הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סימון מטבולי של רנ"א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ"א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

27K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

8 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.

תקציר

הפיתוח של microarrays השלם transcriptome והדור הבא של רצף יש מהפכה ההבנה של המורכבות של ביטוי גני הסלולר שלנו. יחד עם הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המעורבים, מידות מדויקות של קינטיקה הבסיסית הפכו להיות חשובה יותר ויותר. כאן מתודולוגיות רבי עוצמה אלה, עומדות בפני מגבלות עיקריות בשל מאפיינים פנימיים של דגימות תבניתו הם לומדים, RNA הסלולרי כלל כלומר. במקרים רבים שינויים ברנ"א הסלולרי כלל להתרחש גם לאט מדי או מהר מדי כדי לייצג את האירועים המולקולריים שבבסיס וקינטיקה שלהם עם רזולוציה מספיקה. בנוסף, התרומה של שינויים בסינתזת רנ"א, עיבוד, וריקבון אינה מובחנות בקלות.

לאחרונה פיתחנו פרופיל גנטי ביטוי ברזולוציה גבוה כדי להתגבר על המגבלות האלה. הגישה שלנו מבוססת על תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouriלסעוד (ובכך גם המכונה 4sU תיוג) ואחריו טיהור קפדני של RNA עבד מחדש באמצעות biotinylation תיאול ספציפי וחרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. זה ישים למגוון רחב של יצורים בעלי חוליות, לרבות תסיסנית, ושמרים. אנחנו מיושמים בהצלחה 4sU תיוג ללמוד קינטיקה בזמן אמת של פעילות גורם שעתוק, לספק מדידות מדויקות של RNA מחצית חיים, ולקבל תובנות לתוך רומן קינטיקה של רנ"א עיבוד. לבסוף, יכולים להיות מועסקים מודלים חישוביים ליצירת ניתוח משולב, מקיף של המנגנונים המולקולריים שבבסיס.

מבוא

פרופיל גנטי ביטוי הוא כלי מרכזי המשמש ללמוד תהליכים תאיים וברשת יחסי הגומלין המורכבת המשויכת. שפע מחקרים על mRNA היו בדרך כלל בשיטה של ​​בחירה כדי להשיג תובנות בסיסיות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס. הפיתוח של microarrays השלם transcriptome 1, ולאחרונה רצף של הדור הבא, של רנ"א (RNA-אילך) 2-4 מונע את הגישה הזו. בעוד טכנולוגיות אלה חוללו מהפכה ההבנה של המורכבות של ביטוי גני הסלולר שלנו שהם עומדים בפני מגבלות עיקריות בשל מאפיינים פנימיים של תבנית המדגם שלהם, כלומר סך הסלולרי RNA. שינויים ראשונים, לטווח קצר ברמות רנ"א הכל אינם תואמים שינויים בשערי שעתוק, אבל מטבעם תלויים ברנ"א מחצית החיים של התמלילים, בהתאמה. בעוד אינדוקציה פי חמישה מתמליל, קידוד לדוגמה קצר לגורם שעתוק, תהיה בקלות להבחין ברנ"א הכלבתוך שעה, אותו הגיוס של תמליל, למשל קידוד חיים ארוכים לאנזים המטבולי, יישאר כמעט בלתי נראה. בנוסף, גם שלם כיבוי (> למטה רגולציה של פי 1,000) בשיעור השעתוק של גן ממוצע עם RNA מחצית חיים של חמש שעות תהיה פשוט לקחת חמש שעות לרמות רנ"א הכל לירידה של רק כפולה . לכן, ניתוח של RNA הכולל מעדיף את זיהוי של עד הוויסות של תמלילים קצרים ימים, שרבים מהם לקודד לגורמי שעתוק וגנים עם פונקציות רגולטוריות 5. בנוסף, המפל קינטית הנכון של רגולציה הוא מוסתר ולא יכול להיות מובחן אירועי איתות ראשוניים משני. שניהם, בתורו, עלולים לגרום להטיה משמעותית בניתוחים ביואינפורמטיקה במורד הזרם. שנית, לא ניתן לייחס שינויים ברמות RNA הכולל לשינויים בסינתזה או ריקבון רנ"א. מדידות של זה האחרון דורשות גישות פולשניות סלולריים, כגון חסימת transcriptiעל שימוש actinomycin 6 ד ', וניטור מורחב של ריקבון מתמשך RNA לאורך זמן. עם ה-mRNA ממוצע מחצית חיים בתאי יונקים של 5 - 10 שעות 5,7, רמות ה-mRNA של רוב הגנים תהיה ירדו רק על ידי פחות מכפול לאחר כמה שעות של מעצר תעתיק. הבדלים קטנים ולא אלו לגרום למדידות לא מדויקות בעליל של mRNA מחצית חיים עבור רוב הגנים סלולריים בשל אופי מעריכי של משוואות המתמטיות המשמשות כבסיס. לבסוף, בעוד RNA-ואילך בסך הכל הסלולרי RNA גילה כי כמחצית מהגנים שלנו כפופה לאירועי שחבור חלופיים 8, קינטיקה הבסיסית, כמו גם את המנגנונים הדינמיים מנחים רגולציה רקמות והקשר ספציפי של RNA עיבוד יישאר הבין היטב. בנוסף, התרומה של רנ"א עיבוד לביטוי ההפרש גן, במיוחד עבור RNAs ללא קידוד, עדיין לא נקבע. בסך הכל, על המגבלות האלה מייצגות מכשולים עיקריים לדוגמנות הקינטית bioinformatic של המנגנונים המולקולריים שבבסיס.

