Method Article

Pyrosequencing לזיהוי ואפיון חיידקים

DOI:

10.3791/50405

⸱

August 22nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biotechnology Education, Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 2Qiagen Sciences, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pyrosequencing הוא טכניקה תכליתית המאפשרת רצף הגנום של חיידקים שיכולים לשמש לזיהוי מיני חיידקים, להפלות זני חיידקים, וכדי לזהות מוטציות גנטיות המעניקות עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאלי. בסרטון הזה, ההליך לייצור חיידקי amplicon, pyrosequencing amplicon, וניתוח רצף ה-DNA יהיה הפגין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pyrosequencing הוא טכניקה תכליתית המאפשרת רצף הגנום של חיידקים שיכולים לשמש לזיהוי מיני חיידקים, להפלות זני חיידקים ולזהות מוטציות גנטיות המעניקות עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאלי. היתרונות של pyrosequencing עבור יישומי מיקרוביולוגיה כוללים הקרנת תפוקה גבוהה מהירה ואמינה וזיהוי מדויק של חיידקים ומוטציות הגנום של חיידקים. Pyrosequencing כרוך רצף של ה-DNA על ידי סינתזה הגדיל המשלים בסיס אחד בכל פעם, תוך קביעת ההוויה של נוקלאוטיד הספציפי שהוכללה בתגובת הסינתזה. התגובה מתרחשת ב-DNA שבו ארבעה deoxyribonucleotides (dNTP) מתווספים ברצף ואת dNTPs מאוגדים הוא enzymatically מושפל לפני תוספת של dNTP הבא לתגובת סינתזת תבנית גדילים הבודד משותק. זיהוי של הבסיס הספציפי שולב בתבנית מנוטר על ידי דור של chemilumאותות inescent. סדר dNTPs המייצרים את אותות chemiluminescent קובע את רצף ה-DNA של התבנית. יכולת רצף זמן אמת של טכנולוגית pyrosequencing מאפשרת זיהוי חיידקים מהיר בassay אחד. בנוסף, מכשיר pyrosequencing, יכול לנתח את הגיוון הגנטי המלא של עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאליים, לרבות הקלדה של SNPs, מוטציות נקודתיות, הוספות ומחיקות, כמו גם כימות עותקי גן מרובים שעלולים להתרחש בהתנגדות מסוימת אנטי מיקרוביאליים דפוסים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pyrosequencing הוא שיטה מהירה ומדויקת לרצף חומצות גרעין המבוססת על העיקרון של "רצף בסינתזה". "סידור בסינתזה" כרוך בשימוש בתבנית ה-DNA גדיל בודדת לסנתז בסיס אחד הגדיל המשלים בכל פעם, וגילוי הבסיס המשולב (A, T, G, או C) בכל שלב על ידי זיהוי של אות chemiluminescent. תגובת pyrosequencing כוללת תבנית ה-DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), פולימראז ה-DNA, ה-ATP sulfurylase, luciferin, לוציפראז, וapyrase. תגובת הסינתזה היא שיזמה תוספת של אחד מארבעת dNTPs ופולימראז ה-DNA ל-DNA תבנית biotinylated גדילים הבודד. פולימראז ה-DNA משלב dNTP משלים על גבי תבנית, עם שחרורו הבא של pyrophosphate (איור 1). ה-ATP sulfurylase היחסי ממיר pyrophosphate ל-ATP. ATP משמש כזרז להמרת לוציפראז בתיווך של luciferin לoxyluciferin, אשריוצר אור (איור 2). עוצמת האור היא פרופורציונלית למספר המשולבים של נוקלאוטידים וקובעת אם של dNTP הספציפי אחד או יותר (dATP, dTTP, dGTP, או dCTP) נמצא על גדיל התבנית ברצף (איור 3). כל dNTP מאוגד הוא מושפל על ידי apyrase לפני תוספת של dNTP הבא להמשך תגובת הסינתזה. תגובה זו "רצף בסינתזה" חוזרת על עצמו עם תוספת של כל אחד מארבעת עד dNTPs רצף ה-DNA של תבנית ה-DNA גדילים הבודד נקבע.

