מאמר שיטה

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

19.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50436

⸱

13 ביולי 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.

תקציר

כדי לחקור את האינטראקציה שומנים החלבון באופן מצמצם, יש צורך לשלב את החלבונים בממברנה לקרומים של הרכב שומנים מוגדר היטב. אנו לומדים את השפעות gating שומנים בדם תלויות באשלגן ערוץ מתח מגודרת אב טיפוס (KV), ועבדנו את נהלים מפורטים כדי לשקם את הערוצים למערכות שונות בממברנה. הליכי הכינון מחדש שלנו לקחת שיקול של שניהם היתוך המושרה בחומרי ניקוי משלפוחית ​​והאיחוי של מיצלות חלבון / חומר ניקוי עם מיצלות מעורבת שומנים / חומר ניקוי, כמו גם את החשיבות של להגיע לחלוקת שיווי משקל של שומנים בין החלבון / חומר הניקוי / שומנים וחומרי הניקוי מיצלות מעורבת / שומנים בדם. הנתונים שלנו הציעו שההכנסה של הערוצים בשלפוחית ​​השומנים היא אקראית יחסית באורינטציות, ואת יעילות הכינון מחדש היא כל כך גבוהה שאין אגרגטים חלבון גילוי נראו בניסויים חלוקים. יש לנו מנוצלים מחדשערוצי D כדי לקבוע את מצבי קונפורמציה של הערוצים בשומנים שונים, להקליט את הפעילות חשמלית של מספר קטן של ערוצים ששולבו בbilayers שומנים מישוריים, מסך לligands קונפורמציה ספציפי מהפאג-מוצגת ספריית פפטיד, ולתמוך בצמיחה של גבישי 2D מהערוצים בקרום. הכינון מחדש את הנהלים שתוארו כאן עשויים להיות מותאמים ללימוד חלבוני קרום אחרים בbilayers שומנים, במיוחד עבור החקירה של השפעות השומנים על תעלות היונים מתח מגודרת אוקריוטים.

מבוא

חומרי חליפין תאים ומידע עם הסביבה שלהם באמצעות הפונקציות של חלבונים בממברנה ספציפיים 1. חלבוני קרום בקרום תא מתפקדים כמשאבות, תעלות, קולטנים, אנזימים, intramembrane linkers ותומכים מבניים על פני ממברנות. מוטציות המשפיעות על החלבונים בממברנה היו קשורות למחלות בבני אדם רבים. למעשה, חלבונים בממברנה רבים כבר את מטרות התרופה העיקריות כי הם חשובים ונגישים בקלות בקרום תא. לכן זה מאוד חשוב להבין את המבנה והתפקוד של חלבונים בממברנה שונים בקרום, ולהפוך אותו אפשר להמציא שיטות חדשות כדי להקל על ההשפעות מזיקות מהחלבונים שעברו מוטציה במחלות אנושיות.

שומנים להקיף ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ביטוי וטיהור של KvAP ערוץ (איור 1)

  1. עבודה הכנה - יום 0
    1. שוטפים את צלוחיות הזכוכית לתרבות חיידקים במי deionized (diH 2 O) וMilliQ H 2 O (MQH 2 O) כדי להסיר עקבות של חומרי ניקוי משטיפת כלים כלליות.
    2. בינוני חיטוי 1,000 מ"ל LB ב2.8 ליטר Erlenmeyer צלוחיות (כוללת של שני ליטר תרבות כדוגמה כאן). קשיחות נמוכה של המים נמצא להיות חשוב לתרבות המוצלחת של החיידקים מותמרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרימה הכללית של הניסויים לטיהור ערוץ KvAP להומוגניות ביוכימי מתוארת באיור 1 א. דוגמאות טיפוסיות במהלך הביטוי והטיהור של החלבון הראתה בג'ל-SDS באיור 1. החלבון לאחר טיהור iMac הוא טהור יחסית. התשואה של ערוץ KvAP היא מ"ג על 1.0 / תרבות ליטר.

Solubilization של שלפוחית ​​שומנים עם חומרי ניקוי צריך להיות עבד לכל זוג של שומנים בדם לעומת חומר ניקוי. Solubilization של שלפוחית ​​.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכינון מחדש של ערוצי KvAP לתוך ממברנות שונות כבר בשימוש בכמה מחקרים 8-10. בעקבות הרעיון של הבטחת ההפצה של שומנים בין חומרי ניקוי / שומנים מיצלות המעורבות ואת micelles מעורב החלבון / חומר ניקוי / שומנים בדם, אנו מסוגלים להגיע לכינון מחדש של KvAP כמעט מלא לממברנות עשויות משומנים שונים מאוד. כל ערוץ KvAP tetrameric צריך ~ 100 מולקולות שומנים כדי לכסות תחום שלו הטרנסממברני באופן מלא. התנאים ההכרחיים הוא לאפשר למולקולות שומנים מספיק כדי למזג לתוך מיצלות חלבון / שומנים / חומר.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחקרים על KvAP במעבדה ג'יאנג קיבלו עזרה משמעותית ממעבדתו של ד"ר רודריק מקינון באוניברסיטת רוקפלר. תודה מיוחדת לד"ר בראון ומייקל Kathlynn McQuire לעצתם ולעזור בניסויי הפאג המסך שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH (GM088745 וGM093271 כדי ש-XJ) וAHA (12IRG9400019 כדי ש-XJ).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
TryptoneRPI Corp.T60060
תמצית שמריםRPI Corp.Y20020
NaClFisherS271-3
Tris BaseRPI Corp.T60040
אשלגן כלוריפישרBP366-500
n-Dodecyl-β-D-MaltosideAffymetrixD322Sסול דרגה
n-אוקטיל-β-D-גלוקוזיד AffymetrixO311
AprotininRPI Corp.A20550-0.05
לופפטיןRPI Corp.L22035-0.025
פפסטאטין ARPI Corp.P30100-0.025
PMSFSIGMAP7626
Dnase IRoche13407000
Bio-Bead SM-2Bio-Rad152-3920
HEPESRPI Corp.H75030
POPEאוונטי שומנים קוטביים850757C
POPGאוונטי שומנים קוטביים840457C
כלביםאוונטי קוטביים ליפידים870314C
DMPC אוונטי ליפידים קוטביים850345C
ביוטין-DOPE אוונטי שומנים קוטביים870282C
DOTAPאוונטי ליפידים קוטביים890890C
NeutrAvidin agarose חרוזים Piercenet29200
צינורות דיאליזהספקטרום מעבדות, Inc132-570
PentaneFisherR399-1
DecaneTCI AmericaD0011
MTS-PEG5000טורונטו מחקר CemicalsM266501

מקורות

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203(2005).
  3. Lee, A. G.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Kv

מאמרים קשורים