הערכת פנוטיפים ניווניות ב דרוזופילה נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

את הספציפיות של מבחני המתוארות כאן מסתמכת על השימוש בקו זבוב Gal4 המנצל את רצפי הרגולטורים של גן hydroxylase טירוזין כדי להשיג ביטוי ספציפי בדופאמין נוירונים ^3. hydroxylase טירוזין מזרז את הצעד הראשון ושער הגבלת בסינתזת דופמין. immunoreactivity בעולם בחופף במוח זבוב בוגר עם זה של דופמין, מה שהופך TH מועמד טוב לזהות נוירונים DA in vivo (ראה, למשל, ^6). יתר על כן, את דפוס הביטוי של THGal4 הוא יותר ספציפי מזה של Gal4 קווים אחרים כגון DdcGal4, המכיל רצפים רגולטוריים מגן decarboxylase dopa ומניע את הביטוי מהונדס לא רק בתאי עצב DA, אלא גם בתאי עצב serotoninergic ותת קבוצות של תאי גלייה ³ .

Feany והנדר (2000) נצפו לראשונה כי ביטוי הפאן עצבי של גן פ"ד הצמוד האנושי α-synuclein מאיץ את האובדן ההדרגתי של STAהתנהגות geotaxis שלילית מושרה rtle בדרוזופילה. יש לנו נצפתה תוצאות דומות באמצעות THGal4 הקו הספציפי DA-נוירון לנהוג expressionof α-synuclein transgene ¹⁰ והשתמשה בזה תפקודי קריאה החוצה כדי ללמוד את תפקיד neuroprotective של מסלול Nrf2 בזה מודל של דרוזופילה פ"ד ^14. Assay הספציפי המתוארים כאן הוא עיבוד ² ו ^-3.

מוח תסיסנית מכיל יותר מ -100 נוירונים DA, מסודרים בלפחות 5 אשכולות שונים (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) אשר יכולה להיות דמיינו בmounts כל המוח על ידי מיקרוסקופיה confocal (ראה למשל ¹¹ ו ^-7). זה עדיין שנוי במחלוקת או לא מספר הנוירונים DA בירידות במוח תסיסנית עם גיל ^{9, 11,} עם זאת, ניוון מוחיים תלוי גיל הוא ציין בזבובים שבו גני פ"ד צמודים כבר מוטציה / overexpressed למודל מחלות אנושיות5. הביטוי של אדם α-DA synuclein בנוירונים יש השפעה כזו, ולכן, כבר משמש כמודל למחלת פרקינסון. כאן אנו מתארים assay לנוירונים DA לספור במוח כולו עולה באמצעות TH כסמן תא. assay זה הותאם מ ^-13 ו ^-10.

1. Assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה

1. בחר זבובים של הגנוטיפ הרצוי, להפריד ביניהם על פי מין, באופן אקראי קבוצתם בקבוצות של 20-30 חיות ולהעיף אותם לתוך צלוחיות מזון חדשות כל 2-3 ימים; בדיקה כל קבוצה של זבובים (קבוצות גיל בהתאמה כלומר, עוקבה / אחד גנוטיפ) לפחות פעם בשבוע.
2. שלושים דקות לפני בדיקת geotaxis השלילית, להרדים את הזבובים עם CO ₂ ולמקם אותם בצינורות פלסטיק שקופים שכותרתו מראש שנעשו עם שני בקבוקוני מזון ריקים (ראה טבלת חומרים) הצטרפו בפתחיהם עם קלטת ברורה (קאמריים ממדים: 19 ס"מ על 2.85 ס"מ). במבחנים שלנו בדרך כלל אנו משתמשים 25 זבובים / צינור.
   הערה. זמן ההתאוששות מהרדמה יכול להיות מגוון מכמה דקות לכמה שעות (לדוגמה: O / N) וצריך להיות מותאמת לגנוטיפים הספציפיים שנבדקו.
3. סמן גבהים שונים (מ -1 עד 20 ס"מ) על פיסת נייר וקלטת נייר סופג בsurfac אנכידואר, בניצב לספסל.
4. מניחים את הצינורות בראשונים של העיתון: הצינורות צריכים להיות כל מיושרים וקרובים ככל האפשר לנייר כדי לאפשר מדידת גובה מדויקת.
5. מקם את המצלמה הדיגיטלית (ראה טבלת "ציוד המיוחדת") בחזית של הצינורות, במרחק של 20-30 ס"מ מהנייר, על מעמד (למשל תיבת קצה פיפטה), בחר באפשרות "הסרט" ולהתחיל הקלטה; בשלב זה אתה גם צריך להתחיל טיימר כדי לעקוב אחר הזמן בין משפטים רצופים.
6. לאפשר לזבובים לאסוף בחלק התחתון של הצינור על ידי הקשה על הצינור לכמה שניות (לדוגמא 10 שניות). צעד זה צריך להתבצע באופן עקבי (כלומר אותו משך זמן, אותו כוח, אותו מפעיל) לאורך כל הניסוי.
7. תנועות "זבובים להקליט עם המצלמה הדיגיטלית עבור 10 שניות.
8. חזור על שלבים 1.5-1.7 ארבעה עשר פעמים במרווחים חד min.
9. לנתח את הנתונים:
   1. לספור את מספר הזבובים שהם מעלסימן 2 ס"מ לאחר 10 שניות על ידי בדיקה ויזואלית של סרטים המוקלטים.
      הערה: בתנאי assay שלנו התנהגות geotaxis השלילית של הזבובים לא נמשכת מעבר ל10 שניות הראשונה לאחר מפתיע (כלומר זבובים החלו לנוע לכל הכיוונים 10 שניות לאחר שהבהיל אותם). המרחק המינימאלי טיפס על ידי זבובי בקרה (כלומר 1 זבובים ישנים בשבוע המבטאים את נהג THGal4, ראה אגדה של איור 1) בחלון זמן זה היה 2 ס"מ. לכן, השתמשנו בסימן 2 ס"מ כהפניה לניתוח פעילות הטיפוס של זבובים של גילים וגנוטיפים 10 שניות לאחר שיזם את ההתנהגות שונים. פרמטרים אלה עשויים לדרוש התאמה לחשבון להבדלים בהתנהגותם של הזבובים שנבדקו (בשל למשל לרקע גנטי שונה או בתנאי מעבדה). שים לב שבתנאי assay שלנו, את כל גנוטיפים נבדקו ביצע גרוע או בדומה לזבובים של גנוטיפ השליטה.
   2. קח את הממוצע של התוצאות מהחמש עשרניסויים.
   3. ממוצע מפורש כאחוז מהמספר הכולל של זבובים בצינור (= פעילות טיפוס%); מספר החזרות (N) ניתן על ידי מספר הקבוצות עצמאיות שנבדקו עבור כל גנוטיפ
   4. להעריך את המשמעות סטטיסטית בין גנוטיפים שונים לאורך זמן. זה יכול להיות מושלם עם מבחן t של סטודנט (כאשר משווים שני גנוטיפים) או ניתוח ANOVA-2 דרך ואחריו Bonferroni פוסט הוק בדיקה (בעת ביצוע השוואות מרובות) באמצעות תוכנות מסחריות כגון GraphPad (GraphPad תוכנה, Inc.La הויה, קליפורניה, ארה"ב).

פתק

אנו מבצעים את כל מבחני שלנו באותו הזמן של היום, ב RT ותחת אותם תנאי האור. שמירה על הזבובים בסביבת מחזור אור / חושך 12 שעות רצוי לשלוט על ההשפעה של מקצבי היממה על ההתנהגות של תנועה של הזבובים.

2. Immunofluorescence hydroxylase טירוזיןAssay של Mounts המוח כל

פתרונות וחוצצים

פתרון מקבע: paraformaldehyde 4% (PFA) ב פוספט שנאגרו מלוח (PBS)

כביסה חיץ: 0.1% טריטון X-100 ב PBS

חסימת מאגר: 0.1% טריס-HCl, pH 7.5, 0.15 מ 'NaCl, 0.1 טריטון X-100 ו 0.5% BSA

תקשורת הרכבה: Mowiol-Dabco (ראה פרוטוקול המתואר בארלו E, ליין ד, נוגדנים-מעבדה ידני, מעבדות קולד ספרינג הרבור עיתונות, קולד ספרינג הארבור, ניו יורק, ארה"ב, 10:418 (1988))