לצפייה באנימציה של תגובת pyrosequencing לחץ כאן לצפייה בסרט.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבוא: מושבה חיידקים בודדת צריכה לשמש כדי לחסן מרק התרבות מתאים, המודגרות לילה. גלולה חיידקי מעובד מכן לטהר את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הגנומי זמינה מסחרי. הדנ"א הגנומי מטוהר צריך להיות 260/280 (ננומטר) יחס> 1.8 להבטיח כי המדגם הוא ללא זיהום חלבון. כמות ה-DNA גנומי הנדרש לדור של תבנית pyrosequencing היא 10-20 ng.

ההגברה א 'של התבנית

(PCR PyroMark Handbook; www.qiagen.com / ספרי הדרכה 1)

הגדרת תגובת PCR

הערה: פריימר אחד חייב להיות biotinylated בקצה 5 שלה ', וזה המליץ ​​לו להיות HPLC מטוהר להכנת תבנית. אנו ממליצים PyroMark Assay עיצוב תוכנת 2.0 לPCR וseעיצוב פריימר הגנום שמותאמים לרצפים קצרים לקרוא, לעומת זאת, פריימר-תפציץ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) מצמח השדה יכול גם לשמש לעיצוב פריימר.

  1. הפשירי את כל פתרונות הנדרשים (המופיע בטבלה 1) ומערבבים ביסודיות כל אחד. להגדיר את התגובה לפי טבלת 1. כל העבודה ניתן לעשות בטמפרטורת חדר.

הערה: מיקס מאסטר PCR מכיל MgCl 2 לריכוז סופי של 1.5 מ"מ, המספק תוצאות משביעות רצון ברוב המקרים. אם נדרש + ריכוז גבוה Mg 2, μl עד 3.5 של 25 מ"מ MgCl 2 ניתן להוסיף תגובה.

  1. לערבב היטב את תערובת התגובה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה, ואז לוותר על כמויות מתאימות לתוך צינורות PCR.
  2. הוסף templatה-DNA דואר לכל צינור PCR. אנו ממליצים 10 ng של הדנ"א הגנומי.
  3. לתכנת את Cycler התרמית לפי טבלה 2. אחיזה סופית ב 4 ° C מומלץ לנוחות. אם אתם משתמשים בCycler תרמית ללא מכסה מחומם, תגובות שכבה עם 100 שמן מינרלי μl.
  4. מניחים את צינורות PCR בCycler ולהפעיל את תכנית רכיבה על אופניים.

ב 'אבק Workstation פרוטוקול

לשתק את מוצרי ה-PCR biotinylated

  1. הפוך את תערובת אמן על פי איור 4.

הערה: לפני pipetting, בעדינות לנער את הבקבוק של חרוזים Sepharose streptavidin מצופים כדי להבטיח השעיה הומוגנית.

  1. בהתאם לכמות של המוצר ה-PCR בשימוש, לוותר 60-75 תערובת אמן μl לבאר כל צלחת PCR לתת נפח כולל של 80 μl בכל טוב.
  2. הוסף 5-20 מוצר PCR biotinylated μl היטב כל אחד.
  3. לאטום את הבארות עם הרצועה caנ.ב. ולהתסיס את צלחת ה-PCR ב1,400 סל"ד למשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר (15-25 ° C) באמצעות ייקר מסלולית.

