מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

סיכום

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

תקציר

תכונות מכאניות של תאים ומטריצה ​​תאית (ECM) ממלאות תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל בידול בתאי גזע, היווצרות גידול, וריפוי פצעים. שינויים בקשיחות של תאים וECM הם לעתים קרובות סימנים של שינויים בפיזיולוגיה של תא או מחלות ברקמות. לפיכך, תא קשיחות היא מדד להערכת המצב של תרביות תאים. בין מספר רב של שיטות שיושמו על מנת למדוד את הנוקשות של תאים ורקמות, מיקרו כניסה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מספקת דרך למדוד את הנוקשות של תאי חיים באופן מהימן. שיטה זו כבר מיושמת באופן נרחב כדי לאפיין את הנוקשות בקנה מידה מייקר עבור מגוון רחב של חומרים, החל ממשטחי מתכת לרקמות רכות ותאים ביולוגיים. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא לכניסה לתא עם קצה AFM של גיאומטריה נבחרה ולמדוד את הכח המופעל מהכיפוף של שלוחה AFM. התאמת עקומת כוח הכניסה למצב הרץl לגיאומטרית הקצה המקביל יכול לתת מדידות כמותיות של חומר קשיח. מסמך זה מדגים את ההליך כדי לאפיין את הנוקשות של תאי חיים באמצעות AFM. צעדים מרכזיים, כולל תהליך של כיול AFM, רכישת כוח עקומה, וניתוח נתונים באמצעות שגרת MATLAB הם הפגינו. מגבלות של שיטה זו הם דנו גם.

מבוא

תכונות מכאניות, במיוחד נוקשות, של תאים בודדים ומטריצות תאי המקיפות (ECM) הן קריטיות לתהליכים ביולוגיים רבים, כולל צמיחת תאים, תנועתיות, חלוקה, התמיינות, והומאוסטזיס רקמות. ¹ זה כבר הוכיח כי נוקשות מכאני תא נקבעת בעיקר על ידי cytoskeleton, במיוחד את הרשתות של אקטין וסיבי ביניים וחלבונים אחרים הקשורים בהם. ² תוצאות של בדיקות מכאניות ברשתות במבחנה של אקטין וסיבי ביניים מראות כי את המכניקה של התאים תלויה במידה רבה את מבנה cytoskeletal והמתח טרום ב שלד התא. ^3-5 נוקשות של תאי חיים אז הוא נחשב למדד כדי להעריך את מבנה cytoskeletal ^{6, 7} פעילות שרירן ורב תהליכים תאיים אחרים. יותר מכך, שינויים בתכונות מכאניות של תאים מצויים גם לעתים קרובות להיות associ מקרובated עם תנאי מחלה שונים, כגון היווצרות גרורה סרטניים ^8-10 ניטור הנוקשות מכאנית של תאי חיים ולכן יכולות לספק דרך חדשנית לניטור פיזיולוגיה תא;. לזהות ולאבחן מחלות ^8;. וכדי להעריך את היעילות של טיפולים תרופתיים ^{11 , 12}

