Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

Summary

biosensors phage ממוסס וחרוזים נוגדנים מסוגלים להבחין בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. לפאגים היו משותקים על ידי שיטת אנגמיור-Blodgett על גבי משטח של חיישן microbalance גביש קוורץ ועבדו כבדיקות סטפילוקוקוס מגוון רחבות. חרוזים נוגדנים לזהות MRSA.

Abstract

Bacteriophage ממס הפך מבני שיש מגוון רחב של זני מארח סטפילוקוקוס וחלבון פניצילין מחייב (PBP 2a) חרוזים לטקס מצומדות נוגדנים כבר נוצלו ליצירת biosensor המיועד לאפליה של Methicillin עמיד (MRSA) ו-S רגיש (MSSA) . מיני aureus ^1,2. לפאגים ממוסס הוסבו spheroids phage על ידי מגע עם ממשק מים, כלורופורם. monolayers אליפטית הפאג הועברה על גבי משטח biosensor על ידי טכניקת ³ אנגמיור-Blodgett (LB). את biosensors נוצר נבחן על ידי microbalance קוורץ גביש עם מעקב פיזור (QCM-D) כדי להעריך אינטראקציות חיידקים-phage. אינטראקציות חיידקים אליפטית הובילו לתדר תהודה מופחת ועלייה באנרגיה פיזור עבור שניהם זני MRSA ו MSSA. לאחר מחייב חיידקים, חיישנים אלה נחשפו בהמשך לפניצילין, מחייב חלבון נוגדן לטקס חרוזים. חיישנים ניתח עם MRSA הגיבו לPBP חרוזים נוגדני 2a; למרות חיישנים נבדקו עם MSSA לא נתנו שום תגובה. הבחנה ניסיונית זו קובעת חד משמעית אפליה בין methicillin עמיד וס הרגישים זני סטפילוקוקוס. מחויב באותה מידה ולא כרוך bacteriophages לדכא התפתחות חיידקים על משטחים ובהשעיות מים. ברגע שהם שינו phages ממוסס לתוך spheroids, הם שומרים על פעילות ממס החזקה שלהם ולהראות יכולת ללכוד חיידקים גבוהה. ניתן יהיה לנצל את spheroids phage והפאג לבחינות ולעיקור של מיקרואורגניזמים עמידים לאנטיביוטיקה. יישומים אחרים עשויים לכלול שימוש בטיפול bacteriophage ומשטחי מיקרוביאלית.

Introduction

זנים עמידים של סטפילוקוקוס Methicillin הוצעו כגורם חיוני בזיהומים והתפרצויות nosocomial ^4-8. דרכים נפוצות להכרה בהתנגדות methicillin, כגון בדיקת דיסק דיפוזיה oxacillin אגר מסך, או microdilution מרק, להסתמך על תנאי תרבות מותאמים כדי לשפר את הביטוי של התנגדות. שינויים כוללים ניצול של oxacillin, דגירה על 30 או 35 מעלות צלזיוס ולא 37 מעלות צלזיוס, וההכללה של NaCl למדיום הגידול. יתר על כן, לזיהוי נכון של סוגים של טכניקות אלה, תקופת דגירה ארוכה של 24 שעות, במקום 16 עד 18 שעות נדרשת. טכניקות מהירות עם רמה (> 96%) מתאימה לרגישות לזיהוי של התנגדות methicillin כוללות טכניקות microdilution אוטומטיות כגון כרטיס יטק GPS-SA, מערכת Staph ATB המהירה, ומערכת לוח Microscan המהירה אשר מייצרות תוצאות לאחר 3-11 שעות ^9-11. קריסטל M RSA מזהה מערכת היא שיטה מהירה המבוססת על הכרה בצמיחתו של ס ' aureus בנוכחות של 2% NaCl ו 4 מ"ג של oxacillin לליטר עם חיישן חמצן הקרינה רגיש. רגישויות טענו נעות בין% 91 עד 100 לאחר 4 שעות של דגירה ^12-14. שיטות פנוטיפי אלה מוגבלות בדיוקים שלהם על ידי ההשפעה של זנים נפוצים שמבטאים התנגדות הטרוגנית. לכן, השיטות הטובים ביותר המקובלת להכרה בהתנגדות methicillin היא ההכלאה PCR או DNA של גן Meca ^15. עם זאת טכניקה זו דורשת ה-DNA מטוהר והוא רגיש מאוד למוספים שונים (זיהומים), הכוללים ¹⁶ פסולת תא.

