפולימר הרצוי ליחס ה-DNA wt / wt. טווח יחסי wt / wt משמשים בדרך כלל למסירת גן עם פולי s (אסתר בטא אמינית) (PBAEs) הוא 20 עד 100. פולימרי PBAE בדילול 1 עד 10 מ"ג / מ"ל, ואחרי הדילול עמrotocol כפי שמוצג בטבלה 3. את דילולי הפולימר ניתן לבצע בצלחת ברורה שאינה רקמת תרבות מטופלים-96-היטב שמתאימה לאורינטצית המדגם של צלחת הדילול-DNA.
  2. היווצרות nanoparticle. הוסף פתרון PBAE לנפח שווה של פתרון ה-DNA פלסמיד באמצעות 12 ערוצי פיפטה ומערבב נמרצות. תן לדגור בתערובת RT למשך 10 דקות על מנת לאפשר הרכבה עצמית.
  3. transfection nanoparticle. בעקבות הרכבה עצמית, 20 חלקיקי μl מתווספים לטוב לdropwise התרבות הבינונית באמצעות 12 ערוצי פיפטה. בארות לשכפל נותרות ללא טיפול או transfected עם חומרים כימיים מסחרי קיים כקבוצת ביקורת. תאי transfected מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות עד ארבעה שעות ולאחר מכן את הבארות מוחלפות בתקשורת טריה (100 μl / טוב). הבחירה בזמן הדגירה תהיה תלויה בקו הסלולרי, תנאי התרבות, ומערכת transfection. ההבדל בtransfectionיעילות ורעילה לתא, כתוצאה משינוי תקופת דגירה תהיה לכמת את פרוטוקול הניתוח המתואר בשלב 3.

3. ניתוח של יעילויות Transfection ורעיל לתא

יעילות transfection הוא נתח באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות cytometer זרימה הארבעים ושמונה שעות שלאחר transfection. רעיל לתא הוא נתח באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות 96 assay אחד המימי CellTiter עשרים וארבע שעות שלאחר transfection.

  1. מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חזותי לנתח את הבארות לביטוי של גן הכתב transfected (לדוגמה, EGFP או DsRed) באמצעות ערוץ פלואורסצנטי המתאים. לרכוש תמונות לכל באר, בחירת תחומי ההשקפה שמייצגים כראוי את יעילות transfection לניסוחים המסוימים (איור 1). רשום כל רעילות תא נצפתה חזותי.
  2. Cytometry זרימה.
    1. השתמש pipettes הרב ערוציים להכין צלחת 96-גם עבור cytometry זרימה. לשטוף עם PBS, trypsinize עם 30 μl / גם של טריפסין / EDTA, לנטרל עם חיץ FACS μl 170 (PBS + 2% FBS), פיפטה מעלה ומטה בכל באר, כולל בקצוות, ולהעביר את כל הנפח של 200-μl כל באר בקידוחים מקבילים בצלחת עגולה תחתונה או V-96-תחתית היטב.
    2. צנטריפוגה את הצלחת ב 130 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. הסר 170 μl תקשורת מכל תאים וגם פיפטה לresuspend תוך הימנעות בועות. כדי להשתמש ביכולת קיום כתם כמו יודיד propidium (PI), להוסיף 10 μl של FACS חיץ + PI (50:1 FACS חיץ: PI דילול; ריכוז PI מניות 1 מ"ג / מ"ל) לכל באר. מייד מקום על קרח ולכסות מאור.