Denaturation של ה-DNA ותוספת של רצף פריימר

  1. לדלל את פריימרים רצף עד 0.3 מיקרומטר עם חישול חיץ ולוותר על 25 μl לבאר כל צלחת תגובה. מקם את הצלחת על תחנת העבודה.
  2. מלא את שקתות תחנת העבודה על פי תרשים איור 5.
  3. הפעל את משאבת הוואקום, וודא שהמתג על כלי הוואקום מוגדר ב( איור 6). לשטוף את בדיקות סינון מים עם טוהר גבוה (מילי-Q 18.2 ס"מ X MW או שווה ערך) בשוקת 5 (איור 5). למלא את השוקת במי טוהר גבוה טריים לשימוש בשלב 12.
  4. עבודה במהירות, למקם את צלחת PCR עם חרוזים על תחנת העבודה. ודא ששתי הצלחות הן באותו הכיוון כמו בעת הדגימות הועמסו.
  5. עם בורר ואקום ON, להנמיך את הוואקוםכלי לתוך הבארות של צלחת PCR עבור 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated. את החרוזים יהיו שנתפס על ידי כלי הוואקום (איור 7).
  6. עם הוואקום עדיין, שטוף את הכלי עם אתנול 70% (שוקת 1) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated.
  7. עם ואקום ON, לשטוף את הכלי עם פתרון denaturation (שוקת 2) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated.

הערה: פתרון Denaturation מכיל סודיום הידרוקסיד, שהוא העין וגירוי עור. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, ומשקפי מגן.

  1. עם ואקום ON, לשטוף כלים עם חיץ לשטוף (שוקת 3) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated.
  2. עם ואקום ON, להעלות את כלי הוואקום למעבר ל -90 מעלות אנכיים למשך 5 שניות, כדי לאפשר את כל הנוזל לניקוז מחוץ לכלי הריק. הפעל את משאבת כיבוי, וליישר את כלי הוואקום עם צלחת התגובה. מנמיכים את הכלי לתוך הוואקוםבארות ובעדינות לנער מצד לצד כדי לשחרר את החרוזים לפריימר הרצף המכיל הבארות.
  3. על מנת לנקות את כלי הוואקום, להתסיס את בדיקות סינון מים בטוהר גבוה (שוקת 4) עבור 10 שניות.
  4. לעבור על הוואקום ולשטוף את הכלי עם מים טוהר גבוה (שוקת 5) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated.
  5. הרם את כלי הוואקום למעבר 90 מעלות צלזיוס אנכית למשך 5 שניות, ולאחר מכן לעבור את ואקום OFF ולאחסן במצב "חניה".

חישול פריימר רצף לגדילי דנ"א

  1. מניחים את הצלחת בתגובת בעל צלחת מחוממת מראש.
  2. מחממים את הצלחת על בלוק חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  3. הסר את הצלחת מהמחזיק והמקום על השיש להתקרר בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.

מבצע Q24 Pyromark

הערה: הפעל את המכשיר באמצעות מתג ההפעלה ממוקמת מעל כבל החשמל. כוכבאיל יכול לקחת עד דקות 1.

  1. מלא מחסנית על פי ההוראות הניתנות בPyroMark זהב Q24 ריאגנטים Handbook 2. כדי לקבוע כמויות הדרושות, להגדיר קובץ להפעיל את התוכנה במכשיר, ותחת תפריט כלים בחר מידע הפעלה קדם
  2. אם המכשיר היה כבר ב, ודא שהוא אינו מבצע ריצה ולאחר מכן פתח את המכסה. אות אזהרה נשמעת תהיה נפלטת אם המכסה נפתח כאשר הוא אינו בטוח בכך.
  3. לפתוח את השער ולהכניס את מחסנית דיו עם התווית פונה קדימה (איור 8). ודא שהמחסנית הוכנסה כראוי (קו צריך להיות גלוי בחזית) וסוגר את השער.
  4. פתח את מסגרת צלחת האחזקה ולמקם את הצלחת עם דגימות בתוך המכשיר.
  5. סגור את מסגרת צלחת האחזקה ומכסה המכשיר (איור 9).

החל לרוץ

  1. הכנס את מקל USB עם קובץ הריצהים שנוצר עם תוכנת המכשיר ליציאת ה-USB בחלק הקדמי של המכשיר.
  2. בחר באפשרות "הפעלה" בתפריט הראשי ולחץ על "אישור".
  3. השתמש בחיצי הגלילה כדי לבחור את הקובץ הרצוי ולחץ על הריצה "בחר".