יתר על כן, שיטות אלה צריכים זמן רב לבצע. אסטרטגיות להכרה של מוצר גן Meca, 2a PBP החלבון, יכולה להיות מנוצלים כדי לקבוע התנגדות ועשויות להיות אמינה יותר בהשוואה לשיטות בדיקה רגילה ^17.

S = "jove_content"> זה היה שהוצג קודם לכן, כי יכול להיות מנוצל bacteriophage 12600 כמו בדיקה לזיהוי זני סטפילוקוקוס, כולל אלה שיש methicillin התנגדות ^1,2,18. בעבודה זו אנו מציעים שיטה חדשנית בהכרה הספציפית וזיהוי של MRSA, כגון הכרה בחיידקים יחד עם קונפורמציה של MRSA בזמן אמת. למטרה הספציפית הזה ס (PBP 2 א) היה בשימוש bacteriophage aureus עם ספקטרום רחב של מארחים (כולל זני MRSA) בשילוב עם נוגדן חד שבטי כנגד חלבון. PBP 2a הוא חלבון דופן תא ואת זה הוא הגורם של התנגדות לאנטיביוטיקה של MRSA. עם זאת נוגדן 2a PBP אינו ספציפי עבור ס aureus מאז כמה חיידקים אחרים יש חלבונים מחייבים אנטיביוטיקה עם דמיון רצף לPBP 2a ^19,20. כתוצאה מכך בעבודה זו, ש ' היו בשימוש bacteriophage aureus ונוגדנים כנגד חלבון 2a PBP. כדי להיות מסוגל לפתח biosensor לספציפיקאלי לאתר ולזהות MRSA מכשיר עם פעולת שני שלבים נוצלה. הצעד הראשון בשימוש ס monolayer aureus bacteriophage כמו בדיקה חיישן, ואילו בשלב השני הועסק 2a נוגדנים ספציפיים PBP. לכן, צעד אחד יכיר ס חיידק סטפילוקוקוס, כאחד האחר יהיה רגיש לחלבון לאנטיביוטיקה המחייב. כאשר אותות שהתקבלו משני צעדים הם חיוביים, הוא מציין את הגילוי הספציפי של MRSA.

Protocol

1. הכין את הקרקע

1. השג סוג זן ס aureus ATCC 12600, ש ' aureus 27690 וBacillus subtilis ATCC ATCC 6051. זנים עמידים methicillin של ס ' aureus - MRSA1, 2 MRSA, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, ב ' anthracis סטרן, סלמונלה typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, פרוטאוס מיראביליס, Klebsiella pneumoniae 13882; הפאג ממס 12600.
2. השג חרוזים לטקס מצומדות נוגדני 2a PBP.
3. הכן NZY בינונית כמתואר ^21.
4. השג פתרון פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
5. הכן מים deionized כsubphase לmonolayer תצהיר אנגמיור-Blodgett (LB).

2. הרבייה bacteriophage וטיטרציה

1. דגירה 5 מ"ל של תרבות הלילה של ס ' aureus ATCC 12600 (3.6 x 10 ⁸ יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ"ל) עם 500 μl של הפאג (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> PFU / מ"ל) במדיום NZY 500 מ"ל ב2 ליטר פלאק בייקר-חממה ב 37 ° C במשך הלילה.
2. צנטריפוגה התרבות ב 4424 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. supernatant מחדש centrifuged ב11,325 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
4. supernatant דרך מסנן 0.22 מיקרומטר Millipore מסנן.
5. צנטריפוגה תסנין ב75,395 XG במשך 1.5 שעות.
6. ממיסים בגלולה 100 μl של מים מזוקקים.
7. הכן פי 10 דילולים של השעיה הפאג במדיום NZY.
8. צלחת 1 מ"ל של התרבות (ON) הלילה של ס ' aureus ATCC 12600 על כל אחת מצלחות עם 2 אגר NZY כדי לוודא שכל המשטח מכוסה. הסר את עודף התרבות ולתת המשטח יבש למשך 30 דקות.
9. Spot מדגם (10 μl) של דילול הפאג המתאים על פני השטח של הצלחת ולדגור על 37 ^המעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות.
10. לבחון את היווצרות הפלאק ולחשב את כייל הפאג. titers bacteriophage (T) נאמדים על הבסיס של מספר plaques (N) שהוקם ל10 μl נפח (V) של השעיה הפאג והגורם לדילול (F). כייל היה מחושב על ידי נוסחה:. ט = N / (vxF) לדוגמה, עבור מספר לוחות 75 בדילול 10 ^-7 והנפח 10 μl ^(-3 מ"ל 10 x 10), כייל שווה 75 / (10 x 10 x 10 ^{-3 -7)} = 7.5 X 10 ¹⁰ יחידות להרכיב לוחית (PFU) לכל מ"ל של השעיה.