נוהל

1. שים זבובים בצלחת לנתיחה מלאות EtOH 70% לכ - 1 דקות כדי להסיר את השעווה לציפורן.
2. ההעברה עפה לצלחת לנתיחה נוספת מלאות קר כקרח PBS.
3. מנתחים את המוח:
   1. הנח את הזבוב עם הצד עד הגחון (אופציונלי: כנפיים ורגליים סרות).
   2. משוך את הראש מהגוף: להשתמש בסט אחד של מלקחייםלשמור על הגוף ועוד אחד להחזיק בציפורן תחת עיינותיו כדי למנוע נזק למוח
   3. הסר את חוטם.
   4. להחזיק בציפורן את הראש בצדדים מנוגדים של החריץ שנותרו פתוח לאחר הסרת החוטם ומושך בכיוונים מנוגדים, עד שהמוח הוא להסיר את הקפסולה בראש.
   5. הסר את כל הציפורן מהמוח.
   6. הסר את כל הרקמות קנה הנשימה אוויר מלאה, זה ימנע מהמוח צף בשלבי הדגירה הבאים.
4. חותכים כמה מילימטרים מחוץ לקצה של קצה P-200 פיפטה ולאזן אותו עם 0.1% פתרון X-100/PBS טריטון
5. באמצעות קצה P-200 פיפטה המוכן, להעביר את המוח לצינור Eppendorf 0.5 מ"ל מלא 0.5 מ"ל של PFA 4% / PBS ולשמור על קרח עד לנתיחה מלאה.
6. תקן את המוח על RT במשך 20 דקות: להחיל סיבוב עדין על ידי לשים את צינורות Eppendorf על מדף ומיקום המדף על nutator.
7. הסר מקבעבאמצעות P-1000 מיקרו פיפטה, להוסיף 0.5 מ"ל של X-100/PBS טריטון 0.1%, מערבב על ידי היפוך ולתת דגירה דקות 1; חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת.
8. הסר את החוצץ מלשטוף את השני, להוסיף 0.5 מ"ל של X-100/PBS טריטון 0.1% ולתת לדגור על RT במשך 20 דקות, לחזור על פעולה זו פעמיים.
9. הסר את חיץ הכביסה ולתת למוח של דגירה בחיץ חסימה (0.1 מ 'טריס-HCl, pH 7.5, 0.15 מ' NaCl, 0.1% טריטון X-100 ו 0.5% BSA) עבור שעה 1 ב RT.
10. דגירה את המוח עם דילול 1:100 של נוגדן אנטי-TH (ראה "טבלה של חומרים כימיים ספציפיים") בפתרון חסימה, במשך יומיים, בשעת 4 ° C, עם סיבוב עדין (ראה שלב 2.6.).
11. חזור על צעדי הכביסה 2.7. ו2.8 ..
12. לאזן את המוח עם דילול 1:200 של פתרון חסימת antibodyin המשני, במשך יומיים, ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב עדין.
13. חזור על צעדי הכביסה 2.7. ו2.8 ..
14. הכן את שקופיות הרכבה כפי שמודגם באיור 2 א:
    1. dd 2 X 25 טיפות של μl תקשורת הרכבה למכסה זכוכית (24 מ"מ X 60, לא. 1.5).
    2. מקום שתי כוסות כיסוי (גודל 18 x 18 מ"מ, לא. 2) על תקשורת ההרכבה עוזבת פער באמצע השקופית ולתת להתייבש.
    שים לב. בדקו את בעל המדגם על הבמה של מיקרוסקופ confocal שלך. אתה יכול לעשות את מכסה הזכוכית באותו גודל של 25 x 75 מ"מ שקופית על ידי הצמדת זכוכית 22 x 22 מ"מ 1.5 כיסוי לאחד הקצוות (להשתמש בלק וקלטת).
15. הסר את חיץ הכביסה, להוסיף 50 μl של תקשורת הרכבה ולאפשר למוח כדי לאזן עם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה.
16. באמצעות חתך P-200 פיפטה קצה (ראה שלב 2.4) להעביר את מוחות לשקופית במרחב שבין שתי coverslips ולכסות אותם עם coverslip לא. 1.5 (ראה איור 2 א; כדי לכוון את מוחם בשקופית רואה ^7).
    הערה: את הדגימות הם רכובים בין שתי כוסות כיסוי כדי לאפשר הדמיה של שניהם הקדמי וPosteצד rior של המוח.
17. למלא את כל החלל שבין משקפיים לכסות עם תקשורת הרכבה; פיפטה מפינה אחת כדי להסיר את כל האוויר; לתת יבש וחותם עם לק.
18. על מנת להעריך את המספר של נוירונים דופאמין באשכול ספציפי לרכוש סדרה של קטעים אופטיים לאורך ציר ה-Z עם 1.0 מיקרומטר גודל צעד באמצעות מיקרוסקופ confocal (לזיהוי האנטומי של אשכולות דופאמין במוח הבוגר תסיסנית לראות ^7).

