הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50396

⸱

18 ביוני 2013

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מפרט את הנהלים לניתוח הדמיה אופטי של nanoparticle גידול הממוקד, HerDox. בפרט, שימוש מפורט של מכשיר ההדמיה multimode לאיתור גידול מיקוד והערכת חדירת גידול מתואר כאן.

תקציר

Nanoparticle HER2 + גידול הממוקד, HerDox, מציג הצטברות גידול מועדפת ואבלציה גידול בצמיחה במודל חיה של סרטן HER2 +. HerDox נוצר על ידי הרכבה עצמית שאינם קוולנטיים של חלבון חדירת תאי גידול ממוקד עם סוכן כימותרפיה, דוקסורוביצין, באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. שילוב של electrophilic, עיבור, ואינטראקציות oligomerization להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים. HerDox מציג יציבות בדם, כמו גם באחסון ממושך בטמפרטורות שונות. משלוח מערכתי של HerDox בתוצאות נושאות גידולים בעכברים במוות תאי גידול ללא תופעות לוואי לגילוי לרקמה שאינה סרטנית, כוללים לב והכבד (שעובר נזק מסומן על ידי דוקסורוביצין לא ממוקד). HER2 גובה מאפשר מיקוד לתאים המבטא את הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס האנושי, ומכאן גידולים HER2 רמות גבוהות מוצגות תערוכת הצטברות גדולה יותר של HerDox לעומת ביטויי תאיםלשיר רמות נמוכות יותר, הן במבחנה ובחי. הדמיה עוצמת הקרינה בשילוב עם ניתוח ספקטרלי confocal ואתרו אפשרה לנו לאמת בגידול vivo מיקוד וחדירה של תאי גידול של HerDox לאחר משלוח מערכתי. כאן אנו פירוט השיטות להערכתנו גידול מיקוד באמצעות ההדמיה multimode לאחר משלוח מערכתי.

מבוא

גידול במיקוד של כימותרפיה יש את הפוטנציאל לחסל את התאים סרטניים במינון נמוך יותר בהשוואה לתרופות לא ממוקדות, כי יותר מהטיפול יכול לצבור נמסר ליעד, ולא להפיץ לרקמה שאינה סרטנית. ככל שהמצב זה האחרון הייתי לדלל את היעילות של התרופה ולכן דורש מינונים גבוהים יותר כדי להיות יעילים, מיקוד גידול יש שני יתרונות טיפוליים ובטיחות מעל טיפול שאינו ממוקד סטנדרטי.

מיקוד כימותרפיה ידי אנקפסולציה בחלקיקים עצמי התאספו מאפשר התרופה להישאר ללא שינוי כימי בניגוד לתרופות שמקושרות קוולנטית למולקולות מיקוד. כהצמדה כזו יש הפוטנציאל לשנות את הפעילות של שניהם בסמים ומיקוד המולקולה; הרכבה שאינה קוולנטיים מאפשרת עוצמה תרופה להישמר.

הראינו בעבר שהרומן של שלוש מרכיב, מורכב עצמי התאספו, HerDox, מטרות HER2 + גידולים In vivo ומעורר אבלציה גידול בצמיחה תוך חוסך רקמה נורמלית, כולל הלב 1. HerDox נוצר דרך אינטראקציות שאינן קוולנטיים בין חלבון קולט מחייב תא החדירה, HerPBK10, והסוכן כימותרפיות, דוקסורוביצין (DOX), באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. HerPBK10 נקשר לקולטן גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (שלה) ומעורר אנדוציטוזה קולטן בתיווך 2-4, תוך חדירת קרום endosomal נעשה באמצעות שילוב של אדנווירוס-נגזר פנטון בסיס חלבון capsid 4-6. תחום טעון חיובי בחלבון מאפשר לחומצת גרעין 4 מחייב, 5, שדרכו Dox-DNA intercalated יכול להיות מועבר למשלוח ממוקד. Electrophilic, עיבור, ואולי אינטראקציות oligomerization חלבון להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים כי הם יציבים בדם ומתחת לאחסון ממושך בטמפרטורות שונות 1. העדפת מיקוד אליה2 + תאים סרטניים הוא הקל על ידי זיקת יגנד המשופרת כאשר HER2 הוא גבוה.