הערה: המכשיר יתחיל מחלק חומרים כימיים כאשר כל הלחץ שנקבע מראש ורמות הטמפרטורה הם הגיעו (זה עלול לקחת כמה דקות). במהלך ריצה, המכשיר מציג מסך pyrogram של נבחר היטב בזמן אמת. השתמש בחיצי הגלילה כדי להציג pyrogram של בארות אחרות.

השלמת ריצה

  1. כאשר המכשיר מאשר שהוא סיים לרוץ ולרוץ הקובץ נשמר למקל USB, לחץ על "סגור".
  2. הסר את מקל USB. אם הוא הוסר לפני הריצה סיימה, הכנס את מקל USB. בחר באפשרות "מנהל" ולאחר מכן "פועל שלא נשמרו עותק".
  3. הקובץ לרוץ עכשיו ניתן לפתוח ונותח באמצעות תוכנת המכשיר והשוואהלספרייה של חיידקים ידועים באמצעות תוכנת Identifire.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את התוצאות של ריצת pyrosequencing טיפוסית באמצעות התוכנה מציגה את המיקום של primers קדימה הפוך משמש לייצור amplicon, ופריימר רצף משמש לתגובת pyrosequencing בתוך רצף ריבוזומלי 16S משומר (איור 10). רצף hypervariable בין פריימר אתרים מאפשר לזיהוי חיידקים של מספר גדול של מיני חיידקים באמצעות פריימר רצף המשומר (5'-TACATGCAAGTCGA). כבקרת איכות פנימית, סוגר רצף ה-DNA ניתן לבדוק את האזור משתנה כדי להבטיח שאזור ה-DNA הנכון כבר ניתחו . תוכנת pyrosequencing מאפשרת השוואה ויישור של רצף שנוצר למסד הנתונים של רצפים ריבוזומלי חיידקים לזיהוי חיידקים פנימיים. בנוסף, ניתן לנתח רצף כדי לקבוע מוטציות המקנים עמידים לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, ניתוח של מוטציות בגנים ריבוזומלי 23S של Helicobפילורי קבצים הבא מדגים שני דפוסי מוטציה (GAA או AGA) המקנים עמידים לאנטיביוטיקה (איור 11). ניתוח מבודד מרובים מאותה המטופל יכול להיות assayed במקביל למעקב אחר הופעתה של עמידות לתרופות לאורך זמן כדי לסייע בחקירות אפידמיולוגיים של התפרצויות סמים התנגדות חיידקים.

תרשים תהליך PCR; פריימרים ביוטיניליים, אנזים פולימראז, תגובת סינתזת DNA.
איור 1. מוצר PCR biotinylated משמש כתבנית לשלב dNTPs ידי פולימראז ה-DNA, שהוביל לדור של pyrophosphate (PPI).

דיאגרמת תהליך Pyrosequencing; כולל ATP, לוציפראז, פליטת אור וניתוח עקבות פירוגרמה.
איור 2. ה-ATP sulfurylase יחסי ממיר pyrophosphate לATP. מעשי ATP כזרז להמרת לוציפראז בתיווך של luciferin לoxyluciferin, שיוצרת אור שהוא פרו portional לסכום של ה-ATP. האור נרשם כשיא על עקבות pyrogram ומצביע על שילוב נוקלאוטיד. את dNTPs מאוגדים הם מושפל על ידי apyrase לפני dNTP הבא מתווסף להמשכו של הסינתזה.

כרומטוגרמה של רצף DNA, פסגות מצביעות על זוגות בסיסי נוקלאוטידים, תרשים לניתוח גנטי.
איור 3. עוצמת האור שנוצר מציינת אם של dNTP הספציפי אחד או יותר (dATP, dTTP, dGTP, או dCTP) התאגד על גדיל התבנית ברצף.