    4. התחל cytometer C6 Accuri הזרימה, HyperCyt המצורף 96-היטב, ותוכנת HyperView. השתמש עיצוב HyperView וכרטיסיות פרוטוקול לבחור עמ המתאיםסוג מאוחר, פריסת צלחת, והגדרות אחרות כגון רעידות / לגימה / לשטוף / לנער זמן. לפרוטוקול לעיל, את הפרמטרים הבאים שמשו, צלחת מראש ממשלה לרגע אחד, וטלטלת צלחת מראש למשך 30 שניות ב2400 סל"ד. זמן הלגימה נקבע ל15 שניות במהירות 15 סיבובים לדקה, בדיקה לשטוף היטב עבור כל 2 שניות, ובין היטב ללחוץ את כל 12 בארות ל12 שניות ב -2400 סל"ד. לנער היטב בין חשוב לשמור על התאים וכן פוזרו בתקשורת, לשיפור ביכולת לעבד את הנתונים על ידי לרבות הפסקות זמן בין קבוצות של בארות (במקרה זה 12 שניות).
    5. השתמש בכרטיסיית זיהוי ובכן HyperView לעבד את הנתונים והנפרדים לתוך היטב המתאים (איור 2). על מנת לזהות את הבארות הבודדות, זה יכול לעזור להשתמש במסנן של תוכנת הרעש, כמו גם כולל בסיס אפילו מסנן תחת ההגדרות המתקדמות.
    6. לכמת אחוז מתאי חי transfected חיובי על ידי gating המתאים להפריד הפופ שונהulations (איור 3). ראשון להציג את נתוני הזרימה בעלילת פיזור FSC לעומת SSC כדי תאים נפרדים מפסולת (איור 3 א). אם יודיד propidium (PI) שמש, שער אוכלוסיית התא הבודדה והשקפה שנתונים על עלילת FSC לעומת FL3 על מנת להפריד בין תאי חיים מתאים ואת שער תאי חיים מתים. על מנת לכמת את מספר תאי transfected, להציג את אוכלוסיית התא החייה בערוצים המתאימים, למשל, ניתן לראות בGFP FL1. שימוש באוכלוסייה לא המטופל, שער לתאים שלא טופל על מנת לזהות את אות הרקע (איור 3 ב '). תאי transfected חיובית אז יכולים להיות מבודדים באמצעות השער הזה ועל ידי הצגת אוכלוסיות transfected באמצעות שני פיזור וחלקות גובה (האיור 3C ו3D). אולי יש רצף של תאי transfected חיובי, כפי שtransfected תאים שונים בדרגות שונות של קרינה.
  3. CellTiter 96 assay מימי אחד
    1. Transfect צלחת אחרת בדיוק באותו אופן למדידות רעילות לתא.
    2. מיליליטר premix 1 לפתרון CellTiter 96 המימי אחד assay עם 10 תקשורת טריה מ"ל. הסר את המדיה מתאים ולהשתמש פיפטה רב להוסיף 110 μl של פתרון premixed + תקשורת לטובה.
    3. מדוד את הספיגה ב490 ננומטר כל מרווח שעה 1-4 שעות עד לספיגה מהיטב עם מצב מטופל היא בטווח יניארי של assay. כולל ארבע בארות בקרה עם תקשורת + פתרון היחידה לקריאת ספיגת רקע.
    4. ממוצע ספיגת ערכים מהארבע הבארות לשכפל למצב ולחסר ספיגת הרקע הממוצעת מכל ממוצע. לנרמל את הממוצע המתוקן לכל מצב טיפול לממוצע המתוקן של מצב המטופל כדי לקבוע את כדאיויות תא אחוזים.
_title "> 4. Nanoparticle מדידות עם נ.ת. ע וחישובי חלקיקים Per פלסמיד

  1. ראש מערכת fluidics של NS500 NanoSight ידי הפעלת משאבת diluent קדימה בכ 1/5th מהירות מרבית ומשאבת המדגם אחורה בכ 1/10th המהירות מרבית. המשך עד שמערכת fluidics סמוקה diluent.
  2. הכן את החלקיקים כדי להיות מנותחים. במקרה של PBAEs, בנפרד לדלל את מניות DNA פלסמיד (1 מ"ג / מ"ל) והמנייה PBAE (100 מ"ג / מ"ל) בחיץ נתרן יצטט (25 מ"מ, 5 pH) בצינורות Eppendorf.
