טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקת הדמיה vivo לשעבר עכבר הנשימה epithelia לניתוח כמותי של תפקוד ריסי ניעתי חשוב לתובנה פונקצית אישור mucociliary כבר נקבע. שנקטפו זה עתה בעכבר קנה הנשימה היא לחתוך longitudinally דרך שריר trachealis ורכובה בתא מוקף חומה רדוד על צלחת זכוכית בעל תחתית. המדגם קנה הנשימה ממוקם לאורך הציר הארוך שלה כדי לנצל את היתרון של שריר trachealis להתכרבל longitudinally. זה מאפשר הדמיה של תנועת הריסים בתצוגת הפרופיל לאורך קנה הנשימה כולה. קטעי וידאו ב200 מסגרות / שני מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ לעומת פער התערבות ומצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של תדירות פעימת ריסים וצורת גל הריסים. עם התוספת של חרוזי ניאון במהלך הדמיה, גם ניתן לקבוע את זרימת נוזל ריסים שנוצרו. זמן הפרוטוקול משתרע על פני כ -30 דקות, עם 5 דקות לחדר הכנה, 5-10 דקות למדגםהרכבה, ובמשך 10-15 דקות videomicroscopy.
מבוא
ניתוח של תפקוד ריסי ניעתי בepithelia הנשימה חשוב בניסוי להבהרת גורמים הגנטיים וסביבתיים שיכול להשפיע על אישור mucociliary ובריאות ריאתי 1. הפרוטוקול פשוט פיתחה להדמית עכבר הנשימה epithelia מספק שיטה יעילה לחקור את תנועתיות ריסי נשימה במודלים של עכברים שעברו מוטציה ונוקאאוט ודורש מיומנויות בסיסיות בלבד בנתיחת רקמות קנה הנשימה עכבר והדמיה vivo לשעבר של תנועתיות ריסי נשימה עם videomicroscopy ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה הוקם ומעודן במהלך מסך mutagenesis עכבר בקנה מידה גדול, כדי לאפשר הערכה מהירה של תפקוד ריסי ניעתי (תדירות פעימות ריסים, צורת פעימת ריסים, זרימה שנוצרה cilia) במוטנטים עם מחלת לב מולדת הקשורים het....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. התקנת ריאגנטים
1.1 Dissection והדמיה בינוני
L-15 בינוניות של ליבוביץ (L15) הוא השלים עם FBS (10%) ופניצילין, סטרפטומיצין (מ"ל של פניצילין G נתרן ו100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין סולפט 100 יחידות /) משמש גם במהלך המסיק וההדמיה של דגימות קנה נשימה.
2. עצרת לשכת תרבות רדודה מוקפת חומה
התא נהג לקיים רקמה מקנה נשימה מוצג באיור 1. רצפת החדר היא ז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ריסי נשימה שליטה צריכים להיות לעין וראה להכות באופן מתואם (סרט משלים 1; צפייה בסרט מואטת עד 15% בזמן אמת), עם זרימה מורגשת בכיוון של קצב ריסים (סרט משלים 2; צפייה בסרט היא 100% בזמן אמת). Quantitation של סרטי cilia אמור להניב תוצאות דומות לזה שניתן לראות באיור 3. אוסף של סרטי דסק"ש במהירות גבוהה מאפשר כימות של תדירות פעימת ריסים (איור 3 ג) ונותן תמונות טובות להערכה איכותית של צורת פעימת ריסים, תוך המעקב של חר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מדידה של תדירות פעימת ריסים (CBF) היא קלה יחסית באמצעות מיקרוסקופ כוח מטרות גבוהות וחומרת רכישת תמונה מהירה 13,15, ומסבירה מדוע מדידות CBF מהוות את הבסיס של רוב המחקרים החוקרים אישור mucociliary בבריאות ובחוליים. עם זאת, בעוד CBF המדידה היא חיונית להבנת אישור mucociliary, מדידה של CBF לבד מתעלם החשיבות הבסיסית של שניהם זרימה נוצרה ריסי וצורת גל פעימת ריסים, אשר שניהם הם יותר קשים למדידה, לעתים קרובות התעלמו, ולא יכול לתאם עם CBF. דוגמה לאופן שהגדיל את CBF לא יכול להתכתב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש מחברים אין לחשוף.
תודות
הפרויקט נתמך על ידי מענק NIH U01HL098180 מהלאומי ללב, ריאות ודם מכון. התוכן הוא באחריות בלעדית של כותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של הלאומי ללב, ריאות ודם מכון או המכונים הלאומי לבריאות
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לייבוביץ' s L-15 בינוני | Invitrogen | 21083-027 | ללא פנול אדום |
| סרום בקר עוברי | Hyclone | SH30088.03 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x מלקחיים עדינים | Roboz | RS-4976 | |
| מספריים לדיסקציה | Roboz | RS-5676 | |
| מספריים מיקרו דיסקציה | Roboz | RS-5620 | |
| אזמל | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 פיפטמן | גילסון, בע"מ | F123602 | |
| P1000 טיפים | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 מ"מ כיסוי זכוכית עגול החלקות | פישר סיינטיפיק | 430588 | |
| פלסטיק 35 מ"מ כלי תרבות | קורנינג | 430588 | |
| זכוכית תחתון 35 מ"מ כלי תרבות | וורנר אינסטרומנטס | W3 64-0758 | |
| יריעת סיליקון בעובי 0.012 אינץ' (0.3 מ"מ) | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μ קוטר m Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| מיקרוסקופ הפוך, עם מטרת שמן פי 100 ומסנני DIC | Lecia | DMIRE2 | המותג אינו קריטי. |
| מנורת כספית 100 וואט, מסנני עירור/פליטה FITC אפיפלואורסצנטיים | Lecia | Brand אינו קריטי. | |
| חממת שלב מיקרוסקופ | Lecia | 11521749 | לא נדרש אם הדמיית ריסים בטמפרטורת החדר |
| מצלמה במהירות גבוהה שדה בהיר | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand אינו קריטי. חייב להיות מהיר יותר מ-125 פריימים לשנייה |
| מצלמת פלורסנט מהירה | Hamamatsu | C9100-12 | המותג אינו קריטי. חייבת להיות מהירה יותר מ-10 fps |
| תוכנה לניתוח סרטים | המכונים הלאומיים לבריאות | ImageJ עם תוסף |
מקורות
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