שיטות מרובות, כולל microrheology חלקיק מעקב, ^13-16 cytometry פיתול מגנטית, ¹⁷ שאיפת micropipette ^18,19 וmicroindentation ^20-22 פותחו כדי למדוד את האלסטיות של תאים. microrheology מעקב אחר החלקיקים משרטטת את תנודות התרמיות של חלקיקים או ניאון submicron הזריקו לתוך תאים או סמני fiducial בתוך שלד תא התא. ²³ תכונות אלסטיות וצמיגות של תאים מחושבות מהתקות החלקיקים נמדדו באמצעות משפט תנודות-פיזור. ^14,23 שיטה זו מאפשרת מדידות בו זמניות של מקומיתכונות מכאניות עם רזולוציה מרחבית גבוהה במקומות שונים בתא. עם זאת, הזרקת חלקיקי ניאון לתאים עלולה לגרום לשינויים בתפקוד תא, מבנה שלד תא, ומכאן מכניקה הסלולרי. שיטת שאיפת micropipette חלה לחץ שלילי בmicropipette בקוטר הנע בין 1 ל -5 מיקרומטר למצוץ חתיכה קטנה של קרום תא לתוך פיפטה. תא נוקשות מחושבת מהלחץ השלילי מיושם ועיוות קרום תא. ^-18 שיטה זו, עם זאת, אינו יכולה לזהות את ההתפלגות הטרוגנית של נוקשות על פני התא. cytometry פיתול המגנטית (MTC) חלה שדה מגנטי כדי ליצור מומנט בחרוזים פאראמגנטיים סופר מחובר לקרום התא. סלולרי ¹⁷ נוקשות נגזרה בשיטה זו ממערכת היחסים בין המומנט מיושם ועיוות הפיתול של קרום התא. זה קשה לשלוט על המיקום של חרוזים מגנטיים בשיטת MTC, וזה גם challenging לאפיין את העיוות מתפתלת עם רזולוציה גבוהה. Microindentation חל indenter עם גיאומטריה מוגדרת היטב לאגרוף לתוך התא. כוח indenting והכניסה וכתוצאה מכך תאים לעתים קרובות לעקוב חיזוי של מודל הרץ. moduli של יאנג של תאים ניתן לחשב את עקומות כוח ההזחה על ידי התאמתן למודל הרץ. שיטה זו כבר מיושמת באופן נרחב כדי לבחון את התכונות מכאניות של רקמות ותאים, למרות המגבלות שלה, כגון חוסר ודאות בקביעת קשר נקודה, תחולתו של מודל הרץ, ואת הפוטנציאל לפגיעה פיזית בתאים. בין התקנים רבים לmicroindentaion ^20, מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) הוא זמין באופן מסחרי וכבר מיושם באופן נרחב לאפיון תכונות מכאניות של תאי חיים ורקמות ^21,24-27.

מסמך זה מדגים את ההליך של שימוש מקלט MFP3D-Bio AFM לאפיין מכניקה סלולרי. AFM לא עלly מספק טופוגרפיה ברזולוציה גבוהה של תאים, אלא גם כבר מיושם באופן נרחב כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאים ורקמות. העיקרון של כניסת AFM מודגם באיור 1. שלוחה AFM גישות תא מכמה מיקרומטרים הנ"ל; יוצרת קשר עם התא; כניסות הסלולריים, כך שסטיית שלוחה מגיעה לנקודת סט שנבחרה מראש, ומתרחקת מהתא. במהלך תהליך זה סטיית שלוחה נרשמת כפונקציה של מיקומו, כפי שמוצגת באיור 1. לפני יצירת קשר עם התא, שלוחה נעה במדיום ללא כל סטייה נראית לעין. כאשר indenting בתא, מתכופפת שלוחה ועליות אותות הסטייה. את cantilevers הוא מודל כקורה אלסטיות, כך שהסטייה שלהם היא פרופורציונלית לכח המופעל על התא. על ידי הגדרת סטיית שלוחה המרבית, את הגודל המרבי של כוח המופעל על המדגם מוגבל, כדי למנוע דamage לתאים. החלק של עקומת כוח מהנקודה לנקודה B באיור 1 ג, שבו כניסות קצה לתוך התא, הוא מתאימים למודל הרץ כדי לחלץ את נוקשות התא.