יש לנו בשימוש במבחנים שתוארו כאן כדי ללמוד את התפקיד של מסלול Nrf2 מגן מתח במודל של דרוזופילה פ"ד 14. מודל זה מסתמך על הביטוי של גן α-synuclein האנושי בנוירונים תובע באמצעות Gal4 נהג TH 2, 10.

איור 1 מראה תוצאת נציג של geotaxis שלילית המושרה בהלה (טיפוס) assay בזבובי זכרים מבטאים transgenes שונה תחת שליטתו של נהג Gal4 TH. כל גנוטיפים נבדקו יפגינו ירידה בפעילות של תנועה לאורך זמן, עם זאת, זבובים להביע פ"ד הצמוד, האנושי α-synuclein transgene להציג ירידה מואצת ביחס לזבובי בקרת גיל בהתאמה (TH נהג Gal4 לבד) או זבובי שיתוף מבטא- ה-DNA מחייב Nrf2 שותף המאפיה-S. תוצאות דומות נצפו בזבובים ממין נקבה.

איור 2 ממחיש תוצאת נציג לתובע מבוסס immunofluorescence THנוירון לספור. ההשפעה של רקע גנטי שונה על מספר תאי העצב במוח PPL1 מ 4 זבובי זכרי בן שבוע היא לכמת כמתואר במקרא הדמות. שים לב לירידה הקטנה אך משמעותית של תאי עצב במוח PPL1 מזבובים המבטאים α-synuclein.

איור 1. זבובי assay geotaxis השלילית הנגרם בהלה. קבוצות של גיל בהתאמה של גנוטיפים שצוינו נבדקו לפעילות של תנועה במרווחי זמן של שבוע. פעילות טיפוס הייתה מחושבת על ידי ספירת מספר הזבובים מעל ס"מ סימן 10 שניות 2 לאחר הלחיצה על הבקבוקון ולהביע ערך זה כאחוז מהמספר הכולל של זבובים הכלולים בבקבוקון. הנתונים מראים פירוש ± SEM של חמש קבוצות עצמאיות של 20-30 זבובים. משמעות הוערכה עם ANOVA דו כיוונית עם Bonferroni פוסט הוק בדיקה (p <0.05). ההבדלבין TH, α-Synflies וזבובים של שלושת גנוטיפים האחרים שנבדקו היו משמעותי ב4 ו 5 שבועות.

איור 2. תרשים זרימת א זיהוי וספירה של תאי עצב DA על ידי immunofluorescence TH. ממחיש את הפרוטוקול להכנת שקופיות במוח. לתיאור מפורט יותר של כל שלב לראות את הטקסט. מיקרוסקופ ב 'הנציג של כל הר מוח (hemibrain ימין, מבט אחורי) immunostained עבור ה. סט של תמונות סדרת Z-confocal נרכש באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, אובייקטיבי שמן 40X (N / 1.25), מסגרת ממוצע 2, מיקרומטר צעד בגודל 1, בפורמט 1,024 x 1,024 והידור כהשלכה מרבי ( מוצג). עמדתו של אשכול PPL1 תובע נוירון מודגש. ג הנציג resuחיסכון לטווח ארוך לתובע נוירון ספירות הושג באמצעות immunostaining TH. מספר הנוירונים באשכול PPL1 הוערך על ידי בודק את התמונות האישיות של כל confocal Z-Series. N מייצג את מספר דגימות בלתי תלויות ניתח עבור כל גנוטיפ. הנתונים הם אמצעי ± SEM משמעות הוערכה עם הסטודנטים של t מבחן (* p <0.05). לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

גנוטיפים: 'קון', THGal4 / +; THGal4 / +; 'כטב"מ-Syn', THGal4, כטב"מ
ΑSynuclein-/ +; THGal4, כטב"מ-αSynuclein / +; 'כטב"מ-המאפיה-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'כטב"מ-α Syn / כטב"מ-המאפיה-S', THGal4, כטב"מ-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, כטב"מ-αSynuclein / +; 'keap1 EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; "כטב"מ-α Syn/keap1 EY5 ', THGal4, כטב"מ-αSynuclein / +; THGal4, כטב"מ -αSynuclein/keap1 EY5.

[לשחזרו מרונה et al. 2011) בהסכם עם מדיניות "הגישה הפתוחה" של "מודלים מחלות ומנגנונים".]

אנו מצהירים כי אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים.