אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח מ Thaliana ארבידופסיס זרעים. יכולים להיות מבודדים עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. ההליך מתאים לtranscriptome, מתילציה DNA, ביטוי עיתונאי גן, immunostaining וקרינה באתר ניתוחי הכלאה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
בצמחים פורחים, העובר מתפתח בתוך רקמה מזינה - האנדוספרם - מוקפת נעשה עור הזרעים האימהי (או מעיל זרע). כתוצאה מכך, את הבידוד של עוברי צמחים בשלבים מוקדמים (שלב 1 עד תא כדורי) הוא מבחינה טכנית מאתגר בשל הנגישות היחסית שלהם. נתיחת שימוש יעילה בשלבים מוקדמים הנו פגומה מאוד על ידי הגודל הקטן של זרעי ארבידופסיס צעירים והדביקות של העובר לרקמות שמסביב. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת בידוד יעיל של עוברי ארבידופסיס צעירים, מניב עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. עוברים משתחררים לחיץ בידוד על ידי ריסוק מעט 250-750 זרעים עם העלי פלסטיק בצינור Eppendorf. זכוכית microcapillary קשורה הוא למעבדת פיפטה סטנדרטית (דרך צינור גומי) או microinjector נשלט הידראולי משמש כדי לאסוף עובר ממקום טיפותד בשקופית רב גם במיקרוסקופ אור הפוכה. את הכישורים הטכניים הנדרשים הם פשוט והעברה בקלות, וההתקנה הבסיסית אינה דורשת ציוד יקר. עוברים שנאספו מתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כגון מבחני גן כתב RT-PCR, RNA רצף, ניתוחי מתילציה DNA, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), immunostaining, ו.
מבוא
העובר של צמחים פורחים מוקף האנדוספרם, רקמה תזונתית הנגזרת מאירוע הפריה שנייה. גם העובר והאנדוספרם מוקפים בכמה שכבות תאים של קליפת הזרע. ביחד רקמות אלה יוצרים זרעים, אשר יפתחו בתוך הפרי. לפיכך, רקמות וניתוחים ספציפיים של תאי עוברי ארבידופסיס לקויים בשל חוסר הנגישות שלהם בחום. עם זאת, עובר בשלבים מאוחר הכדוריים או במאוחר הם טוב יחסית נוחים לנתיחה ידנית על ידי שימוש במחטים עדינות תחת טונגסטן סטראו, או על ידי הפעלת לחץ קל על הזרע באמצעות מלקחיים כדי לחלץ אותם. טכניקות כאלה היו בשימוש בהצלחה לtranscriptome או ניתוחי אפיון epigenome כמו הכלאה microarray, רצף bisulfite, או RNA רצף (לדוגמה, 1-3). לעומת זאת, המחקרים של עוברים בשלב הזיגוטה לכדורי מוקדם יישארו מאתגרים מבחינה טכנית. נכון להיום, רק כמה מחקרים יש נציגניתוחי transcriptome orted על עוברים צעירים או באמצעות microdissection לייזר לכידה (LCM) של רקמות עוברי מסעיפי זרעים קבועים 4 או מיצוי ידני של עוברים נפרדים מתוך זרעים באמצעות כלים עדינים 5. עם זאת, ציוד LCM אינו זמין בדרך כלל והפקת מדריך לעובר בשלבים מוקדמים הוא זמן רב ודורשים מיומנויות נתיחה מצוינות כי הם לא בקלות להעברה. בנוסף לניתוחי הגנום כולו, בניתוח ביטוי גנים באתרו הם גם קשה לביצוע בעוברים של ארבידופסיס צעירים, כל ההר. במידה מסוימת, ניתן לשחרר עוברים צעירים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי לחץ עדין על הזרעים ומשמשים למבחני גן כתב או זיהוי חלבון על ידי immunostaining (לדוגמה ראה 6,7). טכניקה זו, עם זאת, אינה מאפשרת בידוד עובר תפוקה גבוהה, ובכך פוגע בניתוחים כמותיים.
