אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה הפכה לכלי רב עוצמה בחקר תהליכים ביולוגיים רבים ברמת התא בודד. בפרט, סרטים המתארים את התלות הזמנית של ביטוי גנים לספק תובנות לגבי הדינמיקה של הרגולציה שלה, עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים לקבלת וניתוח של סרטי הקרינה של תאים בודדים. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי כדי להפיק נתונים כאלה, וממשק מבוסס MATLAB, משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה לכמת את תמונות הקרינה. מגזרי התוכנה ותאי מסלולים, מאפשרים למשתמש לאצור חזותי טעויות בנתונים, ומקצים באופן אוטומטי שושלת וזמני החלוקה. GUI נוסף מנתח את סדרת הזמן לייצר כל עקבות סלולריים, כמו גם נגזרות בפעם הראשונה והשנייה שלהם. בעוד התוכנה תוכננה עבור ס cerevisiae, מודולריות והרבגוניות שלו צריכה לאפשר לו לאo לשמש כפלטפורמה ללימוד סוגי תאים אחרים עם כמה שינויים.
מבוא
ניתוח תא בודד של ביטוי גנים שקדם את ההבנה של היבטים רבים של ויסות הגנים שלנו. תמונות סטטיות של ביטוי ניאון כתב באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופיה לספק מידע שימושי על חלוקת ביטוי תא בודד, אבל חסרה את ההיסטוריה והאבולוציה של נתוני סדרת זמן הנדרשים כדי להודיע ישירות דינמיקת ביטוי גנים. מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה מציגה אמצעים כדי להשיג את שני מדידות תא בודדות ואת ההיסטוריה שלהם. ניסיוני בטכניקות ואנליטיות שונות פותחו כדי להשיג ולכמת סרטים של ביטוי ניאון כתב, ובכך הקניית תובנות תכונות ויסות הגנים (ראה 1 לביקורת), כגון תא אל תא וריאציה 2,3, היווצרות חיידקי persister 4, שעתוק ייזום והתארכות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. השג סרטים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי שמרים יחיד הגוברים בלשכת Microfluidic
- לחסן 1 תקשורת SC מ"ל (תקשורת מוגדרת סינטטי עם גלוקוז 2% ומשלים של חומצות אמינו מלא) עם תאים מצלחת גדלה טרי, דגירה תרבות הלילה ~ 16 שעות על תוף גלגלת ב 30 ° C. הכן את התרבות כזו שOD 600nm הסופי הוא ~ 0.1 לצמיחת יומן בשלב מוקדם.
- לדלל את תרבות המתנע לפי צורך וצמיחה המחודש של 1 מ"ל במבחנה טרי 6-8 שעות נוספות לOD 600nm = 0.1. זה מספק תאים גדלים במצב יציב תזונתי עשיר בצפיפות מתאימה לטעינה למכשיר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניסוי בוצע בהצלחה וניתח יניבו סדרת זמן מתמשכת בעיקר לתאים שלמים יחידים עם הופעת ניצן שהוקצה מציאותי ופעמי חטיבה. כדוגמה, ביצענו פרוטוקול לעיל עם זן שמרי הפלואידים להביע עותק משולב של חלבון פלואורסצנטי Cerulean (CFP) מונע על ידי האמרגן המכונן ADH1 כדי לבחון כיצד צמיחה וביטוי העולמי עשויות להשתנות לאורך זמן בתאים בודדים (לוח 4, Y47 ). רצנו ניתוח סדרת הזמן לקבל תא כולו (איור 7 א) מדידות לאורך זמן, ותלות במחזור התא עולה לנפח וגם ביטו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה פשוטה לקבל ולנתח את נתוני סדרת זמן הקרינה עם ניסיון מוגבל במיקרופלואידיקה או בפיתוח תוכנה. זה מאפשר לאדם להשיג סרטי הקרינה זמן לשגות של תאי שמרים בודדים; לחלץ גודל תא רלוונטי ומדידות ביטוי; מעקב כומר ומטלות שושלת, ולנתח את ההתנהגות של תאים שלמים לאורך זמן באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי ומשתמש גרפי תכליתי ממשק (GUI). בעוד ניסיוני, פילוח, ומעקב אחר צעדים כבר פנו בדרכים שונות בעבר 11,13,14, ההליך הנ"ל נועד להפוך את הטכניקות הללו ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים לאמילי ג'קסון, יהושע זיידמן, וניקולס רן להערות על התוכנה. עבודה זו מומנה על ידי GM95733 (לNM), 103,316 BBBE וקרנות הזנק (MIT לNM).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Y04C צלחת זלוף שמרים | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX פלטפורמת זלוף מיקרופלואידית | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 מיקרוסקופ | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 שמן DIC אובייקט | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| אשד II EMCCD מצלמה | פוטומטרית | ||
| מנורת קשת מתכת-הליד לומן 200 | PRIOR מדעי | ||
| קוביית מסנן דיכרואית משולשת וסט מסנני עירור ופליטה | Chroma Technology Corp | #89006 | משמש עבור YFP (Venus / Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry / tdTomato) |
| בקר MAC 5000 וגלגלי מסנן | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | גירסת 64 סיביות מטפלת בקבצי נתונים גדולים בצורה טובה יותר מגירסת 32 סיביות |
מקורות
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (571....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
