הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

12.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50271

⸱

3 באפריל 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר הכולל לשעבר רחם Electroporation, נתיחה והתרבות של אונות מוח שלמות מהעכבר העוברי. ההכנה מאפשרת לימודים ומבחנים פרמקולוגיים של תפקוד גן במהלך התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם.

תקציר

התפתחות קליפת מוח כרוך אינטראקציות מורכבות בין תאי עצב ואלמנטים שאינם עצביים בין תאים מבשרים, כלי דם, קרום מוח ומטריקס המשויך. משום שהם מספקים סביבה מתאימה organotypic, explants הפרוס קליפת המוח משמשים לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות אלה ששולטים בהתמיינות והתפתחות עצביות. אמנם מועיל, מודל explant פרוסה יכול לסבול מחסרונות כוללים למינציה סלולרית חריגות והגירה. כאן אנו מדווחים מערכת כל חץ כדור מוחית explant ללימודים של התפתחות קליפת המוח הקדומה שיותר קל להכין מפרוסות ומופעי קליפת מוח הגירת organotypic עקבית ולמינציה. במערכת מודל זה, למינציה המוקדמת ודפוסי נדידה להמשיך כרגיל לתקופה של ימים במבחנה, לרבות תקופת פיצול preplate, במהלך ששכבת קליפת מוח פוטנציאלית שש צורות. אז פתחנו electroporation הרחם לשעבר (EUEP)גישה שמשיגה הצלחה ~ 80% במיקוד הביטוי של GFP לנוירונים בקליפת המוח המתפתחים המדיאלי הגבה.

כל מודל explant האונה עושה פיתוח נגיש עבור electroporation התערבות, תרופתית וגישות הדמיה חיות מוקדם קליפת המוח. שיטה זו מונעת ניתוח ההישרדות הנדרשת ברחם electroporation (IUEP) גישות תוך השיפור גם transfection ועקביות מיקוד Areal. שיטה זו תאפשר מחקרים ניסיוניים של שגשוג, נדידה והתמיינות של תאי עצב.

מבוא

צורות יונקי קליפת המוח באמצעות התפשטות, ההגירה ובידול המרוכז של נוירונים שנוצרו ברציפות. כל נוירון הוא נולד באזור חדרית (VZ) ונודד מVZ לאיזור ביניים (א.ת.), ויצר את צלחת קליפת המוח (CP) 1. כשהם עוברים דרך תחומים שונים של קליפת מוח, תאי העצב הנודד יציג את המצבים מרובים של הגירת 2,3 התלויים בסביבה התאית ומרכיבים תאיים אחרים (למשל גליה רדיאלי) בתוך הרקמה המתפתחת. נוירונים בקליפת מוח ואז לעצור את ההגירה בראש צלחת קליפת המוח להרכיב בתהליכים החופפים מעצר הגירה ועצבי 4 dendritogenesis.

התפתחות קליפת המוח היא שיזם בין ימים עובריים 11-13 (E11-13) 5 עד הקמתה של השכבה הקדמונית plexiform 6 או preplate (PP), שכבה של תאי עצב חלוץ שoverlies VZ. לעתידשכבת 6 נוירונים בקליפת מוח (כלומר נוירונים בקליפת המוח הראשונים שנולדו בVZ) ואז לכוון אותם בsomata דפוס סטריאוטיפי ולהתגבש לשכבה ברורה בתוך 7 PP. אירועים אלה לפצל preplate ל( שכבת עתיד קורטיקלי 1) שטחית שולית ואזור עמוק, שהאחרון המורכב של תאי קליפת המוח (שכבת subplate חולפת 7). תהליך זה, המכונה פיצול preplate, הוא אירוע מכונן בצמיחה העתידית של קליפת מוח 8.