  3. לדלל את ריכוז ה-DNA פלסמיד ל0.06 מ"ג / מ"ל. ריכוז פולימר יכול להשתנות בהתאם ליחס משקל משקל הנדרש של פולימר ל-DNA (לדוגמה, עבור 60 חלקיקים wt / wt, הפולימר מדולל ל -3.6 מ"ג / מ"ל).
  4. הוסף פולימר הפתרון לנפח שווה של פתרון ה-DNA פלסמיד ומערבב נמרצות. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות כדי לאפשר להרכבה עצמית.
  5. דילאוטה פתרון nanoparticle 100-לקפל לתוך PBS על מנת שריכוז nanoparticle להיות בטווח המתאים לנ.ת. ע ולקבל נפח סופי של לפחות 500 μl.
  6. טען את הדגימה לNanoSight על ידי נחת צינור הטעינה לתוך מדגם אפנדורף הצינור (איור 4 א). הקפד לא להכניס בועות אוויר.
  7. במצב צילום, להגביר את רמת המצלמה עד שניתן לראות חלקיקים. התאם את המיקוד כך שהחלקיקים להיראות חלקים (איור 4 א ו -4 ב).
  8. בעוד שבמצב רגיל, להתאים את רמת המצלמה מעבר לנקודה שכל החלקיקים ניתן לראות על מסך. אז להקטין את רמת המצלמה לרמה הנמוכה ביותר כך שהחלקיקים יכולים כל עדיין לא אותרו. אם רמת מצלמת ביניים יש צורך, נכנס למצב מתקדם ולשנות את צמצם המצלמה ולזכות לרמות המתאימות.
  9. חזותי לבדוק כדי לוודא שיש בין 20-100 חלקיקים על היםקרין. מספר אידיאלי למעקב nanoparticle הוא כ 50 חלקיקים. אם יש יותר מדי או מעט מדי, שטוף NS500, להתאים לדילול PBS, ולטעון מחדש את המדגם.
  10. התאם את משך הכיבוש על פי הטבלה במצב הרגילה. בדרך כלל 30-60 שניות הן אורך ללכוד מתאים (איור 4 ב).
  11. כדי לטעון את הדוגמא הבאה, שטוף את המערכת, ואז המדגם החדש לטעון מחדש.
  12. לאחר קטעי וידאו שנתפסו, המשך שלב העיבוד על ידי פתיחת קובץ וידאו.
  13. יש מספר הפרמטרים שיכול להיות המכוון כדי טוב ביותר לעבד וידאו (האיור 4C). המטרה היא לבחור בפרמטרים בצורה הטובה ביותר ללכוד כל חלקיק על המסך, כפי שמצוין על ידי סימן צלב אדום על המסך מעל כל חלקיק (איור 5).
  14. הגדל את רווח המסך טוב יותר לראות את החלקיקים. תחת המצב הרגיל או מתקדם, בחר האוטומטי להתאים לפרמטרים ידי clickinגרם התיבות המתאימות. במקרה שההגדרות האוטומטיות איננו מספקות בחרו חלקיקים, unclick התיבה ולהגדיר באופן ידני את הפרמטרים (האיור 4C).
  15. ברגע שכל החלקיקים נאספים על מסך, לחץ על הלחצן התהליך של התוכנה לעיבוד קובץ וידאו (האיור 4C). זה מספק את התפלגות גודל חלקיקים, ממוצעי גודל, כמו גם ריכוז חלקיקים.
  16. כדי לוודא שריכוז החלקיקים הוא מדויק, לשנות דילול PBS, כגון על ידי הגדלת דילול על ידי 2x, וחזור על התהליך לעיל. מדידת דילולים מרובים של אותו המדגם מומלץ לוודא שמדידת הריכוז של המדגם היא מדויקת. מגוון טוב למדידה הוא 10 7 9 -10 חלקיקים / מ"ל.
  17. ודא שכל פלסמידים ישולבו חלקיקי ג'ל אלקטרופורזה על ידי ההפעלה של החלקיקים ולהעריך האם כל הדנ"א חופשי הוא הווה.אם לא כל פלסמידים כמוסים, להשתמש בטכניקות מקובלות למדידת ספיגת DNA כדי לכמת פלסמידים כמוסים בסך הכל.