המחקרים הקודמים שלנו הראו כי המשלוח מערכתי של הצטברות מועדפת HerDox תשואות בגידולים מעל הרקמה שאינה סרטנית ולא ממוקדים, בהשוואה ל1 Dox, וחדירה לתאי גידול in vivo 7. יש לנו ציינו שמשחרר HerDox Dox לאחר כניסת תא גידול, ומאפשר הצטברות Dox לתוך הגרעין 1. גידולים הצטברות מופיעה לתאם עם רמת הקולטן, כמו גידולים המבטאים-HER2 נמוכים יחסית לצבור פחות HerDox בהשוואה לאלו עם רמות גבוהות יותר יחסית 1 HER2. יתר על כן, ריכוז המוות של התאים היעיל מציג מתאם הפוך עם HER2 תצוגה בשורות תאים סרטניים המבטאות תא שטח שונה HER2 רמות 1. HerDox מפגין יתרון טיפולי ובטיחות מעל Dox לא ממוקד, לא כהריגת גידול מתרחשת במינון מעל 10 פעמים נמוכות יותר בהשוואה לuntarסמים וgeted מניב שום השפעה לרעה על גילוי לב (אקו וזוהה על ידי כתם היסטולוגית) או כבד (זוהה על ידי Tunel כתם) רקמה, בניגוד לDox לא ממוקד 1. למרות גזירתו מחלבון הקופסית נגיפית, HerPBK10 מפגין שום immunogenicity להבחין ברמות טיפוליות 2. ואילו נוגדנים קיימים מראש לכל אדנווירוס יכולים לזהות HerPBK10, הם לא הצליחו למנוע תא מחייב 2.

נפח גידול נמדד לאורך הזמן הוא שיטה סטנדרטית של הערכת יעילות טיפולית של תרופות ממוקדות, וכבר מועסק להערכת היעילות הטיפולית של HerDox. להשלים עם גישה זו in vivo ההדמיה עוצמת הקרינה vivo לשעבר אפשר לנו להעריך טוב יותר את יעילות מיקוד 7. יש לנו משולב באופן ספציפי בתחום ההדמיה confocal באתרו של גידולים ניכרים עם ניתוח ספקטרלי של Dox הקרינה כדי לוודא שאין HerDoxלא נצבר רק בגידולי in vivo אבל חדרו לתוך תאים סרטניים וDOX מועבר לתוך הציטופלסמה לבין הגרעין 7. ניתוח ספקטרלי כמו כן אפשר לנו להבחין בין הקרינה Dox מautofluorescence 7.

כאן אנו מדגימים בפירוט רב יותר את הגישה שלנו להערכת HerDox in vivo לאחר משלוח מערכתי, והכי חשוב, להערכת מיקוד באמצעות שיטות הדמיה multimode וניתוחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. משלוח מערכתי בvivo

  1. מערבבים מספיק HerDox עם תמיסת מלח סטרילית להשוות 0.2 מ"ל של מינון מ"ג / ק"ג 0.004 של HerDox לכל זריקה למשך 6-8 גידולים בשבוע ישנים נו / נו עכברי נושאים הבילטראליים תת עורי כנף עוקץ xenograft.
  2. לצייר בעדינות את תערובת HerDox לתוך מזרק אינסולין 3/10 סמ"ק המצויד במחט 29G, הימנעות בועות.
  3. הרדמה היא מושרה על ידי חשיפת isoflurane קצרה בחדר אינדוקציה מצויד בהדחת מערכת גז (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך יותר).
  4. הזרק את התערובת כולה לוריד הזנב של עכבר הרדים (0.2 מ"ל להזרקה). הזרקת IV יכולה גם להתבצע בעכבר מאופק, ללא הרדמה.
  5. חזור על זריקות באותו העכבר במשך שישה ימים רצופים נוספים, פעם ביום.

2. דימות פלואורסצנטי בvivo

ההצטברות של HerDox הקרינה בגידולים יכוליםלהתגלות על ידי ביום האחרון של זריקה (יום 7) באמצעות imager multimode. ההליכים המפורטים להלן כרוכים בשימוש במערכת המאקרו תאורה וזיהוי מותאמת אישית (איור 1) 8.

