מאמר שיטה

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

DOI:

10.3791/50282

⸱

1 ביוני 2014

 , 
1Department of Neurology, Massachusetts General Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול תפוקה גבוהה הקרנה מהירה וזול לזיהוי רגולטורים תעתיק של synuclein אלפא, גן הקשור למחלה פרקינסון. תאי 293T הם transfected transiently עם פלסמידים מספריית ביטוי ORF ערוך, יחד עם פלסמידים כתב בלוציפראז, בפורמט microplate אחד של גן לכל כן. פעילות גחלילית בלוציפראז היא assayed לאחר 48 שעה כדי לקבוע את ההשפעות של כל גן ספרייה על שעתוק synuclein אלפא, מנורמל לביטוי ממבנה בקרה פנימי (אמרגן HCMV בימוי לוציפראז Renilla). פרוטוקול זה הוא הקל על ידי רובוט ספסל העליון הסגור בארון בטיחות ביולוגי, אשר מבצע טיפול נוזל מזוהם בפורמט 96 היטב. פרוטוקול transfection האוטומטי שלנו הוא בקלות להתאמה לייצור ספריית lentiviral תפוקה גבוהה או פרוטוקולי הקרנה פונקציונליים אחרים הדורשים משולש transfections של מספר הגדול של פלסמידים ספרייה ייחודיים בconjunction עם סט משותף של פלסמידים עוזר. אנו מציגים גם חלופה זולה ומאומתים לחומרים כימיים, זמינים מסחרי, כפולים לוציפראז המעסיק PTC124, EDTA, וpyrophosphate לדכא פעילות גחלילית לוציפראז לפני המדידה של לוציפראז Renilla. שימוש בשיטות אלה, אנו הוקרנו 7670 הגנים אנושיים וזיהינו 68 רגולטורים של אלפא סינוקלאין. פרוטוקול זה הוא שינוי בקלות למקד גנים אחרים של עניין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לזהות מרכיבים עיקריים גנטיים רגולציה וגורמים הפועלים עליהם היא יסוד לחקר של תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, זיהוי גורמים המווסתים את הביטוי של גנים בסוגי תאים נדירים, כגון אוכלוסיות עצביות ספציפיות, יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי רגולטורים תעתיק רומן של synuclein אלפא (אס.אנ.סי. איי), גן הקשור למחלת פרקינסון, והביע בנוירונים דופאמין בsubstantianigra PARS אזור compacta של המוח התיכון. אנו משיגים זאת באמצעות מסך כתב תפוקה גבוהה, כפול לוציפראז, במבחנה כדי לפרק ביטוי אלפא סינוקלאין בתאי 293T. אמרגן אלפא סינוקלאין הוא משובט ראשון לתוך פלסמיד כתב המכיל את גן גחלילית בלוציפראז. פלסמיד זמין מסחרי המכיל את לוציפראז Renilla תחת השליטה של אמרגן פעיל constitutively משמש כבקרה פנימית. Thesכתב בונה דואר היא שיתוף transfected לתוך תאי 293T בmicroplates עם פלסמידים מספריית ביטוי ה-DNA, כך שכל אחד גם הוא transfected עם פלסמיד ספרייה אחת. לאחר 48 שעה, פעילות לוציפראז עבור כל כתב נמדדה ברצף באמצעות assay כפול זוהר. הביטוי היחסי של אלפא סינוקלאין בתגובה לכל גן ספרייה הוא להסיק לפי היחס של גחלילית: פעילות Renilla לוציפראז בכל טוב (F: יחס R) לאחר נורמליזציה מבוססת צלחת.

פרוטוקול זה מספק את יכולת מסך מספר רב של גנים (~ 2,500 בשבוע) ביכולתם transactivate גן כתב באמצעות כוח אדם מינימאלי (1-2 אנשים) ובעלות מינימאלית (כ -3 דולרי עלות מגיב לכל assay microplate). רגולטורים תעתיק של גנים עצביים (למשל, synuclein אלפא), שקשה ללמוד בנוירונים בתרבית עקשן למניפולציה גנטית, ניתן להשוות Side-by-צד בassay הפונקציונלי ישיר זה. אנו כוללים בנופרוטוקול מפורט שיטה לשכפול ולצמיחה של פלסמידים המכילים את אמרגן synuclein אלפא, שכן מצאנו כי פלסמידים המכילים אזור זה הם לא יציבים כאשר גדלו עם נהלים מקובלים (ראה דיון). אנו גם חלופה זולה לחומרים כימיים הכפול לוציפראז זמינים מסחרי עבור מבחני תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות למקד אלמנטים רגולטוריים נוספים של ריבית, או לכל תהליך הדורש transfections החולף תפוקה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסקירה ניסיונית, ראה איור 1.

