Method Article

Electroporation האזור Subventricular ילודים

DOI:

10.3791/50197

⸱

February 11th, 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו מדגימים את טכניקה פולשנית המכונית electroporation האזור subventricular ילוד. הטכניקה מורכבת של הזרקת DNA פלסמיד לתוך חדרי לב לרוחב של גורים ילודים ויישום זרם חשמלי כדי לספק ולתפעל גנטיים תאי גזע עצביים

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע עצביים (NSCs) קו רוחב חדרי לב לאחר הלידה ולהצמיח סוגי תאים רבים הכוללים נוירונים, האסטרוציטים, ותאי ependymal 1. הבנת המסלולים המולקולריים האחראים למל"ל התחדשות עצמית, מחויב, וההתמיינות היא קריטית לרתימת הפוטנציאל הייחודי שלהם כדי לתקן את המוח ולהבין טובים יותר את הפרעות במערכת עצבים מרכזיות. קודם שיטות למניפולציה של מערכות יונקים נדרשו זמן מאמץ רב ויקר של הנדסה גנטית ברמת החיים השלמה 2. לכן, הרוב המכריע של מחקרים בחן את הפונקציות של מולקולות המל"ל במבחנה או בחסרי חוליות.

הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקה הפשוטה ומהירה כדי לתפעל NPCs יילודים המכונה האזור electroporation subventricular יילודים (SVZ). טכניקות דומות פותחו לפני עשור כדי ללמוד NSCs העוברי וסייעו מחקרים על cortical פיתוח 3,4. לאחרונה זה יושם ללמוד המוח הקדמי המכרסם לאחר לידת 5-7. טכניקה זו מביאה לתיוג חזק של SVZ NSCs וצאצאיהם. לפיכך, לאחר לידת SVZ electroporation מספק עלות וזמן חלופי יעילה להנדסה גנטית של יונקי המל"ל.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך זה בהתאם לדרישות ייל IACUC. מדענים צריכים לוודא שהנחיות IACUC מאושרות ואחריו על פי הדרישות המוסדיות שלהם.

1. סעיף 1. הכנת דנ"א, פתרונות, וזכוכית פיפטות

  1. צור טוהר גבוה (OD 260/280> 1.80) ריכוז גבוה (מיקרוגרם / μl> 2.5) אנדוטוקסין נטול ה-DNA.
  2. הכן תמיסת מלח 0.9% ומסנן סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 22.
  3. 10 צינורות Place סנטימטר אש מלוטשים ורוסיליקט זכוכית נימים (OD: 1.5 מ"מ, מזה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות ילודות subventricular אזור electroporation בתיוג של כמעט כל גליה הרציפה עם האזור הגבה, לרוחב גב, ורוחב subventricular בעקבות התנועה "הגורפת" של האלקטרודה פינצטה (האיור 1E) רדיאלי. עם זאת, electroporation ניתן להתאים לדרישה של הניסוי המתאים אך לא מטאטא את האלקטרודה ושימוש במיקום ואורינטציה מסוימים כמפורט בוידאו. לדוגמה, מאז גליה רדיאלי dorsally המקומית שונה מאלה רירית סעיף הרוחב של חדר, אחד יכול לבחור electroporate אזור אחד 9,10 בלבד. ייחוד נוסף ג.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנחנו פירוט הטכניקה של electroporation SVZ יילודים, טכניקה במהירות ובאופן עמיד לתייג ולטפל בתאי גזע SVZ וצאצאיהם. ישנם מספר יתרונות שיש electroporation בהשוואה לשיטות אחרות. ראשית, מאחר תיוג המוקד של תאים, אחד הוא מסוגל להבחין סלולריות השפעות אוטונומיות אוטונומיות ולא תא. מניפולציה שנייה, תוך שימוש במערכות גנטית מושרות מאפשרת להשוות תופעות לפני או אחרי שילוב הסינפטי. יתר על כן, אפשר לעקוף את השימוש בפלסמידים מרובים electroporating Cre עכברים מבטאים עם פלסמידים המכילים אתרי lox.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין גילויים שיבצעו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד ההגנה (פרס פיתוח רעיון, W81XWH-10-1-0041, א.ב.), CT תאי גזע המענק (א.ב.), והמכון לאומי לבריאות NRSA 10668225 (DMF). החומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת בחלקו על ידי מדינת קונטיקט במסגרת התכנית לקונטיקט לתאי הגזע למחקר המענקים. התוכן שלה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצג בהכרח את עמדתה הרשמית של מדינת קונטיקט, המחלקה לבריאות ציבור של מדינת קונטיקט או CT חידושים, Inc הממנים לא היו כל תפקיד בתכנון מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
אבובי ורוסיליקט מלוטשים כבדים מכשיר סאטר BF150-110-10
Dual-שלב הזכוכית micropipette פולר Narishige PC-10h
גרין המהיר הפישר סיינטיפיק 0521192205
ECM 830 Wave הכיכר פולסה גנרטור הרווארד Apparatus 45-0052
Tweezertrodes הרווארד Apparatus 45-0488
מקור אור בסיבים אופטי הפישר סיינטיפיק 12-562-36
הלוגן טונגסטןמנורה USHIO אמריקה, Inc 1002247
Picospritzer השני פארקר מכשירים 052-0312-900

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neonatal SVZ ElectroporationSubventricular ZoneNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

Related Articles