לאחרונה פתחנו גישה, פרופיל גנטי ביטוי ברזולוציה גבוה המכונה, כדי להתגבר על בעיות אלה 5,7,9. היא מבוססת על תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד באמצעות 4-thiouridine (4sU תיוג), נגזרת uridine מתרחש באופן טבעי, ומספקת גישה ישירה לתמלילים חדשים שעבדו עם התערבות מינימאלית בצמיחת תאים וביטוי גנים (ראה איור 1) 5, 10-12. חשיפה של תאים אוקריוטים לתוצאות 4sU בספיגתו המהירה, זירחון 4sU-אדנוזין, והכללתו RNA החדש שעבד. בעקבות בידוד בסך הכל הסלולרי רנ"א, רנ"א שבריר 4sU שכותרתו הוא biotinylated תיאול-במיוחד ליצירת קשר דיסולפיד בין ביוטין ואת הרנ"א חדש שעבד. לאחר מכן ניתן להפריד 'סה"כ סלולרי RNA' כמותית לכותרתו ("זה עתה עיבד ') וללא תווית (' מראש existinרנ"א) "G עם טוהר גבוה באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. לבסוף, שכותרתו RNA הוא התאושש מן החרוזים פשוט על ידי הוספת סוכן הפחתה (למשל dithiothreitol) ביקוע אג"ח דיסולפיד ומשחרר את הרנ"א חדש שעבד מהחרוזים.

RNA עיבד חדש מתאר את פעילות תעתיק של כל גן במהלך פרק הזמן של חשיפת 4sU. 4sU תיוג בלוח הזמנים של דקות ובכך מספק תמונת תמונת מצב של ביטוי אוקריוטים גן ותבנית אידיאלית לניתוחי bioinformatic מורד זרם (לדוגמה: ניתוח אמרגן). במקרים בהם ניתן להניח תנאי מצב יציב, את היחס של זה עתה עיבד / סך הכל, שזה עתה עיבד / ללא תווית וללא תווית / RNA הכולל לספק גישה לא פולשנית לרנ"א המדויק מחצית חיים 7,13. בנוסף, חשוב לציין כי RNA החדש שעבד מטוהר לאחר קטן כמו 5 דקות של 4sU תיוג (5 דקות 4sU-RNA) הוא צעיר מ -15 ו -60 דקות 4sU-RNA.בעת ביצוע שני אולטרה קצר וארוך יותר בהדרגה 4sU תיוג בהגדרה ניסיונית אחת בשילוב עם RNA-ואילך, קינטיקה של רנ"א עיבוד מתגלה ברזולוציה של נוקלאוטיד 9. לבסוף, ניתוחים בזמן קורס של RNA חדש שעבד ומוחלט בשילוב עם מודלים חישוביים לאפשר ניתוח אינטגרטיבי של סינתזה וריקבון 14-RNA.