1. הכן פלסמידים כתב המכילים יזם synuclein אלפא

גורמי רגולטוריים של גן synuclein אלפא (איור 2) משתרעים על פני כ 10 בייט, מהרצף במעלה הזרם NACP (לא מרכיב הביתא של פפטיד עמילואיד) חוזר dinucleotide 1,2 באמצעות אינטרון 2 3. אנו כוללים חלק מאזור זה ב הכתב לבנות שלנו. מצאנו כי פלסמידים המכילים אינטרון 2 נהלים מיוחדים הנדרשים לצמיחה, כפי שמתוארים להלן. פלסמידים לוציפראז, pGL4.10 וpGL4.75 (איור 3), זמינים באופן מסחרי מPromega ויכולים להיות מופץ באמצעות פרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים.

  1. להגביר את 2 רכיבים של אמרגן אלפא סינוקלאין בPCRs הנפרד באמצעות המתכון בטבלה 1 ופריימרים בטבלה 2.
  2. Veriמוצרי פ.י. PCR על ג'ל agarose ונקי באמצעות ערכת Qiaquick PCR הטיהור (Qiagen), משחררי ב50 μl של TE (טריס-EDTA). אחסן את בר kb eluted 0.9 ב -20 ° C לשימוש עתידי.
  3. לעכל את כל הנפח של בר PCR 3.4 בייט, כמו גם 5 מיקרוגרם של pGL4.10, עם SACI וXhoI. פנק את הווקטור עם עגל המעי אלקליין phosphatase (Roche) וג'ל לטהר באמצעות ערכת PureLink המהיר חילוץ ג'ל (Invitrogen).
  4. ולקשור את הבר ווקטור באמצעות האנזים T4 DNA (חוד). נקה את התגובה הושלמה באמצעות ערכת PureLink PCR מיקרו (Invitrogen), משחררי ב10 TE חיץ μl.
  5. להפוך 2 μl של ניקתה התגובה, קשירה ל20 μl של תאי ElectroMAX Stbl4 המוסמכים (Invitrogen) וelectroporate פי הוראות היצרן. לנער בC חממת 30 מעלות ב225 סל"ד 90 דקות. מורחים 2 כרכים על צלחות LB המכילות אמפיצילין 100 מ"ג / מיליליטר ו דגירה ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
  6. באמצעות קיסם, בחר 4-6 מושבות קטנות עבור חיסון ל2 מיליליטר של שחפת (נהדר מרק). לגדול תרבויות miniprep אלה בO / נ C שייקר 30 °
  7. לטהר DNA פלסמיד מ1.5 מיליליטר של כל תרבות miniprep באמצעות ערכת PureLink HiPure פלסמיד Miniprep (Invitrogen).
  8. לעכל את minipreps עם BamHI וElectrophorese על ג'ל agarose. השיבוט הנכון צריך לייצר שברי 2.8 kb ו4.9 kb.
  9. Restreak תרבות miniprep שנותרה מהשיבוט הנכון על צלחת טרי LB (מרק לוריא) ולגדול ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
  10. בחר מושבה קטנה ולחסן תרבות המתנע TB 1.5 מיליליטר. Shake O / N ב30 ° C. אל תתנו לתרבות המתנע לגדול לרוויה.
  11. לדלל את התרבות כולה מתנע ל150 מיליליטר של שחפת prewarmed ולנער ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. לפני שתמשיך לשלב הבא, השתמש 1.5 מיליליטר של תרבות זו לminiprep ועיכול נוספים כדי לאשר שהשיבוט לא להשתנות במהלך replicati הלאה.
  12. לטהר DNA פלסמיד מהתרבות שנותרה באמצעות ערכת PureLink HiPure פלסמיד Maxiprep (Invitrogen). תשואות צפויות של פלסמיד הביניים זה הן 50-150 מיקרוגרם למיליליטר 150 של התרבות.
  13. להפשיר את בר 0.9 kb קפוא בשלב 1.2. חזור על צעדים 1.3-1.12 לשבט בר 0.9 kb לתוך פלסמיד ביניים, לעכל במקום עם KpnI וSACI. ולקשור, לשנות, לבחור ולגדול לmaxipreps כאמור לעיל. עיכול עם BamHI אמור להניב ברי 5.8 kb ו2.8 kb. זהו פלסמיד אשר ישמש למסך.