איור 1. איור של microindentation ופרשנות של עקומת כוח AFM. הפנל העליון מראה את התנועה של שלוחה AFM מונעת על ידי סורק piezo. המיקום האנכי של שלוחה ושלוחת z סטיית האות D הוא רשם במהלך התהליך. שלוחה מתחילה מנקודה, כמה מיקרומטרים מעל לתא. בעת שהתקרב לתא, δ כניסת המדגם נשאר אפס עד שהוא מגיע לנקודה ב ', שבו הקצה בא במגע עם התאים. הקואורדינטות של נקודת B בעלילה הן ערכים קריטייםלניתוח נתונים, מסומן על ידי (z _0, ד _0>). מ-B ל-C, את כניסות שלוחה לתוך התא עד שסטיית שלוחה מגיעה לנקודה שנקבעה, אשר מוגדרת להיות היחס בין כוח המרבי indenting ממוקד ומעיין שלוחה המתמיד. ברגע שהאות מגיעה לסטייה מהערך המרבי המוגדר מראש, שלוחה לאחר מכן נסוג מתא לנקודת D, שבו לעתים קרובות להיות משך כלפי מטה בשל הידבקות קצה מדגם, מתנתקת מהתא וחוזר למיקומו הראשוני בדואר. הפנל הימני מדגים את הקשר בין הכניסה וz המוקלט ואות ד. בפנל השמאלי התחתון היא עלילה של עקומת נציג כוח, כניסה המרבית של שלוחה, שקבועות הקפיץ נמדדה להיות 0.07N / מ ', מוגדר להיות 17 ננומטר, כך שהכח המרבי indenting להחיל מדגם הוא 1.2 NN. מקומות מפתח במהלך הכניסה מסומנים.

פרוטוקול

1. לכייל קבוע הקפיץ של שלוחה

1. טען שלוחה לAFM פי הוראות היצרן. יש צורך לנקות את בעל שלוחה עם אתנול לפני כל ניסויים. זה יעזור לצמצם זיהום חיידקים לתרבות במהלך מדידות AFM.
2. לכייל InvOLS (רגישות מנוף אופטית הופכי). פרמטר זה מתאר את כמות תגובת photodiode (וולט) לננומטר של סטיית שלוחה.
3. טען שקופית זכוכית נקיות על הבמה המדגם, ולאחר מכן להתקין את ראש AFM ולהתאים את קרן לייזר ויישור על פי הוראות היצרן. לעסוק קצה AFM בשקופית הזכוכית.
4. עם piezo מסוגר, ליישר מחדש את המראה לקריאת photodiode של -2 V. לבצע מדידת ספקטרוסקופיה כוח עם נקודת הדק (תגובת photodiode המרבי) של 2 V.
5. עם piezo מסוגר, ליישר מחדש את המראה לקריאת photodiode של -2 ו 'בצע עבורמדידת RCE ספקטרוסקופיה עם נקודת הדק (תגובת photodiode המרבי) של 2 הערה ו ': ערכי המתח כאן הן ספציפיות למקלט AFM. ערך זה צריך להיות מוגדר על פי המפרטים המסופקים על ידי יצרן.
   לאחר רכישת הנתונים יסתיימו, להתקרב לאזור משרד המגע של עקומת כוח. בצע התאמה ליניארית לאזור זה כדי למצוא את השיפוע, אשר יהיה בV / ננומטר. הגומלין של ערך זה מתאר את הרגישות האופטית של אנסמבל שלוחה-photodiode.
6. לאפס את יישור המראה כדי סטייה החופשית של 0 V.
7. לכייל את קפיץ שלוחה מתמיד. שיטת תרמית-מנגינה משמשת לקביעה הקבוע הקפיץ של שלוחה ^28.
8. לאחר כיול InvOLS, להעלות את הסורק מבמת המדגם כזה שאין אינטראקציות בין הקצה והמדגם.
9. להתחיל בלכידת נתונים תרמיים. במהלך תהליך זה, רטט התרמית של הקרן הוא שלוחה Recordeד. התוכנה מנתחת AFM כוח כזה ספקטרום של רטט ועלילותיו בחלון הנתונים תרמיים.
10. אחרי כמה שניות של רכישת נתונים, לבצע התאמה למגזר נתונים מרוכזים בתדר הנמוך ביותר (תהודה בסיסית) כדי לקבוע השיא קבוע הקפיץ.