לסיכום, גישה זו מאפשרת ניתוח הישיר של הדינמיקה של סינתזת RNA, עיבוד, והשפלה בתאים אוקריוטים. זה ישים בכל אורגניזמים המודל הגדולים, כולל יונקים, חרקים (דרוזופילה), דו חיים (Xenopus), ושמרים 5,15,16. זה תואם באופן ישיר עם microarray ניתוח 5,17, RNA-9,13,14 ואילך, והוא ישים in vivo 12,15. הנה, אנחנו פירוט המתודולוגיה לתייג, לבודד, ולטהר את RNA החדש שעבד בתאי יונקים בתרבית. בנוסף, potentiבעיות ואת החסרונות al הם דנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תיוג מטבולית עם 4-thiouridine

הפוך את תכנית מפורטת של ההתקנה / לוח הזמנים של הניסוי, למשל מתי להוסיף 4sU לתרבית תאים ומתי לקצור את הדגימות. תכנית במשך לפחות 5 דקות בין כל מצב. טיפול בתאים של תנאי אחד בלבד בכל פעם. להתמודד עם מקסימום. 3 - 5 מנות בכל זמן נתון. להתמודד עם תאים במהירות אפשרית כדי למזער את השינויים בטמפרטורה וברמות CO 2. הימנע מחשיפת התאים לאור בהיר לאחר 4sU הוא הוסיף שדבר עלול לגרום לcrosslinking של רנ"א 4sU שהכותרת לחלבונים תאיים.

התחל של תיוג

  1. הפשירו 4-thiouridine (4sU) ממש לפני שימוש וטפטף כמות הנדרשת של 4sU עבור כל תנאי לתוך צינור פלקון סטרילי.
  2. קח את הכמות הנדרשת של תרבית תאים בינוניות (5 מ"ל לכל צלחת 10 ס"מ) את המנות ולהוסיף לצינור פלקון המכיל 4sU ומערבבים היטב. להסיר ולסלק את המדיום שנותר מאת הכלים.
  3. החל אחורי בינונית מכיל 4sU את הכלים.

הסוף של תיוג

  1. סור בינוני תרבות תא מהתאים. הוסף 5 מ"ל של Trizol לכל צלחת. לניסויים מורכבים, כולל נקודות זמן מרובות או תנאים, צעד זה נעשה הכי טוב על ידי שני אנשים, אחד הסרת בינונית, אחר הוספת Trizol וקציר lysate.
  2. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר למשך תמוגה תא שלמה.
  3. השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי לשטוף את הצלחת בזהירות עם Trizol הוסיף. זה מסייע תמוגה תא שלמה ומדגם התאוששות. להתמודד עם טיפול כTrizol הוא מסוכן ביותר כאשר מקבלים במגע עם עור או עיניים! יש תרופה לכוויות פנול בהישג היד (למשל פוליאתילן גליקול 300 או 400 בספירט תעשייתי (70:30)). העבר את הדגימות לצינור פלסטיק. שים לב כי צינורות פלקון סטנדרטיים אינם להתנגד כוחות g גבוהים אלה). דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C לחודש אחד לפחות עד רנ"א הכל אנישל מוכן.