הכנת תערובת מאסטר PCR: תרשים המציג דגימה, חיץ, מים, חרוזים לקיבוע DNA.
איור 4. תרשים זרימה להכנת מיקס מאסטר כדי לשתק את המוצר ה-PCR biotinylated.

דיאגרמת הגדרת PCR עם PyroMark Q24, נפחי ריאגנטים, דנטורציה, אתנול ומים.

GE = "תמיד"> איור 5. PyroMark תחנת עבודה, עם PCR צלחת, PyroMark צלחת, ובמקומות שוקת.

מערכת כרומטוגרפיה, תקריב של מתג סיבובי על ספק כוח, המשמש בהפרדה אנליטית.
איור 6. מיקומים של מתג אבק וכיבוי העמדות.

מחזיק פיפטה בתנאי מעבדה לטיפול מדויק בנוזלים בהליכים ניסיוניים.
איור 7. כלי ואקום. טיפול נכון של הכלי הריק.

הגדרת תחנת עבודה PCR, ניתוח רצף DNA; מערכת תפוקה גבוהה; צלחת דגימה במיקום.
איור 8. מחסנית שער נפתח עם מחסנית במקום.

תחנת עבודה PCR בעלת תפוקה גבוהה, שיטת הגברת DNA, המציגה לוחית דגימה בהתקנה אוטומטית.
איור 9. המחסנית הוכנסה כראוי עם השער סגור.

"עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> דיאגרמת ריצוף DNA; מציג פריימרים PCR קדימה/אחורה ויישור פריימר רצף.
איור 10. Pyrosequencing תוצאות זיהוי חיידקים מבוססות. Primers PCR מיועד לאזורים נשמרים של תבנית ה-DNA, ופריימר רצף ממוקם מייד במעלה הזרם של רצף ה-DNA היטב מאופיין זיהוי hypervariable בתוך amplicon (מוצג בכחול).

דיאגרמת מוטציות בגן 23S rRNA; אלקטרופרוגרמות מראות סמני עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים.
איור 11. זיהוי של עמידות לתרופות אנטיביוטיות בליקובקטר פילורי באמצעות pyrosequencing. ניתוח של מוטציות בגנים המקנים 23S התנגדות אנטיבקטריאלי בליקובקטר פילורי המכיל GAA או רצפי AGA. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

רכיב נפח לכל תגובה ריכוז סופי
Pyro PCR מיקס מאסטר, 2x 12.5 μl 1x
תתרכז CoralLoad, 10x 2.5 μl 1x
25 מ"מ MgCl 2 (אופציונלי) משתנה ≥ 1.5 מ"מ
Q-פתרון, 5x (אופציונלי) 5 μl 1x
פריימר / פריימר B משתנה / משתנה 0.2 מיקרומטר μM/0.2
מים RNase ללא משתנה -
סה"כ נפח (לאחר הוספת התבנית ה-DNA) 25 μl

טבלת מס '1. תערובת תגובת PCR.

& Nbsp; הערות נוספות
שלב הפעלה ראשוני PCR 15 דקות 95 מעלות צלזיוס פולימראז ה-DNA HotStartTaq מופעל
רכיבה על אופניים שלב 3: Denaturation 30 שניות 94 מעלות צלזיוס
רכוך 30 שניות 60 מעלות צלזיוס
56 מעלות צלזיוס 		להדנ"א הגנומי
לדנ"א יומר bisulfite
הארכה 30 שניות 72 מעלות צלזיוס
מספר המחזורים 45
סיומת סופית 10 דקות 72 מעלות צלזיוס

טבלת 2. מפרט מחזור PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר שיטות רצף של הדור הבא חדשות כבר ממוסחרים. שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר הם רצפי יונים מוליכים למחצה, רצף זמן אמת מולקולה בודד, ורצף בסינתזה (SBS). 3-11 כל אחת משיטות אלו תלויה ברצף בסינתזה אבל להעסיק פלטפורמות חדשניות לזיהוי של נוקלאוטידים Incorporated. ביונים מוליכים למחצה רצף, גדיל בודד של ה-DNA משמש כתבנית לגדיל רצף. פולימראז 12 ונוקלאוטידים מתווספים ברצף כמו בpyrosequencing. כאשר מתווסף לנוקלאוטיד גדיל DNA הולך וגדל, יון מימן הוא שוחרר. יון המימן הוא זוהה על ידי חיישן מבוסס טרנזיסטור אפקט שדה.