2. הכן את תאי 293T, פלסמידים כתב, וספריית ה-DNA להקרנה

תאי 293T הם זורעים ראשון לתוך צלחות 96 היטב וtransfected ביום המחרת. פלסמידים כתב וDNAs הספרייה הם בדילול לתוך צלחות 96 היטב. אנחנו השגנו צלחות של ה-DNA ספריית כיתה transfection מליבת ה-DNA בבית החולים כלליים מסצ'וסטס (מקבל = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). פרוטוקול זה transfects צלחת ספרייה אחת ל2 צלחות זהות של תאי 293T (איור 1), ובכך 2 צלחות של תאי זרע צריכה להיות לכל צלחת ספרייה שיוקרנו.

הערה: לגדל תאים בתקשורת ללא פנול אדום או אנטיביוטיקה, כמו אלה להפריע למבחני לוציפראז ולהגדיל את הרעילות במהלך transfection, בהתאמה.

  1. לכל צלחת ספרייה שיוקרנו, תאי 293T trypsinized resuspend לריכוז של 1.5 x 10 5 תאים / מיליליטר בDMEM המכיל FBS 14%. יוצקים לתוך מאגר סטרילי (Axygen).
  2. הנח את המאגר, 2, צלחות ברורות עם תחתית 96 היטב (קורנינג), ותיבה של טיפים pipet המסנן (Agilent) על סיפון הרובוט. לוותר תאי 100 μl לבאר כל שני הצלחות, לצפיפות של 1.5 x 10 4 תאים לכל טוב.
  3. צנטריפוגה צלחות תא ב50 XG במשך 2 דקות, שימוש במהירויות רמפה נמוכות כדי להבטיח שוויוןצפיפות תאים לאורך כל טוב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ו10% 2 O / נ CO
  4. לדלל את הגחלילית ופלסמידים כתב Renilla ל5 ng / μl בסרום ללא מדיה. מערבבים את דילולים על יחס של 5:03 גחלילית לפלסמיד Renilla (לפי נפח) בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
  5. Pipet פלסמידים בשילוב לבאר כל צלחת 96 היטב, מחלק 17 μl לכל צלחת ספרייה, בתוספת עודפת 2-10 μl, לכל אחד.
  6. השג צלחות ספריית ה-DNA בדרגת transfection כאמור לעיל ולדלל את 13.3 ng / μl עם מים ללא רעלן פנימי. ההיקף המינימאלי לכל גם צריך להיות 28 μl.

3. בצע transfections

ביום 2 של המסך, פלסמידים כתב וDNAs הספרייה הם transfected לתוך תאי 293T.

  1. לכל צלחת ספרייה, לערבב 107.5 μl של RT Optifect (Invitrogen) עם 4.3 מיליליטר סרום ללא מדיה (1:40 דילול) בצינור קלקר. דגירה במשך 5 דקות ב RT, וn לוותר 44 μl (לכל צלחת ספרייה) לבאר כל צלחת 96 היטב, תחתית-V קלקר (גריינר).
  2. מניחים את הצלחת של Optifect בדילול מלא, פלסמידים כתב (שלב 2.5), DNAs ספרייה (שלב 2.6), ותיבה של טיפים pipet על סיפון הרובוט.
  3. לשאוב 17 μl של פלסמידים כתב, 43 μl של Optifect בדילול מלא, ו26 μl של ה-DNA ספרייה, החדרת אוויר פער 5 μl בין כל שאיפה. ה-DNA הספרייה צריכה להישאף אחרון כדי למנוע זיהום צולב. לוותר התוכן של הטיפים לתוך צלחת עם תחתית V קלקר חדשה, לערבב, לכסות ולהניח בצד ל20 דקות, כדי לאפשר מתחמי שומנים / DNA כדי ליצור. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, להחליף הטיפים pipet וצלחת ספרייה, וחזור.
  4. לחשוף את צלחת תערובת Optifect / DNA ולמקם אותו על סיפון הרובוט עם 2 צלחות של תאי 293T. שימוש בקופסה אחת של טיפים pipet, לשאוב 80 μl של Optifect: תערובת ה-DNA ולוותר לאט 40 μl על כל צלחת של תאים. אם טרנסfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל Optifect: צלחות ה-DNA. כסה תאים.
  5. צנטריפוגה צלחות התא ב1,200 XG במשך 30 דקות. כסה ולחזור לחממה.
  6. דגירה התאים למשך 4-6 שעות. במהלך דגירה זה, להכין תקשורת טרי על ידי ערבוב DMEM 12 מיליליטר מכיל 10% FBS ו10 מיקרוגרם / מיליליטר ציפרופלוקסאצין (Cellgro) לכל צלחת ספריית transfected. יוצקים תקשורת טרי לתוך מאגר סטרילי.
  7. מניחים 2 קופסות של טיפים רובוט, צלחת אחת של תאים, המאגר המכיל תקשורת טריות, ומאגר פסולת על סיפון הרובוט. של תקשורת לשאוב 100 μl מהתאים ולוותר למאגר הפסולת מלא באופן חלקי עם 70% אתנול. בעזרת טיפים טריים, של תקשורת הטרי לשאוב 100 μl ולוותר לאט על גבי התאים. חזור על פעולה עבור כל הצלחות של תאים.
  8. חזור צלחות החממה ל48 שעות.

