התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

סיכום

בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.

תקציר

לומד היווצרות תאי נבט ובידול באופן מסורתי היה קשה מאוד עקב מספרים סלולריים נמוכים ומיקומם העמוק בתוך עוברים מתפתחים. הזמינות של "סגור" במערכת מבוססת מבחנה יכולה להוכיח לא יסולא בפז להבנה של gametogenesis שלנו. היווצרות של ביצית דמויות תאים (OLCs) מתאי גזע סומטיים, שבודדו מעור עכבר יילוד, הודגמה ויכולה להיות דמיינו בפרוטוקול בסרטון זה. את OLCs כתוצאה להביע סמנים שונים בקנה אחד עם ביציות כגון Oct4, ושה, Bmp15, וScp3. עם זאת, הם נשארים מסוגלים לעבור התבגרות או הפריה בשל אי השלמת המיוזה. פרוטוקול זה יספק מערכת שהיא שימושית לחקר היווצרות השלב מוקדם והתמיינות של תאי הנבט לתוך תאי מין בוגרים יותר. במהלך ההתמיינות מוקדמת במספר התאים המבטאים Oct4 (כמו תאי חיידק פוטנציאליים) מגיע ל ~ 5%, עם זאת בשלב זה Formation של OLCs נותר בלתי יעיל יחסית. הפרוטוקול הוא יחסית ישר קדימה אם כי יש לנקוט זהירות מיוחדת על מנת להבטיח את אוכלוסיית התאים בריאה ומתחיל במעבר מוקדם.

מבוא

במהלך העובר בשלב מוקדם, gametogenesis מתרחש דרך סדרה של שלבים, כולל תא חיידק קדמוני (PGC) היווצרות, הגירה, ולבסוף קולוניזציה של רכסי האשכים. במהלך תקופה זו עובר PGCs ריבוי והתמיינות לתאי מין יותר ויותר בוגרים יותר ^1. העובדה שPGCs נודד מהבסיס של allantois לעובר במעי האחורי ולבסוף לאורך הקיר הגבי סופו של דבר ליישב את רכסי האשכים הופכת אותם קשה מאוד ללמוד ^2. למרות התקדמות בתחום, מחקרים המנסים להבין את היווצרות והתמיינות PGC כבר הקשו על ידי המספר המוגבל שלהם, מיקום ואופי נדידת ^3,4.

בשנים האחרונות הוכחו בתאי גזע עובריים יש פוטנציאל ליצירת תאי הנבט במבחנה ^5,6. כמו כן, כמה תאי גזע הסומטיים יש גם הוכחו כבעלי הפוטנציאל ליצירת תאי הנבט Follבשל בגידול חוץ ^7-11. לאחרונה תאי גזע שבודדו מעור עכבר יילוד היו מובחן במבחנה לתאים דמויי חיידק וביציות בשלבים מוקדמים ^12. במהלך בידול תת הקבוצה של תאי הגזע המבטאים Oct4 גדלה ומתחמים המזכירים מבני קומולוס-ביצית נוצרו. הביצית דמויות התאים (OLCs) ניתן לאסוף מהתרבויות ובהשוואה לביציות טבעיות. שימוש בשיטה זו התרבות OLCs מדידת 40-45 מיקרומטר מתקבלים כי סמנים דומים מפורשים לביציות כגון Gdf9b, ושה, וDAZL. עד כה את OLCs התוצאה יישאר מסוגל להתבגר או להיות מופרה ^12.

למרות OLCs יישאר מסוגל לתפקד פרוטוקול המשמש ליצירת OLCs אלה ייתכן שעדיין יש שירות כassay ללמוד היווצרות וההתפתחות של תאי הנבט בשלבים מוקדמים יותר בתוך מערכת סגורה במבחנה. הפרסום המקורי שדן בהיווצרות של OLCs מכךתאי גזע matic מנוצלים עור עוברי חזירי כמקור תאי גזע ^8. הרחבת על מחקר שהתאים דמויי PGC נוצרו מוקדם במהלך התמיינות מושרה הוצגו להיות מבשרי לסמנים כאלה PGC מפורש OLCs וכOct4, ושה, סטלה, C-KIT, וDAZL ^13. נתונים אלו תומך בפוטנציאל של ניצול מערכת זו כדי ללמוד היווצרות חיידק והתמיינות של תאים במבחנה. הפרוטוקול מנוצל כדי ליצור OLCs מעור עכבר יילוד יהיה הפגין במאמר זה וידאו. פרוטוקול זה מציע במודל חוץ גופית ללמוד פיתוח תא חיידק שעשוי לספק אמצעי על מנת להבהיר גורמים חשובים להתפשטות וההתמיינות שלהם.

פרוטוקול

1. מדיה הכנה

1. הכן תקשורת 2-3 שעות מראש של שימוש ומקום עם כובע משוחרר בתא שבו תרבות חממת הניסוי יהיה מתרחש. מדיה בשימוש בפרוטוקול הנוכחי:
   1. הכן נובע מדיום סלולרי בהיקף של DMEM/F12 בתוספת 1 X B27, 40 ng / ml bFGF, ו20 ng / ml EGF.
   2. להכין מדיום התמיינות תאים נבט בהיקף של M199 בתוספת FSH 0.05 IU, 0.03 IU LH, 3 מ"ג / מיליליטר BSA, 5, פירובט הנתרן 0.23 מ"מ μl / מ"ל, 1 מ"ג / מיליליטר Fetuin, וng 1 / מיליליטר EGF. מדיום בסיס המורכב של כל התוספים אבל השמטת FSH, LH יכול להיות מוכן וEGF ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