3. הפאג זהב משותק

1. חתיכות נקיים מצופות זהב 60 מ"מ קוורץ ⁽²⁾ על ידי פלזמה תחריט בארגון במשך 10 דקות ולאחר מכן לעקר עבור 6 שעות תחת אור UV בארון סטרילי.
2. הוסף 50 מיקרוליטר של 10 ההשעיה הפאג x ⁹ PFU / 1 מ"ל למשטח הזהב של כל חתיכה בצלחת פטרי סטרילית, ולאחר מכן דגירה הלילה בתא לח בטמפרטורת חדר.
3. הסר וכיילת את ההשעיה הפאג שנותר.
4. לשטוף חתיכות עם הפאג כרוך 5 פעמים עם PBS להסיר מאוגדphage.

4. בדיקה של infectivity הפאג משותק על משטח יבש

1. מורחים תרבות O / N של S. Aureus ATCC 12600 על גבי צלחת אגר NZY ולאפשר ייבוש.
2. מניחים פיסת זהב עם הפאג משותק על פני צלחת.
3. שים לב לאזור של תמוגה לאחר הדגירה 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, שמציין infectivity.
4. השתמש בחתיכות זהב מכוסות ללא הפאג בניסויים שליטים.

5. בדיקה של פעילות ממס של הפאג חינם וכרוך בנוזלים

1. הוסף תרבות על ש ' aureus 12,600-10 מיליליטר ATCC של NZY בכל ארבע צלוחיות 300 sidearm מ"ל (6 x 10 ⁶ CFU / מ"ל בבקבוק אחד).
2. הוסף בשתי צלוחיות 2 x 10 ⁶ pfu / מ"ל של הפאג ללא תשלום.
3. השתמש בשתי צלוחיות האחרות כקבוצת ביקורת.
4. לפקח על מהלך הזמן של ס ' תמוגה תא aureus עבור 570 דקות על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD ₆₀₀₎ במרווחי זמן של 30 דקות לכל צלוחיות.
5. קח מדידה סופית ב 24 שעות.
6. חזור על שלבי 5.1-5.5, אבל להשתמש בחתיכות זהב עם phages מאוגד במקום phages החופשי, וחתיכות זהב ללא הפאג בצלוחיות בקרה.

6. אובדן phages הכרוכים במהלך הדגירה

1. הוסף 50 μl של 10 הפאג PFU / מיליליטר 1 x ⁹ על פני השטח של תכשיט זהב סטרילי בצלחת פטרי הממוקמת בתא לח למשך לילה בטמפרטורת חדר.
2. הסר את ההשעיה עם הפאג מאוגד ממשטח הזהב וכייל.
3. שטוף את פיסת הזהב עם הפאג כרוך 5 פעמים עם PBS ומקום בפתרון NZY 1 מ"ל בשפופרת 15 מ"ל שבייקר-אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות.
4. לקבוע את כייל של הפאג המנותק כפי שמתואר ב2.

7. הכנת הפאג spheroids

1. שילוב של 400 μl של השעיה 12600 הפאג מניות (10 ¹¹ PFU / מ"ל) עם נפח שווה של כלורופורם כיתה spectrophotometric בבקבוקון 1 מ"לבטמפרטורת חדר.
2. בעדינות מערבולת ההשעיה הפאג, כלורופורם 5-6 פעמים (5 מרווחי שניות) על פני משך דקה אחת.
3. אפשר השעיה לייצוב למשך 30 שניות ולאחר מכן פיפטה של ​​השלב העליון המכיל spheroids היה pipetted זמנים להכנת שכבה.
4. קח כמה מיקרוליטר של ההשעיה spheroids לשידור במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
5. השתמש השעיה אליפטית שנותרה לייצור biosensor.

