טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקת הדמיה vivo לשעבר עכבר הנשימה epithelia לניתוח כמותי של תפקוד ריסי ניעתי חשוב לתובנה פונקצית אישור mucociliary כבר נקבע. שנקטפו זה עתה בעכבר קנה הנשימה היא לחתוך longitudinally דרך שריר trachealis ורכובה בתא מוקף חומה רדוד על צלחת זכוכית בעל תחתית. המדגם קנה הנשימה ממוקם לאורך הציר הארוך שלה כדי לנצל את היתרון של שריר trachealis להתכרבל longitudinally. זה מאפשר הדמיה של תנועת הריסים בתצוגת הפרופיל לאורך קנה הנשימה כולה. קטעי וידאו ב200 מסגרות / שני מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ לעומת פער התערבות ומצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של תדירות פעימת ריסים וצורת גל הריסים. עם התוספת של חרוזי ניאון במהלך הדמיה, גם ניתן לקבוע את זרימת נוזל ריסים שנוצרו. זמן הפרוטוקול משתרע על פני כ -30 דקות, עם 5 דקות לחדר הכנה, 5-10 דקות למדגםהרכבה, ובמשך 10-15 דקות videomicroscopy.
מבוא
ניתוח של תפקוד ריסי ניעתי בepithelia הנשימה חשוב בניסוי להבהרת גורמים הגנטיים וסביבתיים שיכול להשפיע על אישור mucociliary ובריאות ריאתי 1. הפרוטוקול פשוט פיתחה להדמית עכבר הנשימה epithelia מספק שיטה יעילה לחקור את תנועתיות ריסי נשימה במודלים של עכברים שעברו מוטציה ונוקאאוט ודורש מיומנויות בסיסיות בלבד בנתיחת רקמות קנה הנשימה עכבר והדמיה vivo לשעבר של תנועתיות ריסי נשימה עם videomicroscopy ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה הוקם ומעודן במהלך מסך mutagenesis עכבר בקנה מידה גדול, כדי לאפשר הערכה מהירה של תפקוד ריסי ניעתי (תדירות פעימות ריסים, צורת פעימת ריסים, זרימה שנוצרה cilia) במוטנטים עם מחלת לב מולדת הקשורים heterotaxy 2-5.
טכניקות קיימות בשימוש כדי ללמוד תנועתיות ריסי דרכי הנשימה יכולה להיות מקובצים או סוג vivo לשעבר החריף או לוןטווח גר במבחנת גישות ניסיוניות. ניסויים אקוטיים כוללים הדמיה vivo לשעבר של ביופסיות אדם מכחול האף / נשימה 6,7 וניתוח של סעיפי נשימה רוחביים פשוטים 8. במבחנת הגישות להשתמש בטכניקות של תרביות תאים שונות כדי ליצור גיליונות של epithelia מובחן ריסים כמו בתרבויות ממשק נוזלי אוויר או תרבויות השעיה נשימה 9-11. עם זאת, טכניקות הנשימה reciliation epithelia אלה דורשות השקעה משמעותית מאוד בזמן ובאימונים לפני כל תאי אפיתל ריסים שמישים מיוצרים לניסויים (4-6 שבועות 9,10). בעוד ניתוח vivo לשעבר חריף של ביופסיות מברשת אפיתל נשימה משמש בדרך כלל למחקרים קליניים בבני אדם, שיטה זו אינה שמישה במחקרי עכבר בשל החמירה פגיעה ברקמות מכאנית 12.
הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה לניתוח של mousדואר קנה הנשימה דרכי הנשימה epithelia הוא לא רק פשוט לביצוע, אבל זה לא דורש כישורים מיוחדים ולא לנתיחה כל ציוד מיוחד מלבד אלו סטנדרטי להדמיה על ידי videomicroscopy. ישנם יתרונות רבים לפרוטוקול זה פשוט. ראשית, כפי שקציר הרקמה מקנה נשימת העכבר הוא מהיר וקל לביצוע, שהוא מאפשר להערכה מהירה של תפקוד ריסי נשימה במספר רב של עכברים. זה יכול לכלול ניתוח חריף של ההשפעות לטווח הקצרים של טיפולים שונים במבחנה. שנית, להיות טכניקת vivo לשעבר, אפיתל דרכי הנשימה הריסים נשאר קשור אליו שבבסיס רקמות תומכות ובכך לשמור על מסלולים הקשורים תא איתות. לכן בהשוואה במבחנת reciliated הנשימה epithelia, הכנה זו היא ייצוג טוב יותר של הסביבה הטבעית ברקמות גוף חייה. שלישית, פרוטוקול זה מאפשר רכישה של מספר הפרמטרים כמותיים שונים שיכול לספק הערכה האובייקטיבית של f ריסי ניעתימשיחה. לבסוף, בניגוד לשיטות קיימות אחרות לשם ויזואליזציה ריסי דרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הריסים בזווית ישרה לכיוון הכה הריסים, המאפשר צפייה בפרופיל של הריסים שהם אופטימלי להדמיה ברזולוציה גבוהה של פעימת ריסים ודור גל metachronal .
פרוטוקול זה יכול להיות שונה במספר הדרכים לטפל במגוון רחב של צרכי ניסיוניים, כגון התפקיד של סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר על תפקוד דרכי הנשימה ריסים ודור / תחזוקה של קצב נשימה ריסים והתפשטות גלי metachronal.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. התקנת ריאגנטים
1.1 Dissection והדמיה בינוני
L-15 בינוניות של ליבוביץ (L15) הוא השלים עם FBS (10%) ופניצילין, סטרפטומיצין (מ"ל של פניצילין G נתרן ו100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין סולפט 100 יחידות /) משמש גם במהלך המסיק וההדמיה של דגימות קנה נשימה.
2. עצרת לשכת תרבות רדודה מוקפת חומה
התא נהג לקיים רקמה מקנה נשימה מוצג באיור 1. רצפת החדר היא זכוכית תחתית צלחת תרבות 35 מ"מ. למעלה ובצד של החדר נוצרת על ידי הנחת פיסה קטנה של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ"מ על צלחת הזכוכית. שולי הגיליון הוא לחתוך כדי להתאים את צלחת תחתית העגולה והמרכז גזוז נוסף ליצירת חדר מרכזי רדוד (ראה שלבים 2.1-2.3). בחלק העליון של המכלול הזה, תלוש זכוכית עגול 18 מ"מ כיסוי ממוקם כדי ליצור תא סגור מתאים להדמיה.
- לחלוטין לכסות תלוש 18 מ"מ עגול עם מכסה זכוכית מרובע של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ"מ.
- עם מספריים לנתיחה חדים רגילים לקצץ את יריעות סיליקון העודפים ממסביב לקצה של להחליק את המכסה (וכתוצאה מכך שכבה מעגלית של יריעות סיליקון).
- עם אזמל חד לחתוך ולהסיר מרובע של יריעות סיליקון (כ 10 מ"מ מרובע) מאמצע להחליק את המכסה המכוסה (ובכך ליצור את החלק העליון והצדדים של חדר ההדמיה) מרכזית.
3. קציר והכנת קנה הנשימה
- להרדים עכברים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים מקומי ולהשתמש בועדה ו / או הנחיות ממשלתיות ולהסיר קנה נשימה לתוך צלחת תרבות סטנדרטי פלסטיק 35 מ"מ עם מספיק L15 תקשורת לרקמה לצלול (מחברים השתמשו בעכברים ממש לפני הלידה בהריון היום 16.5, ועד בעלי חיים יילוד, יילודים, ומבוגר 2).
- סרה של רקמה שאינה משויכת קנה הנשימה מחוברת לחלק החיצוני שלאת קנה הנשימה באמצעות נתיחה בוטה.
- הסר את הגרון עם חתך רוחבי מתחת לסחוס cricoid באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 1).
- הסר את סניפי הסימפונות העיקריים ימין ועל שמאל עם חתך רוחבי מעל קארינה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 2).
- בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים עדינים ולשטוף את 2-3 פעמים עם הלום ~ 1 מ"ל של מדיום הרחצה L15 עם Pipetman P1000 P1000 ועצה כדי לנקות את כל ריר ודם.