  1. הפעל Multimode בImager האופטי vivo.
  2. בחר פליטת bandpass מסנן (590 ננומטר ± 30 ננומטר) מתאימה לגילוי הקרינה דוקסורוביצין.
  3. הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר.
  4. הפעל את מערכת ההרדמה ולאחר מכן למקם את עכבר לתוך תא ההרדמה (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך) מצוידות במערכת הדחה גז.
  5. העבר את העכבר מחדר ההרדמה לחדר ההדמיה של Multimode בImager האופטי vivo כאשר העכבר הוא מורדם.
  6. הנח nosecone מעל האף של העכבר ולפתוח את הזרימה לנהל anesthe הרציףSIA במהלך רכישת תמונה (שיעורי זרימת חמצן: 0.5-1 ליטר / דקה, ריכוז isoflurane: 2-3% (או נמוכים יותר).
  7. לרכוש תמונות הקרינה באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות.
  8. ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד.

3. דימות פלואורסצנטי Ex vivo

ניתן הדמיה HerDox הקרינה בגידולים ואיברים ספציפיים (כולל כבד, כליות, טחול, לב, ושרירי שלד) נבצרו מעכברים מורדמים ב24 שעות לאחר ההזרקה (יום 7) הסופית של HerDox.

  1. הפעל Multimode בImager האופטי vivo.
  2. בחר פליטת bandpass מסנן (580 ננומטר ± 20 ננומטר) לגילוי הקרינה דוקסורוביצין.
  3. הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר.
  4. גידולי מקום ואיברים ספציפיים מסודרים על צלחת פטרי להדמיה הקאמרית OF Multimode בImager האופטי vivo.
  5. לרכוש תמונות הקרינה של רקמות באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות. דוגמה לרכישת תמונת הקרינה ראשונית שמוצגת באיור 2 א. חזור על אותו באמצעות צלחת פטרי ריקה, שישמש כרקע (איור 2b).
  6. ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד. דוגמה לתמונה תיקן מוצגת באיור 2 ג, וכתוצאה מחיסור של איור 2b מהאיור 2a.

4. בConfocal ההדמיה באתרו של גידולים

בהדמית confocal אתר מאפשר זיהוי וניתוח של הצטברות גידול HerDox ברמה התאית.

  1. הפעל מיקרוסקופ לייקה confocal SPE.
  2. בחר אור לייזר ננומטר 488 לעירור של אורכי גל דוקסורוביצין ופליטה (560-620 ננומטר) לדוקסורוביציןגילוי הקרינה.
  3. בחר אובייקטיבי 40X או 63X וטיפת שמן טבילה בעדשה האובייקטיבית.
  4. לחלץ גידולים טריים מעכברים שקיבלו בעבר מורדמים טיפולי HerDox ומדומים, כמתואר בהליך 2.
  5. גידולים מניחים על צלחת פטרי על קרח, כדי למנוע השפלה רקמות, ולאחר מכן להעביר את הגידולים לתא דלתא T להדמית confocal.
  6. לרכוש תמונות confocal של גידולים בעומקי מוקדים רציפים (גודל צעד: 1 מיקרומטר, עובי: 20 מיקרומטר). דוגמה של רצף תמונות-נרכשו לאורך ציר Z-מוצגת באיור 3, פנל שמאלי.
  7. בצע העצמה מקסימלית Z-הקרנה של תמונות. הקרנת העצמה המרבית של Z-מוערם תמונות מוצגת באיור 3, פנל ימני.
  8. חישוב מתכוון עוצמות הקרינה של העצמה מקסימלית Z - הקרנת תמונות. ממוצעת עוצמות הקרינה של תמונות מעל השדה הכללי של תצוגה היו לחשבד באמצעות ImageJ.

5. דימות ספקטרלי רציומטרי וניתוח

הדמיה רפאים רציומטרי וניתוח מאפשר אפליה בין Dox הקרינה וautofluorescence.