לכן, פיתחנו פרוטוקול יעיל ומהירלבידוד עובר מוקדם מזרעי ארבידופסיס כי הוא פשוט להתקנה, להעברה בקלות, ומתאים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם. העיקרון הבסיסי הוא לרסק את הזרעים בעדינות - גזור מsiliques צעיר בצינור Eppendorf באמצעות העלי פלסטיק בחיץ בידוד מתאים. תמצית הזרעים ממוקמת בטיפין בשקופית רב גם, והוא הוקרן בנוכחותם של עוברים שפורסמו בשלב הרצוי באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary המצורפת microinjector או פיפטה מעבדה סטנדרטית. עבור יישומים מולקולריים, עוברים נשטפים פעמיים על ידי שחרורו חזר לטיפין של חיץ בידוד חדש לפני העברתם למאגר שהיעד בנפח מינימאלי. עבור יישומי ציטולוגיה (מבחני כתב, immunostaining, דגים), ניתן להשמיט שלבי כביסה.
השיטה מציעה מספר יתרונות: (i) זה מניב 25-40 עוברים ב~ 45 דקות לאפליקצית ציטולוגיהlications או בשעות 3-4 עבור יישומים מולקולריים (כולל שלבי הכביסה), (ב) שהוא מאפשר בידוד של שלבים עובריים ספציפיים, (iii) הוא בקלות להעברה לאנשים אחרים ומעבדות עקב ההתקנה הפשוטה שלה, (ד) אותה דורש ציוד במחיר סביר עבור ההתקנה הבסיסית, הניתנת לשדרוג, ו( V) זה היה בשימוש בהצלחה ליישומים שונים במורד הזרם, כגון RNA רצף 8, גן ספציפי ניתוח ה-DNA מתילציה 9, מבחני כתב (10 וRaissig et al., בהכנה.), ודגים (ג'Jaenisch, ע Grossniklaus, ג Baroux לא פורסם, ראו איור 5).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליך מסוכם בתרשים הזרימה שמוצגת באיור 1. Microcapillaries והתקנת אינסטרומנטלי מוצגים באיור 2 ואיור 3, וצעדים אופייניים של בידוד עובר מוצגים באיור 4.
1. חומר והכנת המאגר
1.1 ציפוי הסיליקון של זכוכית microcapillaries
- הנח את microcapillaries בצינור פלקון 15 מ"ל עם ~ 5 מ"ל של Sigmacote (סיגמא) ולהפוך כמה פעמים.
- הסר את הפתרון, במקום צינור פלקון המכיל את נימי הדם ברדיד אלומיניום ואופה אותם ל3 שעות ב 60 ° C. לאחסן בטמפרטורת חדר.
השיגו 1.2 ~ 50-100 טיפים microcapillary מיקרומטר בקוטר
- משוך 1 מ"מ בקוטר זכוכית נימים באופן ידני מעל מבער בונזן או באמצעות חולץ מסחרי (אנכי נימה חולץ או micropipette חולץ).
- השתמש ביהלומיםעט קצה להב או לחתוך את הקצה של הנימים משכו כדי ליצור את הפתיחה הרצויה. בחר את נימי הדם בצורת הטובה ביותר תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפתיחה צריכה להיות 50-100 מיקרומטר (איור 2).
הכנת מצגת 1.3
- רכיבי סיליקון שקופיות נקיות על ידי כיסוי כל הבארות עם Sigmacote (~ מיליליטר שקופית 1 /) במשך 5 דקות, להסיר. שעות 3 אופים ברדיד אלומיניום. לאחסן בטמפרטורת חדר.
- שטוף את שקופיות הזכוכית המיקרוסקופיות רב גם למשך 10 דקות ב10% SDS, דקות 2 X 2 במי nuclease (autoclaved DEPC שDDH 2 O), 2 דק 'ב 70% אתנול, 2 דקות ב 100% אתנול, אוויר ייבוש. כל הצעדים נעשים בצנצנות Coplin autoclaved. שקופיות יכולות להיות שימוש חוזרת מספר פעמים מתן ניקוי יסודי בין כל שימוש.
- רק לפני התפשטות בידוד עובר ~ 0.5 μl של 10 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) עם טפטפת על כל פני השטח של כל טוב והאוויר יבש.
1.4 מיקרוסקופ והתקנת נימים
- שימוש במיקרוסקופ הפוכה עם 10x ומטרה בהגדלה 20x. לייעל את ניגוד האור (עוברים הם די שקופים).
- הנח micromanipulator להחזיק נימי הזכוכית לצד מיקרוסקופ. נימי הזכוכית הוא מחוברת לmicroinjector (איור 3 א) או P-200 פיפטה רגילה דרך צינור גומי (איור 3, ראה דיון לתיאור מפורט של התקנה זו).
- הנח את הנימים מעל שקופית מיקרוסקופ ב~ 70 ° זווית (איור 3), ולהתאים את המיקום ליש הפתח בשדה הראייה.
- רק לפני בידוד עובר תופס ולשחרר ~ 5-10 μl BSA (1 מ"ג / מ"ל) למעייל הנימים.
1.5 חוצצים
טבלה 1 מפרטת את מאגרי הבידוד ויעד בהתאם ליישומים במורד הזרם.
- הכן ~ בידוד חיץ 1 מ"ל לדגימה טרי לפני שימוש ולשמור אותו על קרח.
- הכן את חיץ היעד בצינור נמוך מחייב מיליליטר אפנדורף 0.5 על קרח (יישומים מולקולריים) או בשקופית מיקרוסקופ (יישומי ציטולוגיה) בתא לח.
2. Dissection הזרע וחילוץ העובר
2.1 סנכרון של פיתוח זרעים
- לסרס פרחים ולשמור אותם 2 ימים בחדר הצמיחה תוך הימנעות ממגע של עליים שנחשפו עם פרחים אחרים, ולאחר מכן האביק אותם (למשל 11).
- בדוק את השלב של התפתחות בתנאי הצמיחה שלך על ידי חקירה מיקרוסקופית של זרעים מנוקים. עם תנאי הגידול שלנו (אור 16 שעות ב21 מעלות צלזיוס, 8 שעות חשכה על 18 מעלות צלזיוס ו -70% לחות) זרעים נאספו 2.5 ימים לאחר האבקה (DAP) הניבו בעיקר 2-4 עוברים סלולריים וזרעים נאספים 3.5-4 DAP הניב כדורי עוברים.
Dissection זרע 2.2 ושבר
- הסר את יםeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) תחת stereomicroscope עם מלקחיים ומחטים לאינסולין.
- לטבול את הזרעים ב20 חיץ בידוד μl בצינור הונח על קרח מ"ל מסביב לתחתית אפנדורף 2.
- בעדינות למחוץ את הזרעים עם העלי פלסטיק (טרום לנקות עם 10% SDS, שטף עם DEPC שDDH 2 O ונשטף עם אתנול 70%) כדי לשחרר את העוברים עד תמצית הזרעים היא חלקית. כוח ליישם הוא שייקבע על ידי כל משתמש על פי דין.
- יש לשטוף את העלי עם 300 μl של חיץ בידוד כדי לשטוף את העלי ולדלל את הדגימה.
- ספין למטה התמצית ב 5000 XG במשך 5 שניות. בעדינות resuspend תמצית pelleted על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
- סנן את התמצית עם רשת ניילון 30 מיקרומטר (רכוב על מתאמי צינור, למשל, על פי PartecCelltricks). יש לשטוף את הרשת עם חיץ בידוד μl 200 נוסף.
3. בידוד עובר
הכנת מצגת 3.1
- מקום שקופית רב גם נקי, BSA מצופה וsiliconized על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה, resuspend תמצית הזרעים המסוננים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה ופיפטה 2 טיפות של תמצית 40-50 μl זרע לתוך בארות 1 או 2 . הקרנה רק 1 או 2 טיפות בכל פעם מונעת אידוי של המדגם.
- מקום μl 50 של חיץ בידוד טרי (1 טיפת st לשטוף) בבאר של שקופית אחרת מוכנה כמו בעבר. שמור את השקופית הזו בתא מכוסה ולח על מנת למנוע אידוי.
3.2 מסך, לנקות, לאסוף
- מסך טיפות של תמצית זרעים לעוברים בשלב הרצוי עם המטרה בהגדלה 10x. במידת צורך, לאשר את הבמה עם הגדלת 20x. את העוברים לרוב לשקוע בתחתית של השקופית.
- להסיר באופן ידני פסולת סביב העובר עם מחט טונגסטן, מחט אינסולין או ציוד דומה.
- הזז את נימי הזכוכית ליד העובר באמצעות micromanipulator, לאהאייק את העובר עם כפתרון קטן ככל האפשר.
- אסוף כמה עוברים (למשל כל טיפה אחת) ולשחרר אותם בטיפה לשטוף -1 (יישום מולקולרי) או במאגר היעד (יישומי ציטולוגיה). כל סיבוב איסוף צריך להיות כל הזמן בתוך דקות ועובר 5-10 צריכים להיות שנאסף בנפח מינימאלי (הנפח הכולל של כל סבבי האיסוף צריך להיות <5 μl).