2. גזע הכנת תרבית תאים

1. בודד תאי גזע מגורי עכבר יילוד כפי שתואר לעיל ^12. לנצל את תאי גזע בחלוף 2-4 בהתמיינות תאי נבט מבחנה. היעילות שלהיווצרות של נקודתי טיסה קשורה באופן ישיר לאיכות של תאי הגזע מתחילים. עדיף להתחיל את הבידול בהקדם האוכלוסייה נראית נקי ובריא שהוא בדרך כלל בסביבות מעבר 2. culturing עוד 2 מעבר העבר בתאי גזע משפיע לרעה על יעילות היווצרות של נקודתי הטיסה (תוצאות לא פורסמו).
2. 48 שעות לפני ייזום בידול תת תרבות תאי הגזע. הסר את כל המצרפים המושעים כדוריים הסלולריים והתקשורת בילתה ממנת התרבות, באמצעות פיפטה סרולוגיות ומניחה בשפופרת 15 מ"ל. חשוב לאסוף רק המצרפים המושעים כדוריים של תאים ולא התאים המחוברים לתחתית הצלחת, כי הם באופן ספונטני מבדל.
3. גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות., לבטל את supernatant, resuspend ב 500 μl של תקשורת תאי גזע טרי חימם עד 37 ° C. בעדינות פיפטה המצרפים לניתק באופן חלקי את התאים. לא באגרסיביות אל פיפטה תאים כמו זה יפחית כדאיות תא. לשטוף את התאים באופן חלקי ניתק לתוך 9.5 מ"ל של מדיום תאי גזע מראש חימם טרי על צלחת נמוכה מצורף 10 ס"מ תא תרבות.
4. להחזיר את התאים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ בתרבית תאים באינקובטור במשך 48 שעות לפני תחילתו של הבידול.

3. בידול של נקודתי טיסה

1. בעזרת פיפטה סרולוגיות להסיר את תאי גזע ממנת התרבות והמקום בצינור 15 מ"ל, להשאיר מאחור את כל תאים מחוברים אליו. גלולה התאים ב XG 500 ו resuspend ב 500 PBS סטרילי μl. פיפטה הנמרצת את התאים באמצעות רחב נשאו 1,000 קצה μl לתוך גושים לא גדולים יותר מ 10-20 תאים. מעת לעת להסיר כמות קטנה של תאים, בעת הניתוק, ולבדוק תחת מיקרוסקופ אור לבן כדי לאשר תאים מצטברים בגושים של 10-20 תאים בודדים. על ניתוק יגרום לכדאיויות תא מופחתת.
2. הוסף 9.5 מ"ל PBS לתאים ניתק ולהוסיף 15 μl של השעיה תא זה לhemocytometer לספירת תאים. גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות.
3. Re-להשעות את התאים בריכוז של ⁶ 1.32X10 תאים / מ"ל במדיום התמיינות.
4. צלחת התאים על ידי הוספת 500 μl לכל גם לתחתית שטוחה 24 מנה השעיה היטב.
5. מניחים את צלחת 24 גם לתוך תא תרבות חממה ב 37 ° C ב 5% CO ₂ למשך 48 שעות. הסר 250 בינוניות μl מכל טוב ומקום בצינור שכותרתו 1.5 מ"ל בהתאמה. הוסף 250 בינוני בידול טרי μl היטב כל אחד. צנטריפוגה את המדיום בילה בXG 500 במשך 5 דקות. וזורקים supernatant. Resuspend כל תאי pelleted ב50 בינוני בידול טרי μl ולחזור לתרבות המקבילה גם על צלחת הבידול.
6. בכל 48 שעות לשנות את המחצית בינונית עד 12 יום של בידול.

תוצאות

בתחילה את התאים לצרף לתחתית צלחת התרבות ונפרשו. ב42-72 שעות להתמיינות תאי Oct4 חיוביים קטנים מושעים להיוצר ולהתרבות (איור 1 א). זמן קצר לאחר ההדמיה של תאים אלה הרוב ייעלם והתאים המצורפים יהוו אגרגטים מושבה צפופים בתחתית התרבות. בעקבות כמה ימי אגרגטים אלה להתנתק ממשטח התרבות. בחלק מאגרגטים אלה ניתן לראות תאים גדולים (איור 1b ו1 ג'). על ההדמיה ראשונית התאים יהיו ~ 35 מיקרומטר בקוטר. עם תרבות המשך את OLCs יגדל להגיע ~ 45 מיקרומטר בקוטר. אלה הם OL...

דיון

עד כה OLCs הפונקציונלי לא פותחו באמצעות לחלוטין בassay חוץ גופית. לאחרונה מחקר על ידי הייאשי et al. היה מסוגל לייצר צאצאים מדמויים PGC תאים שנוצרו במבחנה והועברו in vivo להמשך פיתוח ^14. החל עם תאי גזע עובריים או תאי pluripotent מושרה הם הצליחו ליצור תאים PGC כמו אשר, כאשר התאוששו בעקבות in vivo ההשתלה היו מסוגלים להיות התבגר, מופרה, ומשמש ליצירת צאצאים ^14. זה מוכיח כי תאי גזע ממקורות שונים שיש לו את הפוטנציאל, בתנא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
נתרן פירובט	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
24 צלחות	באר Nunc	144530
10 ס"מ כלים	VWR	25384-088
15 מ"ל צינורות	BD	352095