  1. כוח בסריקת לייזר מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי.
  2. תרכוש 15 תמונות של גידולי HerDox שטופלו ומטופל בעומק שצוין בטווח של 510-650 הרפאים ננומטר, עם גודל צעד של 10 ננומטר, ועירור ב 488 ננומטר אור באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SPE.
  3. הכן פתרון מיקרומטר 100 של דוקסורוביצין.
  4. לבצע הדמיה רפאים של פתרון דוקסורוביצין מיקרומטר 100 כדי להשיג את החתימה הספקטרלית הטהורה של Dox הקרינה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר). תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 4.
  5. לרכוש את החתימה הספקטרלית autofluorescence מג תמונהאופה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר) שהושגה על ידי הדמיה רפאים של גידולים שלא טופלו. תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 5.
  6. לייצר ארבע חתימות רפאים התייחסות (autofluorescence הטהור, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescence, 0.2. דוקסורוביצין 0.8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescence) באמצעות התכנית שפיתחנו 9. עקומה טיפוסית מראה ארבע חתימות רפאים התייחסות מוצגת באיור 6.
  7. לבצע סיווג ספקטרלי של תמונות כפי שהוגדר על ידי החתימה ספקטראלית התייחסות דרך למדוד מרחק אוקלידי באמצעות התכנית שפיתחנו בעבר 9.
  8. בצע unmixing רפאים ליניארית של דימויים אלה באמצעות תכנית רפאים unmixing (Plug-in בImageJ) פיתחנו 7, 10, לשם השוואה להדמית הרפאים ratiometric והניתוח. דוארxample של הפרדת הקרינה HerDox מautofluorescence ידי unmixing הרפאים יניארי מוצג באיור 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג את אב טיפוס בimager האופטי vivo, שנבנה לצורך רכישת תמונה תחת שיטות מרובות, כולל עוצמת הקרינה, רפאים, כל החיים, confocal 2 פוטונים, התוך חיוני, והדמיה פליטת אור. בנוסף, המצלמה מקוררת גבוהה רגישה וקווי לייזר בהספק גבוהים שולבו במערכת זו תשואות גבוהות יותר בהשוואה תמונות הקרינה בניגוד למערכות הדמיה אופטיות מסחריות 11, במיוחד עבור באיתור vivo של הקרינה דוקסורוביצין. לפיכך, מערכת זו הייתה קריטית לשימוש במחקר הנוכחי כדי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

DOX הקרינה ניתן להבחין בvivo באמצעות imager multimode כאשר גידולים תת עורית. עם זאת, המינון טיפולי היעיל של HerDox (0.004 מ"ג / ק"ג) הוא מתחת לסף הגילוי לאחר מנה אחת. לעומת זאת, לאחר 7 זריקות יומיות (1x/day למשך 7 ימים), הצטברות הגידול והשימור של החלקיקים מספיק כדי לאפשר הדמיה של הקרינה Dox.

זה קריטי כשעובדים עם Dox או כל fluorophore אחר בתחום ההדמיה vivo כי הוא השתמש בטכניקה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר, דניאל פרקש, הוא יו"ר של הדמיה מולקולרית ספקטרלי. יש החוקרים שנותרו ללא אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענקים לLKM-K מהמוסד הלאומי לבריאות / מכון הלאומי לסרטן (R01CA129822 וR01CA140995). ד"ר מדינה-Kauwe מודה ג ריי, מ 'M-Kauwe וד Revetto להמשך תמיכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר פלואורסצנטיLeicaSPE
em>In Vivo הדמיה אופטיתהדמיה מולקולרית ספקטרליתמולטימוד In Vivo הדמיה
Doxorubicin-HClSigma-AldrichD4035
עכבר עירום (NU/NU), נקבה, 6-8 שבועותקוד זן נהר צ'ארלס088
MDA-MB-435 תאי גידול HER2+ אנושייםNCI-Frederick Cancer DCTD מאגר גידול/קו תאים0507292
מזרק אינסולין 3/10 סמ"ק U-100 עם מחט 29G x 1/2 אינץ' Ultra-FineIV מחוברת לצמיתותBD309301
תא Delta T Bioptechs04200417B
<אופטית

מקורות

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. , Oxford University Press. New York. (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418(2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Vivo
ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.