- חזור על ההקרנה והגבייה עד לכמות הרצויה של עוברים שנאספה בירידת 1 st לשטוף (מרכזי, אם אפשר, כדי להקל על זכירה).
- זוכר את כל העוברים בבת אחת מהירידה לשטוף (אם הפסולת מתבצעת מעל, להסיר אותם עם מחט לפני הזיכרון).
- שחרר את העוברים לירידה לשטוף 2 nd של 50 μl. חזור על 3.2.6.
- שחרר את העוברים במאגר היעד. ההעברה צריכה להיות כרוכה רק קשר, ולא טבילה, של קצה הנימים.
- החלף את microcapilלארי למדגם הבא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הליך בידוד העובר שלנו (איור 1) מאפשר בידוד של עד 40 עוברים בשעה 4 אם שוטף מבוצע, למשל עבור יישומים מולקולריים, או בפחות משעה אם שוטף מושמט, למשל עבור יישומי ציטולוגיה. מציג איור 2 גבוה ונמוך טיפים microcapillary איכות ואיור 3 מציג את ההגדרה של המכונה בידוד העובר. איור 4 מציג תהליך של בידוד עובר במיקרוסקופ ההפוכה.
אנחנו מיושמים ב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתחנו פרוטוקול בידוד עובר שהוא מהיר, יעיל, וניתן להעביר בקלות למעבדות אחרות.
הציוד המתואר כאן מורכב ממיקרוסקופ ההפוך, micromanipulator, זכוכית microcapillaries, חולץ נימה אנכי וmicroinjector (איור 3 א). ההתקנה דומה לזה שתואר לבידוד תא בעלי חיים יחיד לניתוחי transcriptomics 17. כמו כן, אנו עובדים בהצלחה עם התקנה בסיסית יותר שבו זכוכית microcapillaries נמתחו באופן ידני על אש (ולחתוך עם ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות לטל Nawy ומרטין באייר לעצתם בבידוד עובר. MTR, VG, UG וCB פיתחו ציוד בידוד העובר. MTR, VG ו CB פיתחה פרוטוקול בידוד העובר. MTR, VG ו CB הקים את הפרוטוקול, בודד את העוברים, ועובר שנוצר cDNA, VG ביצע PCR, MTR מכתים גאס, ג'יי ג'יי ניסויי הדגים. MTR, VG, CG וUG כתבו את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת ציריך, אחוות קרן מחקר רוש (לMTR), ומענקים מהקרן הלאומית שוויצרי (לUG וCB).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (טכנולוגיות חיים) | 10777-019 | |
| מאגר גדיל ראשון | Invitrogen (טכנולוגיות חיים) | 18064-022 | כלול בחבילת Superscript II |
| DTT | Invitrogen (טכנולוגיות חיים) | 18064-022 | כלול באריזה Superscript II |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) 100x = 10 מ"ג/מ"ל | ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ. | ספקים שונים יעבדו גם | |
| נימים דקים 1.0 מ"מ | מכשירי דיוק עולמיים | TW100F-4 | |
| DNA LoBind צינור 0.5 מ"ל | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 & #956; m | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5 בארות בקוטר 10 מ"מ שקופיות | מדעי מיקרוסקופיה | 63421-10 | |
| תמיסת פורמלדהיד | סיגמא-אולדריץ' | F1635 | |
| Superfrost Plus שקופית | תרמו פישר | J1800AMNZ | Menzel-Glä סר |
| טריס | אמרסקו | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| גליצין | פלוקה | 50050 | |
| כדורי SDS | רוט | CN30.3 | |
| מיקרו עלי | VWR | 431-0094 | |
| מזרקי אינסולין מיקרופיין | BD | U-100 | |
| DEPC | סיגמא-אולדריץ' | D5758 | |
| אתנול | Schaurlau | ET00102500 | |
| מלקחיים N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| <חזק>ציוד | |||
| Nikon TMS (יפן), | |||
| מיקרומניפולטור | לייץ | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 בדיקה Leica | microsystems | 39430101 | מותג אחר יעשה גם את העבודה |
| חולץ נימה אנכי | מכשיר Sutter | דגם P-20 | דגם אחר מתאים גם |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| קיוביט פלואורומטר | Invitrogen (טכנולוגיות |
מקורות
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
