הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות
במאמר זה
סיכום
תקציר
miRNAs יציבה נמצאות בכל נוזלי הגוף וכמה miRNAs מחזור מוגנת מפני השפלה על ידי תפיסה בשלפוחית קטנה בשם exosomes. Exosomes יכול להתמזג עם קרום הפלזמה וכתוצאה מכך ההעברה של רנ"א וחלבונים לתא המטרה. התפקודים הביולוגיים שלהם כוללים תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, ותקשורת תאית. מסירה של miRNAs שיכול לווסת את ביטוי הגנים בתאים המקבלים באמצעות דם פתחה אפיקים חדשים להתערבות היעד. בנוסף מציע אסטרטגיה למשלוח של תרופות או סוכנים טיפוליים RNA, תוכן exosomal יכול לשמש כסמנים ביולוגיים שיכול לסייע באבחון, קביעת אפשרויות טיפול וסיכויי החלמה.
כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לexosסמני omal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ"א על ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין.
פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomal בחולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. הנתונים שלנו מראים היציגים Variations בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות של תאי אדם.
כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לסמני exosomal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ"א על ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין.
פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomaln חולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. נתונים המייצגים שלנו מראים שינויים בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות תאים האנושית
מבוא
miRNAs noncoding קצר לווסת ביטוי גנים באמצעות הקשירה mRNA היעד. השלמת רצף זרע ~ 7 זוגות בסיסים מאפשרת מירנה להיקשר לmRNA המטרה וכתוצאה מכך העיכוב של תרגום או בירידה ביציבות של ה-mRNA, אשר שניהם יכולים לגרום לירידה בביטוי של חלבון 1 היעד. מחקר בעשור האחרון הוכיח באופן חד משמעי לתפקיד בסיסי miRNAs בתיווך תפקודים תאיים. יש גם מאמץ ניכר מכוון לנתח שינויים מולקולריים העומדים בבסיס תיווך מירנה מחלות שונות 2,3. יתר על כן, זיהוי האחרון של miRNAs יציבה בנוזלי גוף 4-6 סלל את הדרך לשימוש בם כסמנים ביולוגיים חדשניים המתאימים לאבחנה קלינית.
....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בשימוש בדגימות דם של בני אדם ומכרסמים הוצאו להורג בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים. בני אדם נרשמו לאחר שנתן הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי מכללת אוניברסיטת דרקסל של דירקטוריון סקירה מוסדי רפואה ואת כל הנהלים למחקרים שבוצעו באמצעות בעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של דרקסל ועדה השתמשו.
1. טיהור Exosome מדם (~ 5.5 שעות)
טיפים
- אנו resuspend....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר בידוד exosomes מתקשורת ותרבות דם או סלולרי, טוהר של exosomes יכול להיבדק על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) וכתם המערבי (האיורים 1A ו-1B). אנחנו אישר הכנות exosome ממקורות שונים עם EM וכתם מערבי באמצעות נוגדנים מרובים. איור 1 א מציג תמונות EM המאשר כי exosomes הם שלמים בקוטר של 30 ננומטר ~ -100 ומכיל CD81 על ידי תיוג immunogold. סמני exosomal נפוצים הם גליקופרוטאינים משפחת HSP70 וtetraspannin CD63, CD81 וCD9 14. לאחר אישור התקינות ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, אנו מראים כימות של miRNAs וmRNAs מexosomes מטוהרים על ידי צנטריפוגה ההפרש מאמצעי תקשורת והתרבות בדם. יש לי Exosomes מרכיבים שונים התלויים מוצאם והם מעורבים במספר תפקודים ביולוגיים, כולל תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, תקשורת תאית, והעברה של רנ"א וחלבונים 9,11,12,19,20. אמנם גודל וצורה הוא הקובע של טוהר exosome, מספר העיתונים המראים א"מ הנתונים מצביע על כך ששלפוחית exosomes אלה יכולים לנוע בגודל ובמורפולוגיה מבוססת על המקור שממנו הם מופרשים כמו גם א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש מחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרנות מריטה אלן מענק קרן לSeena אג'יט. המחברים מבקשים להודות אריקה Balogh וד"ר Soumitra Ghoshroy מאוניברסיטת דרום קרוליינה מרכז מיקרוסקופית אלקטרונים לשימוש מכשיר, סיוע מדעי וטכני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ואקטיינר מצופה EDTA (שפופרות 10 מ"ל) | BD Diagnostics | 366643 | לטיהור אקסוזום מדם אנושי |
| שואב אבק מצופה EDTA (שפופרות 2 מ"ל) | BD Diagnostics | 367841 | לטיהור אקסוזומים מדם עכבר |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | לבידוד miRNA מסך הדם |
| miRVana ערכת בידוד microRNA | אמביון | AM1561 | |
| חומצה-פנול: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan אוניברסלי PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | עבור כרטיסי TLDA |
| Megaplex RT מכרסמים בריכה סט v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp מכרסמים בריכה סט v3.0 | Applied Biosystems | ||
| מערך Taqman מכרסם MicroRNA A+B סט V3.0 | יישומי ביוסיסטמס | 4444909 | |
| מגהפלקס RT בריכה אנושית סט V3.0 | יישומי ביוסיסטמס | 4444745 | |
| מגהפלקס Preamp בריכה אנושית סט v3.0 | יישומי ביוסיסטמס | 4444748 | |
| מערך תקמן אנושי מיקרו-רנ"א A+B כרטיסים סט v3.0 | יישומי ביוסיסטמס | 4444913 | |
| טקמן ערכת MicroRNA RT | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman מהיר אוניברסלי PCR מאסטר מיקס | Applied Biosystems | 4366072 | עבור mRNA qRT-PCR |
| גורם נמק גידול (בדיקת פריימר) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| גורם גדילה אנדותל כלי דם A (בדיקה פריימר) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA ערכת סינתזה עבור RT-qPCR | תרמו מדעי | K1642 | עבור mRNA |
| HSP70 נוגדן | Abcam | ab94368 | עבור כתם מערבי |
| אנטי ארנב IgG-Gold | Sigma | G7402 | למיקרוסקופיה אלקטרונית |
| ארנב-אנטי CD81 | סיגמא SAB3500454 | ||
| ניקל 300 רשת פחמן formvar רשתות | מיקרוסקופיה | מדעי FCF300-Ni | |
| נחושת 300 רשת פחמן פורמבר רשתות | אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה | אלקטרונית FCF300-Cu | |
| <חזק>טבלה 1. טבלה של ריאגנטים ספציפיים. |
מקורות
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
