סימון מטבולי של רנ"א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ"א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

סיכום

סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.

תקציר

הפיתוח של microarrays השלם transcriptome והדור הבא של רצף יש מהפכה ההבנה של המורכבות של ביטוי גני הסלולר שלנו. יחד עם הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המעורבים, מידות מדויקות של קינטיקה הבסיסית הפכו להיות חשובה יותר ויותר. כאן מתודולוגיות רבי עוצמה אלה, עומדות בפני מגבלות עיקריות בשל מאפיינים פנימיים של דגימות תבניתו הם לומדים, RNA הסלולרי כלל כלומר. במקרים רבים שינויים ברנ"א הסלולרי כלל להתרחש גם לאט מדי או מהר מדי כדי לייצג את האירועים המולקולריים שבבסיס וקינטיקה שלהם עם רזולוציה מספיקה. בנוסף, התרומה של שינויים בסינתזת רנ"א, עיבוד, וריקבון אינה מובחנות בקלות.

לאחרונה פיתחנו פרופיל גנטי ביטוי ברזולוציה גבוה כדי להתגבר על המגבלות האלה. הגישה שלנו מבוססת על תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouriלסעוד (ובכך גם המכונה 4sU תיוג) ואחריו טיהור קפדני של RNA עבד מחדש באמצעות biotinylation תיאול ספציפי וחרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. זה ישים למגוון רחב של יצורים בעלי חוליות, לרבות תסיסנית, ושמרים. אנחנו מיושמים בהצלחה 4sU תיוג ללמוד קינטיקה בזמן אמת של פעילות גורם שעתוק, לספק מדידות מדויקות של RNA מחצית חיים, ולקבל תובנות לתוך רומן קינטיקה של רנ"א עיבוד. לבסוף, יכולים להיות מועסקים מודלים חישוביים ליצירת ניתוח משולב, מקיף של המנגנונים המולקולריים שבבסיס.

מבוא

פרופיל גנטי ביטוי הוא כלי מרכזי המשמש ללמוד תהליכים תאיים וברשת יחסי הגומלין המורכבת המשויכת. שפע מחקרים על mRNA היו בדרך כלל בשיטה של ​​בחירה כדי להשיג תובנות בסיסיות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס. הפיתוח של microarrays השלם transcriptome ^1, ולאחרונה רצף של הדור הבא, של רנ"א (RNA-אילך) ^2-4 מונע את הגישה הזו. בעוד טכנולוגיות אלה חוללו מהפכה ההבנה של המורכבות של ביטוי גני הסלולר שלנו שהם עומדים בפני מגבלות עיקריות בשל מאפיינים פנימיים של תבנית המדגם שלהם, כלומר סך הסלולרי RNA. שינויים ראשונים, לטווח קצר ברמות רנ"א הכל אינם תואמים שינויים בשערי שעתוק, אבל מטבעם תלויים ברנ"א מחצית החיים של התמליל....

פרוטוקול

1. תיוג מטבולית עם 4-thiouridine

הפוך את תכנית מפורטת של ההתקנה / לוח הזמנים של הניסוי, למשל מתי להוסיף 4sU לתרבית תאים ומתי לקצור את הדגימות. תכנית במשך לפחות 5 דקות בין כל מצב. טיפול בתאים של תנאי אחד בלבד בכל פעם. להתמודד עם מקסימום. 3 - 5 מנות בכל זמן נתון. להתמודד עם תאים במהירות אפשרית כדי למזער את השינויים בטמפרטורה וברמות CO _2. הימנע מחשיפת התאים לאור בהיר לאחר 4sU הוא הוסיף שדבר עלול לגרום לcrosslinking של רנ"א 4sU שהכותרת לחלבונים תאיים.