2. RNA הכנה באמצעות שינוי Trizol פרוטוקול

  1. הוסף 1 מיליליטר כלורופורם (0.2 מ"ל למ"ל Trizol) ולנער במרץ במשך 15 שניות. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 - 3 דקות.
  2. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  3. העבר את השלב עליון מימית (המכיל RNA) לצינור חדש 15 מיליליטר פוליפרופילן.
  4. הוסף ½ נפח התגובה של רנ"א ממטרים חיץ וisopropanol (למשל כדי 3 מ"ל supernatant חיץ להוסיף 1.5 מיליליטר RNA ממטרים ו1.5 מ"ל isopropanol).
  5. מערבבים היטב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
  6. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant.
  7. ספין למטה בקצרה (5,000 × גרם במשך 30 שניות) ולהסיר isopropanol שייר עם 200 פיפטה μl.
  8. הוסף נפח שווה של 75% אתנול ולנער את הצינור עד לניתוק גלולה. ההסרה הימנע לשבור אותו לחתיכות קטנות רבות מכיוון שהדבר עלול לגרום לresiduaאתנול L קשה.
  9. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant.
  10. ספין למטה בקצרה רנ"א ולהסיר אתנול נותר עם טפטפת μl 200. חזור על השלב ולהסיר אתנול נותר עם טפטפת μl 20. לאחר שני שלבים אלה, אין ייבוש נוסף של גלולה צריכה להתבצע.
  11. הוסף 100 μl של H 2 O לתשואה צפוי RNA 100 מיקרוגרם ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 - 6 פעמים כדי לסייע בהמסת רנ"א.
  12. ממיסים ולפגל RNA על ידי חימום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (ייקר) ומקום באופן מיידי על קרח.
  13. למדוד ריכוז RNA ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop, בעקבות הוראות יצרן. ניתן לאחסן את זה RNA ב -80 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות.

3. Biotinylation תיאול ספציפי של RNA חדש בתעתיק

  1. התחל עם 60-80 מיקרוגרם של רנ"א הסלולרי בסך הכל.
  2. התיוג מהווה תגובה. פיפטה בפעולות הבאותסדר (RNA מיקרוגרם לכל):
    1. מאגר biotinylation 10x μl 1
    2. 7 RNA μl (המכיל 1 מיקרוגרם דילול RNA בnuclease ללא H 2 O)
    3. 2 ביוטין-HPDP μl (1 מ"ג / מיליליטר DMF)

תמיד להוסיף שעבר ביוטין, HPDP ולערבב באופן מיידי על ידי pipetting. במקרה ביוטין משקעים, תוכן DMF יכול להיות מוגבר לריכוז סופי של 40%.

  1. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1.5 שעות עם סיבוב.
  2. הוסף נפח שווה של כלורופורם. מערבבים במרץ. דגירה של 2 - 3 דקות, עד השלבים מתחילים להפריד ובועות מתחילות להיעלם.
  3. צנטריפוגה ב 20,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להעביר את השלב המימית העליון לתוך צינור חדש בזהירות.
  4. חזור על שלבים 3.4 ו -3.5 ועונה אחת. ייתכן שתרצה לבצע שלב זה ב2 צינורות ג'ל נעל שלב מ"ל כבדים כדי לצמצם את האובדן של רנ"א.
  5. RNA משקעים: תוספת 1/10 נפח 5 M NaCl ונפח שווה שלisopropanol לשלב מים.
  6. צנטריפוגה ב 20,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant.
  7. הוסף נפח שווה של 75% אתנול, צנטריפוגות ב 20,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant.
  8. ספין בקצרה ולהסיר אתנול שיורי עם 200 פיפטה μl.
  9. ספין בקצרה ולהסיר אתנול שיורי עם 20 פיפטה μl.
  10. אל תאפשר לרנ"א לייבוש. Re-להשעות אותו ב 50 - H 2 O μl 100 (~ 1 μl לכל 1 מיקרוגרם קלט RNA). מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 - 6 פעמים.
  11. לבדוק את איכות הרנ"א על ​​ידי ניתוח electrophoretical להוציא השפלה RNA.

4. ניתוח דוט כתם של 4sU-התאגדות (אופציונלי)

התאגדות 4sU ניתן לקבוע בקלות על ידי ניתוח כתם נקודה של רנ"א biotinylated. זהו צעד אופציונלי המאפשר פתרון בעיות והערכה של שיעורי התאגדות 4sU ביחס לשליטת אוליגו DNA biotinylated. עבור assay זה אנו Recommend באמצעות iodoacetyl-ביוטין במקום ביוטין-HPDP לbiotinylation של רנ"א 4sU שהכותרת בשלב 3.2. התוצאה היא בלתי הפיך של biotinylation 4sU-RNA. לכן, שיטות המבוססות על העמודה (RNeasy למשל) יכולות לשמש להתאוששות של כמויות הרבה יותר קטנות של RNA (למשל biotinylated 5 מיקרוגרם). אמנם RNA biotinylated באמצעות ביוטין-HPDP המתאים גם לassay זה, האות המתקבל הוא חלש יותר ויחס אות לרעש פחות נוח (איור 3).