מוטציות גנטיות רבות זוהו לשבש היבטים שונים של התפתחות קליפת המוח 9. התפתחות קליפת המוח יכולה גם להיות מושפעת לרעה על ידי חשיפה לרעלי ingested כמו קוק 10 ו 11 באלכוהול. בגלל מומים בקליפת המוח שמתעוררים במהלך פיתוח הם תורמים צפויים הפרעות נוירולוגיות (למשל אוטיזם, סכיזופרניה), חקירות אמפיריות של הפרעות להתפתחות קליפת מוח טבועותly החשוב. לכן חשיבות רבה להקמת גישות ללמוד פיתוח קליפת המוח שייאפשרו מבחנים מהירים של השפעות גנטיות או רעל אבל זה גם לשמור על אינטראקציות האפשריות בין הנוירונים מבדילים, סוגי תאים אחרים ומטריקס (ECM) בתקופה המוקדמת של התפתחות המוח 12 .

explants Slice 13 ספק מערכת כזו והיה בשימוש נרחב לפיתוח נוירון קורטיקלי assay 14-16. עם זאת, מבחנים פרוסים יכולים לסבול מהחסרון שההגירה ולמינציה עצבית יכולים להיות נורמלית 17 אולי בשל ניזק לתאי meningeal המקיפים את המוח ועוגן פיתוח רדיאלי גליה פיגום. כסיבי גליה רדיאליים הם מצע חשוב ל18 שיבוש הגירת נוירון קורטיקלי של lamina הבסיס של חיתוך עלול לשבש באופן מקומי ארכיטקטורת גלייה רדיאלי ולהוביל להגירת קליפת מוח שונה. בנוסף SLIמשטחי CED של explants מספקים אזור של תאים מתים שעשוי לשנות את ההרכב הרגיל של ECM באזורים אלה.

גישות מאוחרות יותר התמקדו הניתוח שלהם בתאים הנמצאים עמוק בפרוסה שמוקפות בסוגים מתאימים בריאים סלולריים וECM. עם זאת, במקרים מסוימים גם גישות חדשות אלו יכולות לדרוש שהפרוסה העבה התרבותית המקורית להיות cryo-נותחה או פרפין נותח לאחר קיבוע כך שהחלק הפנימי הנורמלי יחסית של הפרוסה נעשתה זמין לניתוח 19-21. שניהם vibratome המקורי חתך להכין את הפרוסות החיות לתרבות כמו גם cryosectioning הבא של פרוסות קבועות לניתוח דורש טיפול ומאמץ למבחנים אלה לעבודה.

כדי לספק גישה פשוטה, ללימודים משלימה של התפתחות קליפת מוח מוקדם, יש לנו גישות שונות an פרוס קיימות 13 כדי להקל על מחקרים של התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם. פתחנו WHמודל ole אונת explant דומה למודל קיים E14 כל אונה שמעורבות תרבויות רועדות ב 65 סיבובים לדקה וצמיחת organotypic מותר ל16-18 שעות 22,23. בגישה שלנו, explants אונה השלמה מונחים על קרום חדיר למחצה עם 13 באווירת תרבות חמצן גבוהה 21,24 להאריך צמיחת קליפת המוח organotypic עבור 48 שעות. גישה זו גם מאפשרת לelectroporation העקבי של פיתוח נוירונים בקליפת המוח. העוברים יוסרו מהרחם וelectroporated להציג את ה-DNA פלסמיד ולאחר מכן telencephalon מנותח. אונה כל מבודדת והניחה את הצד המדיאלי על מסנן קולגן מצופה. אז explant בתרבית לתקופה של 48 שעות, תקופה שכוללת פיצול preplate 8. בתקופת התרבות, L6 הנוירונים להתפתח ממבשרים 25 נוירון המובחן, ממוקם כראוי בתוך צלחת קליפת המוח. בכל תקופה זו מתפתחתנוירון מוקף ECM המתאים וסוגי תאים שיעמידו התא המתאים בגוף חי. שיטה זו כבר הוכיחה יקרה בפענוח האירועים התאיים העומדים בבסיס רעילות אתנול 26, 6 והיווצרות שכבת preplate פיצול 7,25.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Electroporations רחם אקס עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק פלסמיד