- גזור את קטע 3-4 טבעת של קנה הנשימה באמצעות חתך רוחבי עם מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, שורת 1).
- לחתוך longitudinally דרך אמצע שריר trachealis של קטע קצר זה קנה הנשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, קו 2).
- לחתוך longitudinally במרכז של טבעות הסחוס קנו נשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 ג , קו), והשאיר את שני חלקים של קנה הנשימה רקמות מתאימות להדמיה (סעיף יחיד שמוצג באיור 2 ד).
4. ההדמיה cilia
- מגזרי העברה קנה נשימת רקמות, לוואי לומן למטה, אל אמצע צלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה תרבות עם 100-200 μl של מדיום L-15.
- כדי לכמת את הזרימה שנוצרה ריסים להוסיף כמות קטנה של 0.20 מיקרומטר ניאון microspheres למדיום L-15 רחצה דגימת הרקמה מקנה נשימה (~ 1 x 10 11 חלקיקים / מ"ל או 20 μl / מ"ל של ההשעיה microsphere המימית Fluoresbrite 2.5%).
- מקם את חדר ההדמיה שהוכן קודם לכן (ראה נוהל 1-3 לעיל) על גבי מדגם צד גיליון סיליקון קנה הנשימה למטה, עם מדגם קנה הנשימה הממוקם באמצע החדר המוקף חומה הרדוד שהוקם על ידי החלון חתוך ליריעות סיליקון (איור 1 ).
- דחף בעדינות מטה על coverslip כדי להבטיח מקום ובלהסיר כל L-15 תקשורת עודפת ממנצלים הקצוותGA P1000 קצה וP1000 Pipetman.
- הר צלחת 35 מ"מ הזכוכית התחתונה התרבות ומדגם קנה הנשימה במיקרוסקופ הפוכה עם אופטיקה 100X אובייקטיבית ודסק"ש.
- באמצעות תוכנת רכישת סרט מצלמה ומהירות גבוהה לאסוף סרטים של תנועתיות ריסים ב 200 + פריימים לשנייה לאורך קנה הנשימה epithelia הריסים של מכורבל קצה של שריר trachealis (איור 2 ד מפורטים התיבה, E: ירושלים עדיין תמונה מסרט מוקלט) (סרט משלים 1).
- באמצעות הדמיה epifluorescent FITC ואור נמוך מצלמת CCD (ראה רשימת ציוד למעלה), לאסוף סרטים של תנועת microsphere ניאון על פני ריסי epithelia קנה הנשימה על מנת לאפשר כימות מאוחר יותר של זרימה שנוצרה ריסים (משלים סרט 2).
5. Quantitation של תנועתיות צילה
- טען סרטים צלמו דסק"ש לחבילת תוכנת ImageJ ולאחר הטכניקה שתוארה על ידיעין דראמונד 13 להשתמש בכלי הקו למתוח קו סריקה חוצה את הריסים פועמים. "Reslice" של קו זה יוצר תמונה מסוג שבו רשם גלי תנועת ריסים מעבר לקו מייצרת דפוס גל. מספר הפיקסלים בין כל שיא גל נמדד (פיקסל אחד = מסגרת סרט אחד) שממנו ניתן לחשב את מספר הפעימות לדקה (כלומר הרץ).
- כדי למדוד סרטי cilia תזרים עומס ניאון חרוז לתוך חבילת תוכנת ImageJ, ולהשתמש בתוסף MTrackJ 14 כדי לעקוב אחר אופן ידני חרוזי ניאון על פני השטח של epithelia קנה הנשימה ולתת לתוכנה ליצור מהירות ויווני חרוז לכל חרוז במעקב.