  1. לעקוב אחר הפרוטוקול ל4sU תיוג ובידוד של רנ"א הסלולרי כלל, כמתואר בסעיפי 1 ו -2.
  2. Biotinylate 4sU שכותרתו RNA כאמור בסעיף 3 החלפת ביוטין-HPDP עם iodoacetyl-ביוטין ולבצע שתי עקירות כלורופורם כדי להסיר שאריות iodoacetyl-ביוטין מוגזמים לחלוטין.
  3. לשחזר RNA biotinylated על ידי המשקעים isopropanol / אתנול כמתואר או באמצעות גישה המבוססת על העמודה (למשל RNeasy) במקרה כמויות קטנות של RNA (<10 מיקרוגרם) נמצאים בשימוש.
  4. דגירה הממברנה זיטה במי nuclease עם הנדנדה למשך 10 דקות.
  5. קח את הקרום מחוץ למים nuclease ללא נוזלים עודפים ולהסיר על ידי הנחת בקרום בין שתי מגבות נייר נקיות ולחיצה בחוזקה. Air-ייבוש הקרום למשך 5 דקות יגרום נקודות יותר נחמדות.
  6. עבור כל דגימה, להכין 20 μl של 200 רנ"א ng / μl באמצעות חיץ קרח קר נקודת כתם מחייב (10 מ"מ NaOH, 1 mM EDTA). החל 5 μl דילול זה (כלומר 1 מיקרוגרם של רנ"א), כמו גם שלושה פי 10 דילולים הבאים (כלומר 100, 10, ו 1 ng-RNA, בהתאמה) לקרום זיטה על ידי pipetting. Pipetting דרך מדף ריק של טיפים פיפטה יכול להיות מועסק על מנת לספק מרווח מופץ באופן שווה. לחלופין, השתמש במנגנון כתם נקודה על פי הוראות היצרן.
  7. החל 5 μl של ביוטין שכותרתו DNA אוליגו בריכוזים הנעים בין 20 ng / μl עד 20 pg / μl (כלומר 100-0.1 ng אוליגו) כהמשך חיובירול לממברנה על ידי pipetting. השתמש מדגם biotinylated, 4sU-נאיבי כביקורת שלילית.
  8. אוויר יבש הקרום למשך 5 דקות.
  9. דגירה הממברנה למשך 30 דקות בחיץ 40 מיליליטר חסימה עם נדנדה.
  10. דגירה הממברנה עם 10 מ"ל של 1:1,000 peroxidase streptavidin-חזרת במשך 15 דקות (5 מ"ל + 20% + 10 SDS peroxidase streptavidin-חזרת μl 5 מ"ל PBS)
  11. לשטוף קרום פעמיים ב40 מ"ל PBS + 10% SDS (20 מ"ל PBS + 20 מ"ל 20% SDS) למשך 5 דקות.
  12. לשטוף קרום פעמיים ב40 מ"ל PBS + 1% SDS (38 מ"ל PBS + 2 מ"ל 20% SDS) למשך 5 דקות.
  13. לשטוף קרום פעמיים ב40 מ"ל PBS + 0.1% SDS (40 מ"ל PBS + μl 200 20% SDS) למשך 5 דקות.
  14. הסר עודף של נוזל על ידי הצבת בקרום בין שתי מגבות נייר נקיות ולחיצה עליהם בתקיפות.
  15. דמיינו HRP קרום הנכנס באמצעות ECL לפי הוראות יצרן.
  16. מניחים את הקרום בנייר כסף / שקית ניילון, להסיר בועות אוויר ודגירה במשך 2 דקות בחושך.
  17. לחשוף את הקרום לסרט 1 - 5 דקות.

5. הפרדה של רנ"א תווית וללא תווית באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופים

  1. חום כביסה חיץ (3 מ"ל לדגימה) עד 65 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. הכן טרי 100 מ"מ dithiothreitol (DTT) בnuclease ללא H 2 O. לעשות זאת על ידי decanting 15 - 30 מ"ג של אבקת DTT לתוך צינור פלקון 50 מ"ל נקי הונח על קנה המידה Ultra-בסדר. לשקול ולהוסיף כמות הנדרשת של nuclease ללא H 2 O.
  3. חום biotinylated דגימות RNA ל -65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לפגל ומקום באופן מיידי על קרח.
  4. מקום μMacs עמודות לדוכן המגנטי. אנו ממליצים שלא לעבד יותר מ -12 דגימות בכל פעם (6 - 8 דגימות הן אופטימליים).
  5. עמודות Miltenyi טרום לאזן עם טמפרטורת חדר 1 מיליליטר הכביסה חיץ. זה ייקח בערך 15 דקות.
  6. בינתיים, להוסיף 100 μl של חרוזים streptavidin ל50 - 100 μl של רנ"א biotinylated. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות עם רוטציה.
    7. < li> אם כל אחת מהעמודות לא יזם ניקוז על ידי החברה ניתן להקל על ידי לחיצה קלה על החלק העליון של העמודה עם אצבע עטוית כפפה. ברגע שהזרימה החלה לנקז את העמודות בקלות.
  7. להחיל את הרנ"א / חרוזים לעמודות. מחק את הזרימה דרך אלא אם כן אתה רוצה לשחזר את שבר RNA ללא תווית (ראה סעיף 7).
  8. לשטוף שלוש פעמים עם 0.9 מ"ל של 65 מעלות צלזיוס חיץ כביסה (1 טיפים פיפטה מ"ל להתכווץ כאשר pipetting חוצצים על 65 מעלות צלזיוס).
  9. לשטוף שלוש פעמים עם 0.9 מיליליטר טמפרטורת חדר הכביסה חיץ.
  10. RLT 700 פיפטה μl חוצץ (ערכת ניקוי MinElute RNeasy, Qiagen) לתוך צינורות חדשים 2 מ"ל ומניח אותם מתחת לעמודים.
  11. Elute את הרנ"א חדש שעבד לתוך מאגר RLT על ידי הוספת 100 μl של DTT מ"מ 100 לעמודות.
  12. בצע elution 3 דקות סיבוב שנייה מאוחר יותר לתוך הצינור אותו על ידי הוספת 100 μl נוסף של DTT מ"מ 100.

6. שחזור של רנ"א חדש תעתיק

ontent "> המשך עם ניקוי MinElute RNeasy (Qiagen) הפרוטוקול בעקבות הוראות היצרן. Elute ב25 2 ריכוזי μl nuclease ללא H O. מדוד RNA באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop. כדי למנוע את הצורך להפשיר ולהקפיא מחדש RNA לפני הגשה זה assay תפוקה גבוהה, אנו ממליצים הכנת cDNA מייד לאחר RNA החדש שעבד הוא מטוהרים. השתמש 2.5 μl של RNA החדש שעבד ב20 תמהיל סינתזת cDNA μl לסינתזת cDNA בעקבות הוראות היצרן. ביצוע בקרות qRT-PCR באמצעות 1 : 10 דילולים של תמהיל cDNA החנות RNA ב -80 ° C..

7. שחזור של ללא תווית, לא כרוך רנ"א (אופציונלי)

במקרה מאוגד צריך RNA להיות התאושש; לאסוף ולשלב את הזרימה דרך (לאחר הוספת פתרון RNA-streptavidin חרוזים לעמודות) וההדחה ראשונה לממטרים שלאחר מכן. בדרך כלל זה מספיק כדי לזרז רק 50% מהמאוגדים RNA כthiים יכיל> 80% מהחומר המוצא.

  1. הוסף נפח שווה של isopropanol (מלח לא צריך להוסיף כחיץ כביסה כבר מכיל 1 M NaCl).
  2. צנטריפוגה ב 20,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant.
  3. הוסף נפח שווה של 75% אתנול, צנטריפוגות ב 20,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant.
  4. ספין בקצרה ולהסיר אתנול שיורי עם 200 פיפטה μl.
  5. ספין בקצרה ולהסיר אתנול שיורי עם 20 פיפטה μl.
  6. אל תאפשר לרנ"א לייבוש. Resuspend זה בH μl 100 2 א ' מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 - 6 פעמים. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם רעד ולהעביר ישירות לקרח.
  7. לבדוק את איכות הרנ"א על ​​ידי ניתוח electrophoretical להוציא השפלה RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

1. חומר מוצא ותשואות צפויות

בעקבות 1 שעה (HR) של 4sU-RNA החדש שעבד חשיפה מייצג כ 4 - 1% מכלל RNA הסלולרי. זה יהיה נמוך יותר ב- נעצר גדילת תאים כפי שהם כבר לא לסנתז RNA לחשבון לצמיחת תאים / שכפול. כאשר תיוג עבור שעה 1, אנו ממליצים להתחיל את assay עם 60-80 מיקרוגרם של רנ"א הכל. החל עם פחות מ -30 מיקרוגרם של תוצאות כלל RNA בכדורי RNA קטנים שקשה לראות אחרי צעד biotinylation ובכך עלולים ללכת לאיבוד בקלות. רמות RNA ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד באופן משמעותי מגביר את העצמה של טכנולוגיות תפוקה גבוהה כמו microarrays וRNA-Seq על ידי מתן תבניות מתאימות יותר להתייחס לשאלה הביולוגית של עניין. הפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה נרחבת. היא מאפשרת העשרה> 1,000 פי חדש של RNA עיבד ומספקת תוצאות לשחזור מאוד.

עיצוב ניסיוני של ניסוי 4sU תיוג הוא בעלת חשיבות מכרעת כRNA חדש שעבד יהיה לתאר את פעילות תעתיק בזמן אמת רק בזמן חשיפה של תאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

ברצוננו להודות לאיימי רגן לקריאה מדוקדקת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NGFN פלוס # 01GS0801, MRC מלגת מענק G1002523 וNHSBT מענק WP11-05 לLD וDFG מענק FR2938/1-1 לCCF

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-thiouridineCarbosynthT4509הכן מלאי של 50 מ"מ ב-H2O סטרילי, אחסן ב-20 מעלות; C במכסות של 50-500 μ l, השלך ריאגנט שאינו בשימוש, אין להקפיא מחדש.
טריזולאינוויטרוגן15596026 (100 מ"ל), 15596018 (200 מ"ל)<חזק>אזהרה - קורוזיבי ומסוכן לבריאות! להבטיח גישה מיידית לתרופת פנול (PEG-מתנול); יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
כלורופורםסיגמא372978<חזק>אזהרה - מסוכן לבריאות
איזופרופנולסיגמא650447
נתרן ציטראט, סיגמא C8532 נטול נוקלאזהכן תמיסת מלאי של 1.6 M באמצעות מים נטולי נוקלאז.
5M נטול נוקלאז NaClSigma71386תמיסת מלאי
ללא נוקלאז H2OSigmaW4502הכינו 1 מ"ל בשפופרות נטולות נוקלאז.
משקעים RNA1.2 M NaCl, 0.8 M נתרן ציטראט במים נטולי נוקלאז. התכוננו מראש בתנאים נטולי נוקלאז לחלוטין. יש לאחסן בטמפרטורת החדר בשפופרות בז של 50 מ"ל.
אתנולסיגמא459844השתמש עם מים נטולי נוקלאז להכנת 80% אתנול, אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
1 M Tris Cl נטול נוקלאז, pH 7.5Lonza51237תמיסת מלאי
500 מ"מ EDTA ללא נוקלאז, pH 8.0Invitrogen15575-020תמיסת מלאי
10x מאגר ביוטינילציה (BB)100 מ"מ Tris pH 7.4, 10 מ"מ EDTA במים נטולי נוקלאז, מכינים מינון של 1 מ"ל.
Dimethylformamide (DMF)SigmaD4551
EZ-Link biotin-HPDPPierce21341הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 50 מ"ג ביוטין-HPDP ב-50 מ"ל DMF. חימום עדין משפר את המסיסות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכמות של 1 מ"ל.
Phase Lock Gel צינורות כבדים 2.0 מ"לEppendorf0032 005.152אופציונלי לשלב מיצוי הכלורופורם.
ממברנת ZetaBIORAD162-0153
10x מאגר100 מ"מ NaOH, 10 מ"מ EDTA
ביוטין-אוליגו5'-ביוטין, 25 נוקלאוטידים, כל רצף
נתרן דודציל סולפטפישרBPE9738עבור 100 מ"ל תמיסת מלאי של 20%, הוסף 20 גרם SDS ל-80 מ"ל PBS pH 7-8 והתאם את הנפח ל-100 מ"ל. שמור על כל תמיסות ה-SDS באחוזים גבוהים מעל 20 מעלות צלזיוס. הפתרונות מעט צריכים SDS לזרז.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce21333הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 50 מ"ג יודואצטיל-ביוטין ב-50 מ"ל DMF. חימום עדין משפר את המסיסות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכמות של 1 מ"ל. מייצר ביוטינילציה בלתי הפיכה ספציפית לתיול.
מאגר פוספט מלוחGibco10010-015
חסימת כתמים נקודותמערבבים 20 מ"ל 20% SDS עם 20 מ"ל 1 x PBS pH 7-8 ומוסיפים EDTA לריכוז הסופי של 1 מ"מ.
סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז VectorLaboratories SA5004יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. מערבבים 10 מ"ל 20% SDS עם 10 מ"ל 1 x PBS. הוסף 20 μ l סטרפטווידין-HRP לפני השימוש.
מגיב ECLHealthcareRNP2109 השתמש בהתאם להוראות היצרן.
Super RX, X-RA FILM, 18x24 ס"מFujifilm47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101אחסן את החרוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Tween 20SigmaP1379
מאגר100 מ"מ Tris pH 7.4, 10 מ"מ EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 ב-H2O נטול נוקלאז.
דיתיותרייטול (DTT)Sigma43817הכן כ-100 מ"מ DTT ב-H2O נטול נוקלאז, הכן תמיד טרי לפני השימוש.
RNeasy MinElute KitQiagen74204חנות עמודות ב-4 מעלות; C, שאר רכיבי הערכה בטמפרטורת החדר.
צינורות פוליפרופילן מוברגים 1.5 מ"לSarstedt72.692.005תואם לצינורות
פוליפרופילן מוברגים Dimethylformamide 2.0 מ"לSarstedt72.694.005תואם לצינורות דימתילפורממיד
15 מ"לBD Falcon352096תואם לצינורות דימתילפורממיד
50 מ"לBD Falcon352070תואם לדימתילפורממיד
יש לאחסן את כל התמיסות/ריאגנטים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
<חזק>ציוד
ספקטרופוטומטר UV/VISThermo ScientificNanoDrop 1000או שווה ערך. השתמש בנפח נמוך (1-2 μ l) למדידות של ריכוזי RNA נמוכים כדי למנוע אובדן דגימה מוגזם.
צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן 15 מ"לVWR International525-0153בניגוד לצינורות סטנדרטיים של 15 מ"ל, אלה סובלים עד 15,000 & #215; g
צנטריפוגה מהירהבקמן קולטראוונטי J-25או ציוד שווה ערך המסוגל להגיע ל-13,000× g
רוטור מהירבקמן קולטרJLA-16250או ציוד שווה ערך המסוגל להגיע ל-13,000× g
מתאמים לצינורות 15 מ"לLaborgerä te Beranek356964או ציוד שווה ערך המסוגל להגיע ל-13,000× g
צנטריפוגה שולחנית מקוררתEppendorf5430 Rאו שווה ערך.
ThermomixerEppendorfThermomixer קומפקטיאו שווה ערך.
מעמד מגנטיMiltenyi Biotec130-042-109מעמד אחד מחזיק 8 μ עמודות Mac.
מענק אמבט מיםSUB Aqua 5או שווה ערך.
סולם עדין במיוחדA& DGR-202או שווה ערך.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKעבור ג'ל RNA; או שווה ערך.
E-Gel EX 1% agarose precast gelsInvitrogenG4020-01עבור ג'ל RNA; או שווה ערך.
מאגר קשירת כתמי נקודות מאגר GE כביסה

מקורות

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNARNA4 ThiouridineStreptavidinRNAQ RT PCR
סימון מטבולי של רנ"א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ"א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.