  1. פתרוני הזרקת DNA פלסמיד שהוכנו CAG-27-DNA eGFP המדולל לריכוז העבודה הסופי של 0.33 מ"ג / מ"ל בDDH 2 O. -Preps מקסי Endo-חינם Qiagen משמש כדי לטהר פלסמיד מחיידקים מותמרים. צבע ירוק מהיר ב~ 0.02% (w / v סופי) הוא הוסיף לתמיסת ה-DNA כנותב הזרקה.
  2. כדי להכין את אזור הניתוח, התיז על גבי ספסל ובמת מיקרוסקופ לנתח עם 70% אתנול ופתרון נגב יבש. רסס מספריים ומלקחיים כירורגית עם אתנול 70% לפני הנתיחה ולנגב יבשים.
  3. סכרי מתוזמן הריון שויצרי / ובסטר מוקרבים על E13 על ידי העביר לחדר מלא בCO 2 מצילינדר לחץ והסכר הוא פיקוח עד שכל התנועה שעצרה לדקות לפחות 1. לאחר קורבן על ידי 2 משאיפת CO העוברים יוסרו מן הרחם והניחו ב10 פתרון סנטימטר צלחת הפטר שהכיל קרח קר הנקס מאוזן מלוח (HBSS).
  4. זהירות לנתח כל עובר מהקרומים המקיפים extraembryonic ולשמור בHBSS קר כקרח.
  5. העבר כל עובר באופן פרטני למנה שנייה 10 סנטימטרי פטרי המכילה HBSS הקר. השתמש במזרק המילטון להזריק 2-3 μl של התערובת הירוקה DNA המהירה לתוך את החדר של האונה השמאלית של המוח, טיפול להזריק באזור מרחב נפרד מאזור קליפת המוח לקליפת מוח ניתוח בעתיד.
  6. לelectroporate, להחזיק את העובר בעדינות בעזרת מלקחיים וקלים למקם את ההנעה החיובית של האלקטרודה פינצטה על קו האמצע הגבה של הראש וקל למקם את ההנעה השלילית מתחת לסנטר העובר. Electroporations מושגות עם BTX830 electroporator המתוכנת לספק 5 30 פולסים V של 50 אלפיות משך, מופרדים על ידי מרווחי 950 msec. הגדרות אלה הן לBTX830 המודל. מערכות אחרות ניתן להשתמש על פי instructio של היצרןns.

2. הכנת Explant חצי כדור שלמה

  1. לאחר electroporation העוברים מוצבים בחזרה לHBSS קר כקרח. המוח מוסר באמצעות שני # 5 מלקחי תכשיטים להסיר את העור וגולגולת סחוסים מראש העובר. מלקחיים אז הוא החליק מתחת למוח כדי להסיר את המוח ללא פגע מהגולגולת. אונת electroporated (משמאל) לאחר מכן גזורה מרקמת המוח ובמצורפת אמצע המוח הוסרה. במהלך טיפול הליך הנתיחה נלקח לא לפגוע בקרומי המוח מונחים על האונה השמאלית של קליפת המוח.
  2. ברגע שנתח את כל עובר מועבר בHBSS באמצעות pipettor עם קצה חיתוך 1 מיליליטר פיפטה. האונה מסולקת בעדינות על גבי עלון תרבות קולגן מצופה. עד שישה explants אונה מסודרים צד המדיאלי על כל עלון מ"מ 24. HBSS לאחר ארגון העודף יוסר מלהוסיף ולאחר מכן להוסיף ממוקם לתוך 1 35 מ"מ גם של מנה גם 6. גם מכיל Exactly 2.7 מ"ל של תקשורת: תקשורת DMEM-F12 המכיל Glutamax והשלים עם 2% B-27, 1% G5 ו 1% פניצילין-דלקת. כמה טיפין של תקשורת מהיטב ניתן pipetted על גבי זה explant, אבל לא להוסיף מדיה בעודף של 2.7 מ"ל המקורי לטוב.
  3. לאחר explants הוצב על גבי מסנני קולגן המנה גם 6 המכילה את explants ממוקמת לתוך Billups רוטנברג (BR) קאמרי (שמכיל גם מנת humidifying של מים). תערובת של 95% חמצן / 5% / CO 2 גז הוא החדיר לתוך התא לדקות לפחות 1 לפני האיטום סוגר הקאמרי וניתוק צינור אספקת הגז 2 95% החמצן / 5% / CO. BR הקאמרי הועבר אז ל37 מעלות צלזיוס רקמות תרבות חממה ליתרת תקופת התרבות, 1-2 DIV.

