מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגלוקוז לא מבוקר הוא סימן היכר של סוכרת ומקדם נלוות כמו נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה. עם השכיחות הגוברת של סוכרת, הן סוג החיסון בתיווך 1 וסוג 2 צמוד להשמנת יתר, מחקרים שמטרתם מגדירים הפתופיזיולוגיה סוכרת ומנגנונים טיפוליים הם בעלי חשיבות קריטית. Β-התאים של איי הלבלב לנגרהנס אחראים כראוי מפרישי אינסולין בתגובה לריכוז הגלוקוז בדם גבוה. בנוסף לגלוקוז וחומרים מזינים אחרים, β-התאים גם מגורה על ידי הורמונים מסוימים, כינה incretins, אשר מופרשים מהבטן בתגובה לארוחה ולפעול על קולטני β-תאים המגבירים את הייצור של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים ( cAMP). ירידה בתפקוד β-תא, מסה, ואת היענות אינקרטין הם הבינו היטב לתרום לפתופיזיולוגיה של סוכרת מסוג 2, וגם להיות מקושר יותר ויותר wiה סוכרת מסוג 1. הבידוד הנוכחי עכבר איון ופרוטוקול נחישות cAMP יכולים להיות כלי כדי לעזור להתוות מנגנוני קידום התקדמות מחלה והתערבויות טיפוליות, בעיקר אלה שמתווכים על ידי קולטנים אינקרטין או קשור קולטנים הפועלים באמצעות אפנון של ייצור cAMP תוך תאי. בעוד מדידות cAMP רק תתואר, פרוטוקול בידוד איון תאר יוצר הכנה נקייה שמאפשרת גם ליישומים רבים במורד הזרם אחרים, כוללים גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין, [3 H]-תימידין התאגדות, שפע חלבון, וביטוי mRNA.
מבוא
התחזוקה הקפדנית של euglycemia היא הכרחית כדי למנוע נלוות כגון נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה, שהם כולם סימני ההיכר של פתולוגיה מסוג בלתי מבוקר 1 ו 2 סוכרת 1. פונקציה מופחתת β-תאים ומסה בשני מהסוג 1 וסוכרת 2 להפריע ריכוז הגלוקוז בדם 2. ואילו סוג החיסון בתיווך תוצאות 1 סוכרת מאובדן הרסני של β-תאים מייצרי אינסולין, הפרשה לקויה β-תאים לאינסולין ואינסולין איתות היקפית בסוכרת מסוג 2 יחד לקדם היפרגליקמיה, דיסליפידמיה, וייצור הגלוקוז בכבד מוגבר, שסופו של דבר תוצאה הוא גם אובדן מסת β-תא והפרשת אינסולין מקיבולת β-תאים בודדים 3. הבנת מנגנוני β-תאי הבסיס בהתקדמות מסוג 1 וסוכרת 2 יהיה בתקווה להצמיח טיפולים ח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לכל הנחיות הרלוונטיות, תקנות ורשויות רגולטוריות. הפרוטוקול שמפגינים בוצע תחת הדרכתו ואישור הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) מאוניברסיטת ויסקונסין במדיסון.
1. הכנת פתרונות
- השיטה של המתת חסד בפרוטוקול זה היא exsanguination תחת ההרדמה Avertin (לסקירה של חלופות, ראה דיון). כדי להפוך Avertin, להוסיף 0.625 g (1.25% או 44.2 מ"מ) של tribromoethanol 2-2-2 ל1.25 מיליליטר של 2-methyl-2-butanol בצינור חרוטי 15 מיליליטר וחום ב37 מעל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להבטיח תשואת איון גבוהה במהלך בידוד, צריכים להיות אחרי הטכניקות ניתוחיות המפורטים בפרוטוקול באופן הדוק. למרות הטכניקות שהוצגו כאן תהיה מותאמות לכל מעבדה, יש כמה שלבים קריטיים שיובילו לבידוד מוצלח. על מנת להפוך את צינור המרה המשותף נגיש בקלות, מומלץ שהאיברים להיות עקורים לצד הימני של העכבר (איור 1). יתר על כן, זה יאפשר הלבלב לנפח עם כמות קטנה יותר של התנגדות מאז תהיה התרחבות במשקל מגביל פחות. שלב קריטי נוסף על מנת למקסם את תשואת איון הוא קשירה של צינור המרה המש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עם השכיחות של הסוכרת צפויה להשפיע 7.7% מאוכלוסיית העולם, הדרישה של טכניקות מחקר רומן הכרחית לשניהם להבין ולטפל בסוכרת 18. בידוד איון הנוכחי הוא פרוטוקול מבוסס היטב המשמש לניסויים במבחנה וכבר הוצג בעבר עם 11,14,16 שינויים קלים. למרות שהפרשת אינסולין היא יישום במורד הזרם משותף לאיים מבודדים, תוך התמקדות במרכיבים במעלה הזרם, כגון cAMP, עשוי לעזור להתוות מנגנוני potentiating ייצור אינסולין ואת הפרשה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש מחברים אין לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לרנה ל Pasker וHarpreet ק Brar לקבלת סיוע טכני מומחה לפרוטוקולים המתוארים בעבודה זו. יתר על כן, ברצוננו להכיר בחונכות של כריסטופר ב Newgard באוניברסיטת דיוק ואלן ד איתי באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון, יחד עם התמיכה של חברי המעבדה שלהם, שאפשרו לנו את הזמן ואת התמיכה הנדרשת כדי למטב פרוטוקולים שתוארו. בפרט, אנו מודים לאנס Hohmeier, Danhong לו, והלנה וינפילד במעבדה Newgard ומרי Rabaglia במעבדה איתי לדיונים ועצות מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק DK080845 וסוכרת נעורים 594
מענק קרן מחקר 17-2011-608 (לMEK)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קולגנאז מClostridium histolyticum מתאים לבידוד איים פעילים | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks תמיסת מלח מאוזנת 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (אבקה) | Invitrogen (גיבקו) | 31800-022 | |
| אלבומין מסרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 חוט תפר משי | כלי מדע עדינים | 18020-30 | |
| Dumont #5 מלקחיים | כלים מדעיים עדינים | 11251-10 | |
| 0.8 מ"מ מלקחיים | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| מספריים מעוקלים | כלי מדע עדינים | 14061-10 | |
| Vannas-Tü מספריים קפיציים bingen - ישר / חד / 8.5 ס"מ / 5 מ"מ קצה חיתוך | כלי מדע עדינים | 15003-08 | |
| מספריים ניתוח | כלי מדע עדינים | 14002-14 | |
| 5 מ"ל מזרק BD Luer-Lok | 309646 | ||
| 1 מ"ל מזרק | BD | BD 309628 | |
| 30 גרם מחט BD 1/2 אינץ' אורך | BD | 305106 | |
| 27 גרם מחט BD 1/2 אינץ' אורך | BD | 305109 | |
| השחזה אבן | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| 2-2-2-tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | P3911 | |
| מונופוטסיום פוספט (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| נתרן ביקרבונט (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| סרום בקר עוברי מומת בחום (H.I. FBS) | פישר סיינטיפיק | SH30088.03HI | |
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) | סיגמא-אולדריץ' | 5879-100MG |
מקורות
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
