אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) מאפשרת הדמיה 3D של מבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית במצב קרוב לפיסיולוגי 1. עם זאת, להדמיה ישירה של מתחמים נגיפיים בודדים בסביבה התאית שלהם עם מארח cryoET מאתגרת 2, בשל האופי נדיר ודינמי של כניסת ויראלי, במיוחד במקרה של HIV-1. בעוד לחיות תאי הדמיה זמן לשגות הניבה מידע רב על היבטים רבים של המחזור של 3-7 HIV-1 החיים, המוענקת על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה לחיות תאים הוא מוגבל (~ 200 ננומטר). העבודה שלנו הייתה במטרה לפתח שיטת מתאם המאפשרת הדמיה ישירה של אירועים המוקדמים של HIV-1 זיהום על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור ניאון לחיות תאים, מיקרוסקופיה קריו פלורסנט, וcryoET. באופן זה, ניתן להשתמש באותות בתאים חיים וcryo-ניאון כדי להנחות את הדגימה בcryoET במדויק. יתר על כן, מידע מבני מתקבל מcryoET יכול בהדואר השלים עם הנתונים הפונקציונליים הדינמיים שנרכש דרך לחיות תאי הדמיה של היעד מסומן ניאון.
במאמר זה וידאו, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים מפורטות לחקירה מבנית של HIV-1 ואינטראקציות מארח תאים באמצעות הדמיה 3D גומלת במהירות גבוהה תאי חיים וניתוח מבני ברזולוציה גבוהה cryoET. תאים הלה נגועים בחלקיקי HIV-1 אופיינו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה confocal לחיות תאים, ובאזור המכיל אותו החלקיק הנגיפי נותח ולאחר מכן על ידי טומוגרפיה קריו אלקטרון לפרטים מבניים 3D. המתאם בין שני סטים של נתוני הדמיה, דימות אופטי ואלקטרוני הדמיה, הושג באמצעות שלב מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה בבנייה עצמית. הגישה המפורטת כאן תהיה בעל ערך, לא רק למחקר של אינטראקציות תא מארח, וירוס, אלא גם עבור יישומים רחבים יותר בביולוגיה של תא, כגון, סחר בקולט קרום תא איתות, ועוד רבים תהליכים תאיים דינמיים אחרים. </ P>
מבוא
Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) היא טכניקת הדמיה רב עוצמה המאפשרת הדמיה (3D) תלת ממדית של תאים ורקמות ומספקת תובנות לארגון של האברונים ילידים ומבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית למצב פיסיולוגי קרוב 1. עם זאת, בניגוד מיסוד הנמוך של דגימה קפוא התייבשות בלא כתם, בשילוב עם הרגישות לקרינה שלהם, הופך אותו לקשה לאתר תחומי העניין בתוך תא, ולאחר מכן ביצוע סדרת ההטיה בהצלחה מבלי לפגוע באזור היעד. על מנת להתגבר על בעיות אלה, גישה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופ אור ואלקטרונים היא הכרחית. תכונות ספציפיות מודגשות על ידי ניאון תיוג מזוהים וממוקמות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, ולאחר מכן את הקואורדינטות שלהן מועברות למיקרוסקופ האלקטרונים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות הלה סלולרי על פחמן מצופה, זהב רשתות Finder EM
- הפרשות זוהרות פחמן בצד של R2-200 רשת / 2 Quantifoil זהב EM Finder רשת מתחת לגיל 25 אמפר עבור 25 שניות.
- מעיל רשת EM עם פיברונקטין, על ידי אותו צף, פחמן בצד למטה, על רביב μl 40 מ"ל של תמיסת פיברונקטין 50 מיקרוגרם /, ואחר כך לחטא אותו תחת אור UV במשך שעה 2 במכסת מנוע בתרבית רקמה.
- פלייט תאי הלה על גבי רשת בצפיפות של 2 x 10 4 תאים / מ"ל (סה"כ תרבות מ"ל 2) בצלחת תרבות זכוכית תחתונה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לאפיין את ההתנהגות הדינמית של חלקיקי הנגיף, תאי הלה עם HIV-1 היו צילמו על ידי מיקרוסקופ לחיות תאי confocal במהירות גבוהה ותנועות החלקיקים נותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי (איור 1). כדי להימנע מהפער הזמנים של כמה דקות שיכולים להתרחש בין אוסף של התמונה לחיות התאים שעבר confocal ולקפוץ למים קפוא, (שיכול להיות ארוך מספיק כדי לאבד חלקיקים מתואמים HIV-1), שלב מיקרוסקופ אור cryo-פלואורסצנטי (איור 3 ) תוכנן ונבנה עבור הדמיה דגימות קפוא hydrated.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש לנו הצגנו סדרה פשוטה של פרוטוקולים כדי לספק גישה גומלת מתקדמת כדי לנתח את האירועים הסלולר דינמיים באמצעות זמן לשגות הדמיה confocal, לחיות תאי הקרינה ואחרי cryoET. ההתפתחות המתודולוגית שלנו כדי לתאם לחיות תאי ההדמיה 3D עם cryoET ברזולוציה גבוהה היא קריטית כדי לחקור בעיות ביולוגיות מאתגרות רבות, כגון חזותי (לא סטטי, כפי שדווח בעבר), וחלקיקים נדירים, דינמיים עקיפה מוגבלים נגיפיים והאינטראקציות שלהם עם תאי מארח . התנהגות המרחב ובזמן של חלקיקים ספציפיים בתאי חיים מאופיין בניתוח תא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לטראוויס וילר ומכונת חנות במחלקה לביולוגיה של תא ופיזיולוגיה, אוניברסיטת פיטסבורג לבניית שלב מדגם cryo-הקרינה, Changlu טאו ונג שו באוניברסיטה למדע והטכנולוגיה של סין לטכנית סיוע, וד"ר תרזה Brosenitsch לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (GM082251 & GM085043).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם L-גלוטמין | אטלנטה ביולוגית, בע"מ לורנסוויל, ג'ורג'יה | 12-604F | |
| פיברונקטין | סיגמה, סנט לואיס, מיזורי | F1141-1MG | תרבית תאי HeLa על רשתות EM |
| גשש תאים | Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה | C34552 | CMTPX אדום |
| מצומד | זהבטד פלה, בע"מ, רדינג, קליפורניה | 15822-1 | קוטר 15 ננומטר |
| 0.2 μ m מיקרוספירות פלואורסצנטיות | Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה | F8811 | פלואורסצנטי צהוב-ירוק |
| סרום בקר עגל עוברי מומת בחום | Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה | 15140-122 | |
| צלחת תרבית עם תחתית זכוכית | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| זהב quantifoil finder רשתות EM | Quantifoil Micro Tools, Jena, גרמניה | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-Discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| מיקרוסקופ אלקטרונים Tecnai Polara G2 עם אקדח פליטת שדה | FEI, הילסבורו, או | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, הילסבורו, או | ||
| אולימפוס IX 71 מיקרוסקופ | אולימפוס אמריקה בע"מ, סנטר ואלי, פנסילבניה | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (מרחק עבודה 2.7-4 מ"מ) עדשת אובייקטיבית | |
| Nikon TiE Nikon Instruments | , Melville, NY | באמצעות עדשת אובייקט טבילה בשמן 60X/1.35 NA | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי Sweptfield | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit תא סלולרי חי | טוקיו, יפן | ||
| שלב דגימה קריו-פלואורסצנטי | תוצרת | נבנה על ידי חנות מכונות, ראה התייחסות 15 לעיצוב. |
מקורות
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in h....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