3. קיבוע של רקמות Explant ליסטולוגיה

  1. במנדף להכין פתרון קיבעון פגאנו ידי g 8 solubilizing הראשון של paraformaldehyde ב100 מ"ל של שחוממה מראש (~ 80 & דהז; C) DDH 2 O. הוסף 1-3 טיפין המרוכזות NaOH לקדם solubilization ועדינות מערבבת. ברגע solubilized לערבב 8% פתרון paraformaldehyde 01:01 עם פתרון זה הוא סוכרוז 500 מ"מ, 100 המ"מ Hepes, 7.4 pH, 50 המ"מ MgCl 2, KCl mM 5 לריכוז סופי של paraformaldehyde 4% ב -250 50 המ"מ Hepes סוכרוז המ"מ , 25 המ"מ MgCl 2, 2.5 mM KCl, 7.4 pH.
  2. כדי לתקן את explants לחמם את פתרון תיקון פגאנו עד 37 ° C. סר במהירות מרבית DMEM/F12 מדיה מכל תרבות היטב ומוסיף 5 מ"ל של תקן פגאנו לכל באר של explants. הקפד לכסות את כל explant לחלוטין בתיקון. תקן עבור שעה 1 בRT. אל תסיר explants ממסנן לפני 1 השעה של קיבעון.
  3. לאחר הקיבוע להסיר את פתרון תיקון פגאנו ולהחליף עם פתרון פגאנו בלי מנה (250 מ"מ 50 Hepes סוכרוז מ"מ, 25 המ"מ MgCl 2, 2.5 המ"מ KCl, 7.4 pH). הוסף כמה טיפין של 10% יזידו הנתרן וחנות ב 4 ° C עד הטבעה.