8. הכנת biosensor

1. חיישנים נקיים QCM-D על ידי פלזמה התחריט בארגון ל10 דקות נקיות PDC-32G Harrick פלזמה.
2. יש לשטוף את החיישן עם הקסאן כדי להסיר כל זיהומים אורגניים.
3. להכין ולנקות שוקת של האיזון כפי שמתואר בסרט ^22.
4. מלא שוקת LB עם פתרון subphase ולנקות אותו עם מחסום שוקת ולייצב את השוקת ב20 ± 0.1 ° C
5. מורחים 300 aliquot μl של הפאג 12600 בsuspensi המימיתב (10 ¹¹ PFU / מ"ל) על גבי subphase LB.
6. הכן monolayer הפאג על פתרון subphase LB על ידי מתן 300 aliquot μl של השעיה מימית הפאג 12600 (10 ¹¹ PFU / מ"ל) כדי להפעיל את מוט זכוכית wettable נוטה שטבל באופן חלקי לsubphase ^22,23.
7. לייצב את monolayer המוכנה למשך 10 דקות, ולאחר מכן לדחוס אותו בשיעור של 30 מ"מ / דקה (45 ס"מ ² / דקות), עד שלחץ קבוע 19 N / M הוא השיג.
8. בצע תצהיר סרט אנכי על גבי חיישן QCM-D, בניצב בשיעור של 4.5 מ"מ / דקה ברציפות על ידי טבילת חיישן ולצאת מmonolayer שבע פעמים. מיקרוסקופ אלקטרונים של הופקד monolayers phage לפני חשיפה לדגימות חיידקים הראתה כי השכבות היו רציפה, הומוגנית ואחידים (מידע לא מוצג).
9. חזור על שלבי 4.5-4.8 עם השעיה אליפטית הפאג כי הוא מוכן ב3.
10. השתמש biosensors phage מפוברק לזיהוי MRSA, אלקטרוןמיקרוסקופיה, וellipsometry.

9. בדיקת biosensor, אפליה של Methicillin עמיד וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים

1. בפרוטוקול זה, biosensors עם הפאג ללא שינוי והשינוי וspheroids phage מוכן. משמש microbalance גביש קוורץ עם ארבעה תאי חיישני זרימה לפקח מחייב של חיידקים לפאג משותק על משטח חיישן QCM. חרוזים לטקס מצומדות PBP 2a נוגדנים מנוצלים ללהיפלות בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. כל המדידות שנערכו במצב הזרימה (50 μl / min) בשעה 5 מגה הרץ.
2. להקים תדר תהודה קו בסיס של חיישן QCM במים (~ 30 דקות).
3. צייר השעיה של תאי חיים Methicillin סטפילוקוקוס חיידקים רגישים במים (10 ⁹ CFU / מ"ל) באמצעות תא הבדיקה.
4. ברציפות לעקוב אחר שינויים בתדר התהודה החיישנים ופיזור אנרגיה לצליל עילי, USIng התוכנה ש-Soft.
5. כאשר השינויים בתדר התהודה החיישנים והפיזור הגיעו לרמות רוויה, להוסיף את ההשעיה של חרוזים לטקס PBP נוגדנים מצומדות (6.77 x10 ¹⁰ חרוזים / מ"ל) לזרימה במהלך הניטור הרציף של תדר ופיזור.
6. חזור על שלבי 9.2-9.5 לתאים חיידקיים עמידים Methicillin (MRSA).
7. הגדר שינוי תדר דרך השינוי ההמוני עקב חיידקים מחייבים ידי Sauerbrey המשוואה ^24,25 Δf =-Δm xn / C, כאשר C הוא רגישות מסה קבוע (בשעה 5 מגה הרץ הרץ x ^-1 C = 17.7 ng x ס"מ ^-2 ), מ 'הוא מסה וn הוא מספר הנימה (n = 1).
8. הגדר שינוי בזבוז אנרגיה (Δ ד ') מרישום הדעיכה מעריכית של תנודה (תדר ומשרעת ריסון, אשר אפשרו כימות של האנרגיה התפוגגה ומאוחסנות באותה תקופה אחד מתנודה,E _{התפוגגה ומאוחסן} E, בהתאמה: Δ D = E _התפוגג / 2 _מאוחסן πE. Δ D נמדד ביחידות פיזור (DU), אחד DU = 10 ^-6 יחידות יחסית).