יש להקפיד בעת שימוש בחרוזי ניאון לכמת זרימה כמו המרחק מהריסים פועמים חזק יכול להשפיע על עוצמת זרם נמדדת. תנועת חרוז בתוספת 2 סרט היא דוגמה טובה לכך. בדוגמה זו חרוזהתנועה היא מהירה על פני השטח של ריסי מכות ונושרים באופן משמעותי לחרוזים רחוקים יותר בתקשורת הרחצה. כדי לשלוט על זה, צריכים להיות שנאסף העתקי חרוז רק במרחק קבוע מעל epithelia הריסים בכל הדגימות על מנת לאפשר השוואה נכונה צריכה להתבצע. לבסוף, כדי לקבל נתונים יציגים בזרימת נוזל, חרוזים צריכים להיות במעקב במשך זמן רב ככל האפשר, אנחנו מעדיפים להשתמש בשירים חרוזים שמכסים תאי 10 + ריסים לחישוב זרימת נוזל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ריסי נשימה שליטה צריכים להיות לעין וראה להכות באופן מתואם (סרט משלים 1; צפייה בסרט מואטת עד 15% בזמן אמת), עם זרימה מורגשת בכיוון של קצב ריסים (סרט משלים 2; צפייה בסרט היא 100% בזמן אמת). Quantitation של סרטי cilia אמור להניב תוצאות דומות לזה שניתן לראות באיור 3. אוסף של סרטי דסק"ש במהירות גבוהה מאפשר כימות של תדירות פעימת ריסים (איור 3 ג) ונותן תמונות טובות להערכה איכותית של צורת פעימת ריסים, תוך המעקב של חר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מדידה של תדירות פעימת ריסים (CBF) היא קלה יחסית באמצעות מיקרוסקופ כוח מטרות גבוהות וחומרת רכישת תמונה מהירה 13,15, ומסבירה מדוע מדידות CBF מהוות את הבסיס של רוב המחקרים החוקרים אישור mucociliary בבריאות ובחוליים. עם זאת, בעוד CBF המדידה היא חיונית להבנת אישור mucociliary, מדידה של CBF לבד מתעלם החשיבות הבסיסית של שניהם זרימה נוצרה ריסי וצורת גל פעימת ריסים, אשר שניהם הם יותר קשים למדידה, לעתים קרובות התעלמו, ולא יכול לתאם עם CBF. דוגמה לאופן שהגדיל את CBF לא יכול להתכתב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש מחברים אין לחשוף.
תודות
הפרויקט נתמך על ידי מענק NIH U01HL098180 מהלאומי ללב, ריאות ודם מכון. התוכן הוא באחריות בלעדית של כותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של הלאומי ללב, ריאות ודם מכון או המכונים הלאומי לבריאות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לייבוביץ' s L-15 בינוני | Invitrogen | 21083-027 | ללא פנול אדום |
| סרום בקר עוברי | Hyclone | SH30088.03 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x מלקחיים עדינים | Roboz | RS-4976 | |
| מספריים לדיסקציה | Roboz | RS-5676 | |
| מספריים מיקרו דיסקציה | Roboz | RS-5620 | |
| אזמל | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 פיפטמן | גילסון, בע"מ | F123602 | |
| P1000 טיפים | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 מ"מ כיסוי זכוכית עגול החלקות | פישר סיינטיפיק | 430588 | |
| פלסטיק 35 מ"מ כלי תרבות | קורנינג | 430588 | |
| זכוכית תחתון 35 מ"מ כלי תרבות | וורנר אינסטרומנטס | W3 64-0758 | |
| יריעת סיליקון בעובי 0.012 אינץ' (0.3 מ"מ) | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μ קוטר m Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| מיקרוסקופ הפוך, עם מטרת שמן פי 100 ומסנני DIC | Lecia | DMIRE2 | המותג אינו קריטי. |
| מנורת כספית 100 וואט, מסנני עירור/פליטה FITC אפיפלואורסצנטיים | Lecia | Brand אינו קריטי. | |
| חממת שלב מיקרוסקופ | Lecia | 11521749 | לא נדרש אם הדמיית ריסים בטמפרטורת החדר |
| מצלמה במהירות גבוהה שדה בהיר | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand אינו קריטי. חייב להיות מהיר יותר מ-125 פריימים לשנייה |
| מצלמת פלורסנט מהירה | Hamamatsu | C9100-12 | המותג אינו קריטי. חייבת להיות מהירה יותר מ-10 fps |
| תוכנה לניתוח סרטים | המכונים הלאומיים לבריאות | ImageJ עם תוסף |
מקורות
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