2. טעינה לדוגמא

1. התקן את אבזר מחמם תבשיל על הבמה AFM, אם לא כבר מצויד.
2. הגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס, ולחכות 20 דקות עד שהמערכת מגיעה לשיווי משקל תרמי יציב.
3. מניחים את צלחת התרבות על הבמה AFM ולאבטח אותו באמצעות המהדק מסופק עם תנור חימום המנה. חשוב לצמצם את הזמן בין הסרת הצלחת מהחממה ולהניח אותו על הבמה, כדי להימנע מטראומה לתאים. עבור מדידות ארוכות יותר מ -30 דקות, יש להשתמש במדיום עצמאי CO ₂ להחליף את מדיום התרבות הנורמלי.
4. תחול ירידה קטנה של 37 מעלות צלזיוס תרבות בינונית עד קצה tהוא שלוחה AFM, ולהוריד את הראש עד הקצה AFM הוא פשוט שקוע בנוזל.
5. באמצעות מצלמת CCD העליון הנוף, ליישר מחדש את קרן לייזר בשלוחה (היישור בנוזל יהיה שונה מאשר באוויר, בגלל השינוי במקדם השבירה של המדיום).
6. לעסוק קצה AFM על אזור נקי של צלחת התרבות.
7. לבצע כיול של InvOLS כפי שתואר לעיל, לרגישות שלוחה בסביבה הנוזלית.

הערה: א) אם תאים בתרבית על הידרוג, הכיול של InvOLS צריכה להתבצע מראש על המשטח התחתון של מנה תרבות מלאה בתרבות תקשורת סלולרי. בעת מעבר לדגימות תאים, יש תשומת לב מיוחדת שישולם שלא לשנות את יישור קרן לייזר עם שלוחה. ב) יש InvOLS להיות recalibrated כל פעם שיש שינוי ביישור בלייזר. ג) מומלץ גם לקחת InvOLS כממוצע של ערך מכמה עקומות כיול, sאינס כל כיול יוצר InvOLS שונה. הווריאציה בInvOLS היא, לעומת זאת, קטנה בהשוואה לערך הממוצע. לדוגמה, כיול שלוחה Bruker DNP-10 עם אביב קבוע 0.06 N / מ 'במצב נוזלי על ידי 100 פעמים לייצר ערך ממוצע של 66.3 InvOLS ננומטר / V, עם סטיית תקן של רק 0.5 ננומטר / V.

3. איסוף Curves חיל זחה סלולרי

1. בחר תא לכניסה. בעזרת מיקרוסקופ האופטי, להזיז את הבמה כדי למקם שלוחה מעל התא, כך שקצו ממוקם באזור פרי הגרעינים. התאמה מדויקת של מיקום שלוחה ניתן להשיג זאת על ידי החלת קיזוז לX ו Y סורקים.
   הערה: יש שלוחה AFM שנסוג משטח המדגם תוך הזזת הבמה המדגם כדי לבחור תא היעד. זה מגן על שלוחה מדפיקות במדגם, שכן שטח המדגם לא יכול להיות שטוח.
2. לעבור לחיל מצב ספקטרוסקופיה. הגדר את הכניסהשיעור לטווח של 1-10 מיקרומטר / sec, נמוך מספיק כדי למנוע תופעות הידרודינמית.
3. להגדיר את נקודת הדק הסטייה, אשר מגבילה את כוח indenting המרבי, כדי למנוע נזק לתאים. בחר את האפשרות יחסית מפעילה, שתתקן לסחיפה בכל אות הסטייה. כוח מרבי של 2 NN הוא נקודת התחלה טובה עבור רוב הדגימות. ערך זה, עם זאת, צריך להיות מותאם לפי מדגם הנוקשות. לקבלת דוגמיות רכה אמור לשמש ערך נמוך יותר, כדי למנוע כניסה מוגזמת למדגם. לקבלת דוגמיות נוקשות יש להשתמש בערך גבוה כדי ליצור כניסה למדידה.
4. הגדר את מרחק כוח גדול מספיק כדי להבטיח שהקצה יהיה מנותק לחלוטין מהתא בין מדידות כוח. בדרך כלל, את מרחק כוח מוגדר ב5 מיקרומטר.
5. פקד AFM לקחת עקומת כוח יחידה.
6. לאסוף לפחות שלוש עקומות כוח במקומות שונים באזור פרי הגרעינים של כל תא. למרות זאת הוא מועיל לקחת מרוביםעקומות בכל תא לנתונים סטטיסטיים אמינים, לוקחים עקומות כוח רבות מדי עלולות לגרום לשינויים בתא נוקשות עקב לחץ מבדיקת AFM.
7. כאשר איסוף הנתונים הושלם, למשוך את הקצה, וחזור על שלבים 3.1-3.6 לתאים רבים ככל נדרש לנתונים סטטיסטיים טובים על תא נוקשות בתנאי מדגם מסוים. בדרך כלל, 30 תאים נמדדים עבור כל תנאי.