התחל של תיוג

תוצאות

1. חומר מוצא ותשואות צפויות

בעקבות 1 שעה (HR) של 4sU-RNA החדש שעבד חשיפה מייצג כ 4 - 1% מכלל RNA הסלולרי. זה יהיה נמוך יותר ב- נעצר גדילת תאים כפי שהם כבר לא לסנתז RNA לחשבון לצמיחת תאים / שכפול. כאשר תיוג עבור שעה 1, אנו ממליצים להתחיל את assay עם 60-80 מיקרוגרם של רנ"א הכל. החל עם פחות מ -30 מיקרוגרם של תוצאות כלל RNA בכדורי RNA קטנים שקשה לראות אחרי צעד biotinylation ובכך עלולים ללכת לאיבוד בקלות. רמות RNA ק.......

דיון

תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד באופן משמעותי מגביר את העצמה של טכנולוגיות תפוקה גבוהה כמו microarrays וRNA-Seq על ידי מתן תבניות מתאימות יותר להתייחס לשאלה הביולוגית של עניין. הפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה נרחבת. היא מאפשרת העשרה> 1,000 פי חדש של RNA עיבד ומספקת תוצאות לשחזור מאוד.

עיצוב ניסיוני של ניסוי 4sU תיוג הוא בעלת חשיבות מכרעת כRNA חדש שעבד יהיה לתאר את פעילות תעתיק בזמן אמת רק בזמן חשיפה של תאי.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4-thiouridine	Carbosynth	T4509	הכן מלאי של 50 מ"מ ב-H2O סטרילי, אחסן ב-20 מעלות; C במכסות של 50-500 μ l, השלך ריאגנט שאינו בשימוש, אין להקפיא מחדש.
טריזול	אינוויטרוגן	15596026 (100 מ"ל), 15596018 (200 מ"ל)	<חזק>אזהרה - קורוזיבי ומסוכן לבריאות! להבטיח גישה מיידית לתרופת פנול (PEG-מתנול); יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
כלורופורם	סיגמא	372978	<חזק>אזהרה - מסוכן לבריאות
איזופרופנול	סיגמא	650447
נתרן ציטראט, סיגמא C8532 נטול נוקלאז			הכן תמיסת מלאי של 1.6 M באמצעות מים נטולי נוקלאז.
5M נטול נוקלאז NaCl	Sigma	71386	תמיסת מלאי
ללא נוקלאז H2O	Sigma	W4502	הכינו 1 מ"ל בשפופרות נטולות נוקלאז.
		משקעים RNA	1.2 M NaCl, 0.8 M נתרן ציטראט במים נטולי נוקלאז. התכוננו מראש בתנאים נטולי נוקלאז לחלוטין. יש לאחסן בטמפרטורת החדר בשפופרות בז של 50 מ"ל.
אתנול	סיגמא	459844	השתמש עם מים נטולי נוקלאז להכנת 80% אתנול, אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
1 M Tris Cl נטול נוקלאז, pH 7.5	Lonza	51237	תמיסת מלאי
500 מ"מ EDTA ללא נוקלאז, pH 8.0	Invitrogen	15575-020	תמיסת מלאי
10x מאגר ביוטינילציה (BB)			100 מ"מ Tris pH 7.4, 10 מ"מ EDTA במים נטולי נוקלאז, מכינים מינון של 1 מ"ל.
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link biotin-HPDP	Pierce	21341	הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 50 מ"ג ביוטין-HPDP ב-50 מ"ל DMF. חימום עדין משפר את המסיסות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכמות של 1 מ"ל.
Phase Lock Gel צינורות כבדים 2.0 מ"ל	Eppendorf	0032 005.152	אופציונלי לשלב מיצוי הכלורופורם.
ממברנת Zeta	BIORAD	162-0153
10x מאגר			100 מ"מ NaOH, 10 מ"מ EDTA
ביוטין-אוליגו			5'-ביוטין, 25 נוקלאוטידים, כל רצף
נתרן דודציל סולפט	פישר	BPE9738	עבור 100 מ"ל תמיסת מלאי של 20%, הוסף 20 גרם SDS ל-80 מ"ל PBS pH 7-8 והתאם את הנפח ל-100 מ"ל. שמור על כל תמיסות ה-SDS באחוזים גבוהים מעל 20 מעלות צלזיוס. הפתרונות מעט צריכים SDS לזרז.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin	Pierce	21333	הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 50 מ"ג יודואצטיל-ביוטין ב-50 מ"ל DMF. חימום עדין משפר את המסיסות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכמות של 1 מ"ל. מייצר ביוטינילציה בלתי הפיכה ספציפית לתיול.
מאגר פוספט מלוח	Gibco	10010-015
		חסימת כתמים נקודות	מערבבים 20 מ"ל 20% SDS עם 20 מ"ל 1 x PBS pH 7-8 ומוסיפים EDTA לריכוז הסופי של 1 מ"מ.
סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז	Vector	Laboratories SA5004	יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. מערבבים 10 מ"ל 20% SDS עם 10 מ"ל 1 x PBS. הוסף 20 μ l סטרפטווידין-HRP לפני השימוש.
מגיב ECL	Healthcare		RNP2109 השתמש בהתאם להוראות היצרן.
Super RX, X-RA FILM, 18x24 ס"מ	Fujifilm	47410 19236
μ Macs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	אחסן את החרוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Tween 20	Sigma	P1379
מאגר			100 מ"מ Tris pH 7.4, 10 מ"מ EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 ב-H2O נטול נוקלאז.
דיתיותרייטול (DTT)	Sigma	43817	הכן כ-100 מ"מ DTT ב-H2O נטול נוקלאז, הכן תמיד טרי לפני השימוש.
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	חנות עמודות ב-4 מעלות; C, שאר רכיבי הערכה בטמפרטורת החדר.
צינורות פוליפרופילן מוברגים 1.5 מ"ל	Sarstedt	72.692.005	תואם לצינורות
פוליפרופילן מוברגים Dimethylformamide 2.0 מ"ל	Sarstedt	72.694.005	תואם לצינורות דימתילפורממיד
15 מ"ל	BD Falcon	352096	תואם לצינורות דימתילפורממיד
50 מ"ל	BD Falcon	352070	תואם לדימתילפורממיד
יש לאחסן את כל התמיסות/ריאגנטים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
<חזק>ציוד
ספקטרופוטומטר UV/VIS	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	או שווה ערך. השתמש בנפח נמוך (1-2 μ l) למדידות של ריכוזי RNA נמוכים כדי למנוע אובדן דגימה מוגזם.
צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן 15 מ"ל	VWR International	525-0153	בניגוד לצינורות סטנדרטיים של 15 מ"ל, אלה סובלים עד 15,000 & #215; g
צנטריפוגה מהירה	בקמן קולטר	אוונטי J-25	או ציוד שווה ערך המסוגל להגיע ל-13,000× g
רוטור מהיר	בקמן קולטר	JLA-16250	או ציוד שווה ערך המסוגל להגיע ל-13,000× g
מתאמים לצינורות 15 מ"ל	Laborgerä te Beranek	356964	או ציוד שווה ערך המסוגל להגיע ל-13,000× g
צנטריפוגה שולחנית מקוררת	Eppendorf	5430 R	או שווה ערך.
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer קומפקטי	או שווה ערך.
מעמד מגנטי	Miltenyi Biotec	130-042-109	מעמד אחד מחזיק 8 μ עמודות Mac.
מענק אמבט מים		SUB Aqua 5	או שווה ערך.
סולם עדין במיוחד	A& D	GR-202	או שווה ערך.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	עבור ג'ל RNA; או שווה ערך.
E-Gel EX 1% agarose precast gels	Invitrogen	G4020-01	עבור ג'ל RNA; או שווה ערך.

מאגר קשירת כתמי נקודות מאגר GE כביסה