4. בצע כפול לוציפראז-מבחני

ביום 4 של המסך,מבחני גחלילית בלוציפראז וRenilla מבוצעים.

הערה: assay הכפול לוציפראז דורש תוספת רציפה של 2 מאגרים assay, חיץ גחלילית assay 3X וחיץ assay 3X Renilla, כפי שמתואר בטבלה 3 luciferases Firefly וRenilla אינם מופרש, ולכן תאים חייבים להיות lysed לפני מדידת פעילות לוציפראז. . חיץ assay Firefly lyses תאים ומספק מצע לגחלילית בלוציפראז; חיץ assay Renilla מרווה את אות הגחלילית ומספק מצע ללוציפראז Renilla.

  1. לכל צלחת ספרייה, להכין 8 מיליליטר של חיץ גחלילית assay 3X מפתרונות מניות כפי שמתואר בטבלה 3, ולוותר 82 μl לבאר כל צלחת עם תחתית V 96 היטב.
  2. לכל צלחת ספרייה, גם להכין 12 מיליליטר של חיץ assay 3X Renilla ולוותר 122 μl לבאר כל צלחת עם תחתית V 96 היטב. מניח בצד שנימאגרי assay גחלילית וRenilla.
  3. הנח קופסא הטיפים pipet, מאגר פסולת, ו2 צלחות של תאים (transfected מאותה צלחת ספרייה) על סיפון הרובוט.
  4. לשאוב 60 μl של תקשורת מכל צלחת וזורקים במאגר הפסולת מלא באופן חלקי עם 70% אתנול. צלחות וכיסוי מניח בצד. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל הסטים של צלחות.
  5. מניחים 2 קופסות של טיפים pipet, הצלחת של חיץ גחלילית assay 3X, ומערכת של צלחות תא על סיפון הרובוט.
  6. לשאוב 40 μl של חיץ גחלילית assay 3X ולהוסיף אותו לצלחת הראשונה של תאים, מערבב היטב. מעבר לטיפי pipet חדשים, לחזור לצלחת התא השנייה. מקום תאים ב RT עבור 10 דקות כדי להשלים תמוגה. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, להחליף את התיבות של טיפים וצלחות תא, וחוזר.
  7. שיא הארה מכל טוב של כל צלחת תא בluminometer, הקלטה ל1 שניות לכל טוב. חזור צלחות לרובוטסיפון.
  8. מניחים 2 קופסות של טיפים pipet, הצלחת של חיץ assay 3X Renilla, ומערכת של צלחות תא על סיפון הרובוט.
  9. לשאוב 60 μl של חיץ assay 3X Renilla, ולהוסיף אותו לצלחת הראשונה של תאים, מערבב היטב. מעבר לתיבה חדשה של טיפים pipet, חזור לצלחת התא השנייה. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל הסטים של צלחות תא.
  10. שיא הארה מכל הצלחות על luminometer, הקלטה היטב כל אחד לשנייה 1 כאמור לעיל. בטל צלחות.