Results

הפאג הוכיח פעילות ממס נגד כל הזנים שנבדקו של ס ' aureus, כולל זני MRSA, כפי שעולים מבדיקת מקום הפאג. גדלי פלאק בדרך כלל נע בין 5 עד 15 מ"מ. לא נמצאה פעילות נגד בדיקת תרבויות אחרות (טבלת 1).

צמיחה נורמלית של ס ' aureus ATCC 12600 במדיום NZY בייקר-אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס מוצגת באיור 1 א (עקומה שכותרתו על ידי חוגים ריקים). מספר החיידקים גדל מ 3.2 x 10 ^6-4....

Discussion

זה ידוע היטב כי phages יכול לשמש כבדיקות biosensor לחיידקים פתוגנים ^28. זה בא לידי הביטוי בעבודה זו, שיכול להיות מנוצל הפאג יחד עם נוגדני 2a PBP כדי לפתור את הבעיה הישנה: זנים עמידים ורגישים אנטיביוטיים מהירים אפליה.

נמצא עם זאת phages staphylococcal ללא שינוי הנורמלי אלה אינם מתאימים לאיתור חיידקים עם התקני QCM, למרות שהם לאגד חיידקים. זנב הפאג הוא כל כך הרבה זמן שגלים אקוסטיים לא יכולים "להגיע&q...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>ריאגנטים
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO	P4417
כלורופורם בדרגה ספקטרופוטומטרית	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	154733	(99.8% ACS)
הקסאן-נטול מים	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO	29609-0	(95%)
אתיל אלכוהול	מוצרי פארמקו בע"מ ברוקפילד, CT	64-17-5	190 הוכחה
<חזק>ציוד
PBP 2a נוגדן מצומד חרוזי לטקס	Denka Seiken Co., Ltd, טוקיו, יפן	מבחן
MRSA-ScreenS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 ו-Bacillus subtilis ATCC 6051	מאוסף תרבות הטיפוסים האמריקאית (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; הפאג' הליטי 12600	אוסף התרבות של אוניברסיטת אובורן, אובורן, צנטריפוגה AL
	בקמן קולטר	אופטימה L-90K אולטרה צנטריפוגה
KSV 2200 LB איזון סרטים	KSV כימיקלים, פינלנד
מיקרוסקופ אור מערכת אופטית	CitoViva Technology Inc., אובורן, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä stra Frö לונדה, שוודיה	E4
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)	JEOL USA Inc., פיבודי, MA	JEOL-7000F SEM
מיקרוסקופ אלקטרונים משדר (TEM)	JEOL USA Inc., פיבודי, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA		SCGPU05RE 0.22 μ m, GP Express PLUS ממברנה
צלחת בדיקה ביולוגית	NUNC A/S, דנמרק	240835	מידות (מ"מ), 245 x 245 x 25
פיפטות	גילסון, פיפטמן, צרפת	P100, P200, P1000
C24 אינקובטור שייקר	ניו ברונסוויק סיינטיפיק, CT	קלאסי C24
חתיכות קוורץ מצופות זהב	אוניברסיטת אובורן, AL
כלי	פטרי תוצרת ביתפישר ברנד, ארה"ב	0875713	100 מ"מX15 מ"מ
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer
ספקטרומטר אופטי	Genesys 20. תרמו ספקטרוניק, ארה"ב.	4001
מנקה פלזמה	האריק פלזמה, ארה"ב	PDC-32G
Millipore מערכת טיהור מים	Millipore	Direct-Q
הדמיה אליפסומטר	Accurion, ארה"ב	nanofilm_ep3se
תוכנה	Q-Sense AB, שוודיה	QSoft, QTools