רצף זמן אמת יחיד מולקולה תלויה במדריך גל מצב אפס (ZMW). 13 ZMW הוא מבנה קטן שבו מולקולה אחת פולימראז מחוברת לתחתית הבאר. הוא מואר באופן כזה שפלורניתן לאתר מולקולת ריח. כל נוקלאוטיד מתויג עם מולקולת ניאון. כנוקלאוטיד מתויג fluorescently משולב, גלאי מזהה נוקלאוטיד. כאשר נוקלאוטיד הבא הוא הוסיף, מולקולת הניאון הוא ביקע. 14

רצף בסינתזה (SBS) משתמש בשיטה ייחודית כדי להגביר את ה-DNA היעד כך שהאשכולות של רצפים ייחודיים נוצרים. -15 תבניות התקועות יחיד נוצרים ולאחר מכן הגדיל המשלים הוא מסונתז. כל נוקלאוטיד מסומן עם מולקולת ניאון ולאחר כל הוספת בסיס הקרינה של הבסיס הוסיף נרשמת.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייצור והגישה חופשי למאמר זה הוא בחסות Qiagen.
המחברים אחמד, Durocher, יסן וורדי הם עובדי Qiagen בע"מ שמייצר ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה היה תמיכה בחלקו על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, משרד למכללה דרך שער מדעי היוזמה וQiagen בע"מ

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PyroMark PCR Master Mix, 2xQiagen978703
תרכיז CoralLoad, 10xQiagen978703, 978705
Q-Solution, 5xQiagen978703, 978705
MgCl2, 25 מ"מQiagen978703, 978705
Qiagen129112ללא RNase
Qiagen978776 או 978777Primers מיצרן אוליגונוקלאוטידים מבוסס (כלומר QIAGEN Pyromark Custom Astests, IDT וכו'). יש להמיס פריימרים ליופיליים ב-TE כדי לספק תמיסת מלאי של 100 μM.
Pyromark Gold Q24 ריאגנטיםQiagen970802
מים בטוהר גבוה (Milli-Q 18.2 MΩ x ס"מ או שווה ערך)
סטרפטווידין ספרוז חרוזים בעלי ביצועים גבוהיםGE Healthcare17-5113-07
PyroMark חישול מאגרQiagen979009
PyroMark Denaturation SolutionQiagen979007
PyroMark Wash BufferQiagen979008
PyroMark Q24Qiagen9001514
PyroMark Q24 מחסניתQiagen979202
PyroMark Q96 HS קופסת מחזיק קצהQiagen979105
PyroMark Q24 תחנת עבודה ואקוםQiagen9001516
PyroMark Q24 מחזיק צלחתQiagen
שייקר אורביטליפישר11-675-297
בלוק חוםפישר11-718Q
פריימרים יש לרכוש 9022273

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. PyroMark PCR Handbook. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).">PyroMark PCR Handbook. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).
  2. PyroMark Q24 User Manual. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).">PyroMark Q24 User Manual. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).
  3. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).">Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
  4. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).">Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
  5. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).">Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
  6. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120(2007).">Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120(2007).
  7. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).">Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
  8. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).">J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
  9. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).">Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
  10. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).">Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
  11. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630(2008).">King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630(2008).
  12. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).">Rothberg, J. W., Heinz,, et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
  13. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).">Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
  14. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).">Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
  15. http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).">Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PyrosequencingMicrobial IdentificationBacterial Species16S Ribosomal DNAPolymerase Chain ReactionBiotinylated PrimerStreptavidin BeadsDNA SequencingChemiluminescent SignalAntimicrobial Resistance

Related Articles