  18. כדי לחשב את המספר הממוצע של פלסמידים לחלקיקים, לחלק את ריכוז פלסמיד המארז הכולל של ריכוז החלקיקים הנמדד נת"ע. על מנת לאמוד את התפלגות מדגם פלסמיד לחלקיקים, להשתמש תחילה היסטוגרמה גודל חלקיקי נת"ע כדי לחשב את החלק היחסי של כל סל הנפח 1-nm של חלקיקים. הכפל הפצת שבריר כרך זה על ידי הכמות הכוללת פלסמיד להשיג מספר פלסמידים בכל סל. מחלק את המספרים האלה במספר חלקיקים בכל סל כדי להשיג את מספר פלסמידים-החלקיק לחלקיק לכל גודל (איור 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של דוגמה של transfection המוצלח של HRECs עם EGFP פלסמיד. תמונת brightfield כדאי לוודא שתאים לשמור המורפולוגיה הרגילה שלהם. בנוסף, מבחני תא כדאיות, כגון MTS או מבחנים דומים, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את רעילויות nanoparticle 7. cytometry זרימה, כפי שתואר, יכול לשמש כדי לכמת את יעילות transfection. בעת שימוש בקובץ מצורף הצלחת רב גם HyperCyt, נתונים צריכים להיות מעובד בהתאמה על מנת לזהות בצורה נכונה את הבארות. כפי שנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים הנ"ל מתארים שיטות להערכת יעילות transfection של ניסוחי nanoparticle, כמו גם דרך לאפיון גודל החלקיקים וטעינת ה-DNA של החלקיקים. מספר פלסמידים לחלקיק הוא פרמטר חשוב שיכול לעזור לנבא את היעילות של החלקיקים ויכול לשמש גם לקביעת מינון. Nanoparticle מעקב וניתוח יכול להתבצע במגוון של תמיסות מימיות שונות, כגון אלה שונים בריכוז מלח. לעתים אפיון זה מתבצע בPBS, לחקות מלח פיסיולוגי. בעוד אומד ב PBS יכול לתת הערכה טובה של גודל החלקיקים בתקשורת או בתמיסת מלח פיזיולוגית, כמות ה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים דיווחו שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) וNIH R21CA152473 לקבלת תמיכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגיב
נאגר מלוח פוספט, 1x (PBS) Invitrogen 10010
BulletKit EGM-2MV Lonza CC-3202
טריפסין Invitrogen 25300
חיץ נתרן יצטט סיגמה אולדריץ S7899 לדלל במים ל25mm deionized
sulfoxide דימתיל סיגמה אולדריץ 276855
pEGFP DNA Biopharmaceuticals האילם NA
דנ"א DsRed Addgene 21718
PEI, הסתעף סיגמה אולדריץ 408727
96 מימיים CellTiter אחד Promega G3580
חומרים
דירה תחתונה ברור צלחת 96-כן, סטרילי Sarstedt 82.1581.001
תחתון ברור סביב צלחת 96-היטב, סטרילי Sarstedt 82.1582.001
ערוץ 12-Finnpipette Thermo Scientific NA 5-50 ו50-300 μl
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Zeiss NA מספר דגם: AX10
cytometer הזרימה Accuri C6 BD Biosciences NA
קובץ מצורף HyperCyt Intellicyt NA
NS500 NanoSight NA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
  2. Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
  3. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
  4. Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
  5. Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
  6. Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
  7. Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
  8. Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
  9. Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
  10. Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947(2009).
  11. Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
  12. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  13. Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
  14. Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
  15. Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
  16. Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
  17. Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Polymeric NanoparticlesGene DeliveryNanoparticle Tracking AnalysisHigh throughput Flow CytometryParticle Size DistributionTransfection EfficiencyHuman Retinal Endothelial CellsPoly beta amino ester sPlasmid Per ParticleBiodegradable Polymers

מאמרים קשורים