4. הטבעה וSectioning ליסטולוגיה

  1. הכן 10% פתרון ג'לטין עור עגל בsolubilizing 10 גרם ג'לטין בעור העגל 100 מיליליטר מים חמימים (55-60 מעלות צלזיוס). הנח פתרון ג'לטין על פלטה להגדיר עד 60 ° C ומערבולת מעת לעת עד solubilized.
  2. יוצק כ 10 מ"ל של תמיסת הג'לטין 10% לתחתית צלחת פטרי 10 סנטימטרים ומאפשרים 30 דקות כדי לחזק. זה יהיה בצורה "כרית" להטבעה את explants. רפידות אלו יכולות להיות ימים שהוכנו מראש ומאוחסנות ב 4 ° C. השתמש בסרגל כדי לצייר רשת בתחתית צלחת הפטר ולהעביר explants הבודד לתוך כל תיבה של הרשת. הסר פתרון פגאנו שיורים והשימוש pipettor, לכסות כל explant עם פתרון ג'לטין חם 10% ולאפשר לביסוס. בנוסף לחדש איטי של פתרון ג'לטין עד שכל explant מוקף לחלוטין על ידי ג'לטין, נזהר שלא להמס את המשטח על ידי התוספת של מדי לחמם ג'לטין מדי בבת אחת. לאפשר לג'לטין להקשיח ל~ 1 שעה. ברגע שהקשיח individexplants רע"מ אפשר לחתוך בלוקים קטנים של ג'לטין. את הלוקים לפרסם-קבועים אז בפגאנו לתקן עבור 24-48 שעות לפני החתך עם vibratome.
  3. Explants בלוקי ג'לטין מוצב נורת חוש ריח ונותח במטוס העטרה בעובי מיקרומטר 100. הסעיפים נאספים ונשמרים בPBS + 0.1% יזידו הנתרן ב 4 ° C עד עיבוד immunohistochemical.
  4. איתור immunohistochemical מתבצע על ידי העברת חלקים לצלחת גם 24 (2-3 חלקים לטובים). נוגדן הבלוק הראשון הלא ספציפי מחייב על ידי הוספת 0.5 המ"ל PBST + B (PBS 0.5% + טריטון X 100 ו 2% BSA) לכל באר, שעות לדגור 1 עם טלטול עדין. אז הנוגדן הראשוני המתאים דילול בPBST + B ו -0.4 מ"ל לגם הוא הוסיף לדגירת הלילה בRT. העיקרי הוא שטף החוצה עם 3X PBS שוטף לפחות 10 דקות כל אחד. הנוגדן המשני ו2 מיקרוגרם / המ"ל Hoechst 33342 גרעיניים כתם לאחר מכן, בדילול PBST + B והדגימות מודגרת עבור 2 שעות בRTעם טלטול עדין. שלוש כביסות PBS (10 דקות כל אחד) ולאחר מכן מבוצעות הסעיפים הם רכובים על שקופיות באמצעות 90% גליצרול 50 mM טריס, pH7.4, תקשורת גוברת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המכרסם העוברית הקליפה מציגה שיפוע neurogenetic רוחבי לאורך כל תקופת ההתפתחות, שהניאוקורטקס כגון רוחב הוא יום כ 1 בוגר יותר מ 28 הניאוקורטקס המדיאלי הגבה. חלק הארי של שכבה 6 הנוירונים נוצרים כך (כלומר, תציג S-השלב הסופי שלהם) על E12 בקליפת מוח לרוחב (המכונה גם שדה 40 5) ובE13 בקליפה המדיאלי הגב (המכונה גם שדה 1 5). פיצול Preplate מתחיל כ 1 יום אחרי דור נוירון שכבה 6 וכך הוא יזם בקליפה החיצונית על E13 וקליפת המוח הגבה על E14. ללמוד פיצול pre...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש לנו שיפור ומוערך מודל ניסויי - explants אונה השלמה - למחקר על התפתחות קליפת מוח המוקדמת (E13-E15). המודל הוכיח שימושי לניתוח של הגירה ובידול של שושלת נוירון המעוררת שמהווה שכבה 6 של קליפת מוח 25,37. יתרונותיה העיקריים של המערכת הם: 1) צמיחת organotypic ל2 DIV, 2) פשטות של הכנה, ו3) גישה ניסויית לתאי העצב לelectroporation מניפולציה, תרופתיות והדמיה במהלך תחילת תקופה זו קריטית של התפתחות מוח. יש לנו להשתמש במערכת כדי לתעד הבדלים עדינים במורפולוגיה, הכיוון וצמיחת הדנדרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על מענקים מNINDS (NS066071) וNIAAA. (P50AA017823) לECO. המחברים מודים לד"ר רוברט קווין וצוות במחלקת המשאבים חיו מעבדה לטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ג'דסון למונט לתמיכה טכנית, ניקול Belletier לסיוע כעמיתת מחקר לתואר ראשון קיץ (SURF). אנו מודים גם לד"ר דיוויד קמרון להערות ועריכות בגרסה קודמת של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
DMEM/F12 + תוסף GlutaMAXGIBCO10565
G5 100XInvitrogen17503-012
B27 ללא סרום Suppl. 50XInvitrogen1504-044
עט / נוזל סטרפטוקוקוס 100XInvitrogen15140-122
HBSS 500 מ"לGIBCO14025
תרבית הכנסת קולגן מצופה קולגן Costar3492
ג'לטין עור בקר SigmaG9382
H– chst 33342InvitrogenH1399
בקר סרום אלבומיןסיגמא7906
EndoFree פלסמיד מקסי ערכתQiagen12362
<חזק>ציוד
BTX 830 אלקטרופורטורהרווארד מכשיר450052
אלקטרודות פינצטה 10 מ"ממכשיר הרווארד450166
חממהBillups RothenbergMIC-101
מזרק המילטון (5uL)המילטון87930
מחט מזרק המילטוןהמילטון7803-04ציין 1 אינץ' וסגנון 4
Dumont #5 מלקחייםFST11251-10
מספריים עדינים חתך קשיח 9 ס"מFST14058-09

מקורות

  1. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  2. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
  3. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
  4. Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
  5. Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
  6. Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
  7. Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
  8. Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
  9. Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
  10. Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
  11. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
  12. Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  14. O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
  15. Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
  16. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  17. Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  18. Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
  19. Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621(2012).
  20. Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
  21. Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
  22. Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
  23. Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
  24. Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
  25. O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25(2012).
  26. Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
  27. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
  28. Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
  29. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  30. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
  31. Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
  32. Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
  33. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
  34. McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
  35. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  36. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
  37. Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
  38. O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
  39. Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
  40. Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
  41. Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
  42. Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
  43. Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

transplantedGFP
לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.