5. ניתוח נתונים

  1. לחשב את הגחלילית: יחס הארה Renilla ("F: יחס R") לכל אחד גם על ידי חלוקת הסעיפים של אות גחלילית ידי הסעיפים של אות Renilla.
  2. לחשב את ערך האינדוקציה על ידי חלוקת F: יחס R של כל אחד גם על ידי F הממוצע: יחס R של הצלחת, למעט 25% הגבוהים ביותר והנמוכים ביותר של בארות.
  3. ממוצע ערכי האינדוקציה ברחבי משכפללצלחת ספריית transfected אחת. גנים גרימת או מדחיקים אלפא סינוקלאין יותר משלושה קיפולים נחשבים "להיטים" במסך הזה והם כפופים להוכחה נוספת ומסכים המשני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערכי לוציפראז טיפוסיים, F: יחס R וערכי אינדוקציה עבור חצי צלחת אחת מוצגים באיור 4 שימו לב ללהיט בגם H2, משדל פי 32.. גנים הגורמים לרעילות מוגזמת (לדוגמא, גם E3), או בארות שהיו transfected גרוע, יפיקו ערכים נמוכים לגחלילית והן luciferases Renilla, אבל ערך אינדוקציה ממוצע. גנים הגורמים אינדוקציה הלא ספציפית של פעילות לוציפראז, אולי באמצעות אינטראקציה עם עמוד השדרה pGL4, יניעו גחלילית וluciferases Renilla באותה מידה, וכתוצאה מכך ערך אינדוקצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלפא סינוקלאין היה מעורב במחלת פרקינסון (PD) כמרכיב של גופי לוי 4, תכלילים תאיים נחשבים pathognomonic למחלה. מחקרי עמותה הגנום רבים מצאו קשר בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד בsynuclein אלפא עם סיכון מוגבר לספורדיים פ"ד 5,6,7. אמנם פחות נפוצה מאשר פ"ד סדיר, פ"ד המשפחתי עשוי להיות גם נגרמים על ידי מוטציות בsynuclein אלפא 8, כמו גם כפילויות וtriplication של לוקוס אלפא סינוקלאין 9,10,11, תופעה ראתה גם בפ"ד סדיר 12.<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תמלוגים המתקבלים על ידי BacMamreagents רישוי (פטנט בארה"ב 5,731,182).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ון דרגה של MGH-DNA Core להכנת ספריית הקרנת ה-DNA. כריסטופר Chigas של פרקין אלמר סיפק תמיכה לא יסולא בפז עבור luminometer Wallac 1420 שלנו. סטיבן Ciacco ומרטין תומא של Agilent סיפקו תמיכה לרובוט בראבו. אנו מודים רון ג'ונסון וסטיב טיטוס בNIH לנדיבות מתן פרוטוקול assay בלוציפראז כפול זוהר שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
QIAQuick PCR ערכת טיהורQiagen28106
PureLink ערכת מיצוי ג'ל מהירהInvitrogenK2100-12
PureLink PCR מיקרו ערכתInvitrogenK310250
PureLinkHiPure פלסמיד מיני-פרפ ערכתInvitrogenK2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep KitInvitrogenK2100-07
Bravoרובוט Agilent-Robot
טיפים לפיפט עם מסנןAgilent19477-022
טיפים לרובוט ללא פילטרAgilent19477-002
צלחות 96 בארות עם תחתית שקופהקורנינג3610
מאגריםAxygenRES-SW96-HP-SI
פוליסטירן V עם תחתית 96 בארות צלחתגריינר651101
פוליפרופילן V עם תחתית 96 בארות צלחתגריינר651201
כיסויי צלחת דבקCryoStuff#FS100
<חזק>מגיב
Phusion DNA פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0530L
BAC 2002-D6Invitrogen2002-D6
עגל מעי אלקליין פוספטאזRoche10713023001
T4 DNA Ligaseניו אינגלנד BiolabsM0202L
pGL4.10PromegaE6651
pGL4.74PromegaE6931
ElectroMAX Stbl4 תאים מוכשריםInvitrogen11635-018
יעילות תת-שיבוט DH5 ואלפא; תאים מוכשריםInvitrogen18265-017
DMEM ללא פנול אדוםInvitrogen31053-028
OptifectInvitrogen12579017
CiprofloxacinCellGro61-277-RF
אבקת Tris-Hydrochlorideסיגמא93287
אבקת Tris-Base סיגמא93286
Triton X-100 פישר נוזלי טהורBP151-100
DTTInvitrogen15508-013
C– nzyme ANanolight309
ATPSigmaA6419
LuciferinInvitrogenL2912
h-CTZNanolight301
PTC124SelleckBiochemicalsS6003

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ORF293T

מאמרים קשורים