כדי לאפיין את ההפצה של נוקשות בתוך תא בודד, מצב כוח המפה מוחל. במצב חיל-המפה, להגדיר גודל סריקה כדי לכלול את האזור של עניין; להגדיר רזולוציה מתאימה; להגדיר את הפרמטרים הזחה כמו אלה שנבחרו לעקומות כוח אחידות ויחידות, ואז יהיה AFM סריקה על פני שטח המדגם שנקבע ולקחת את עקומות כוח יחידה בכל פיקסל באזור המדגם.

4. ניתוח נתונים

עקומות כוח שנרשמו מנותחות באמצעות הליך MATLAB מותאם אישית כדי לחשב את נוקשות התא. להלן תיאור קצר של הליך MATLAB:

1. תכנית MATLAB מזהה את נקודת המגע מרכזת Z0 וD0 (ראה איור 1), תוך שימוש באלגוריתם אימצה משיטה שפורסמה על ידי לין ואח' ^29.:
2. עבור כל נקודת נתונים בעקומת כוח, לבצע התאמה ליניארית של הנתונים מהשמאל לנקודת העניין, ודגם שיתאים לרץ הימני (באמצעות נקודה שנבחרה כנקודה הראשונית של מגע), עד לסט כניסה המרבית (200-300 ננומטר מומלץ).
3. עבור כל נקודה, לחשב את שגיאת RMS היחסית של שני ההתקפים ולסכם את הערכים הללו.
4. הנקודה המשיגה את השגיאה הולמת הכוללת מינימאלית שנבחרה היא נקודה הראשונית של קשר.
   הערה: זמן חישוב יכול להיות מופחת על ידי יישום חיפוש זהוב סעיף ולא ליניארי סריקת עקומת כוח כולה.
5. δ עיוות המדגם וindenting כוח F מחושב כ:
   
6. התאמת ריבועים פחותה מוחלת כדי להתאים את ה-F לעומת נתוני δ באזור שלאחר הקשר, z ≥ z _0, למודל הרץ כדי לחלץ מודולוס יאנג של, דואר של התא:
   
   , שבו V הוא היחס של פואסון.
   הערה: כאשר δ הוא יותר מ -10% ממדגם העובי (גובה תא), נוקשות התא נמדדו מושפעת קשיחות המצע. העובי של אזור פרי הגרעיני הוא בדרך כלל על הסדר של כמה מיקרומטרים. לכן, רק את 200-300 ננומטר הראשון של ה-F-δ עקומה הוא מתאים למודל הרץ.

תוצאות

איור 2a מציג שלוש עקומות כוח מייצגות שנלקחו מfibroblasts 3T3 תרבית על משטח פלסטיק, ג'ל polyacrylamide של moduli 3,000 אבא של יאנג ו17,000 אבא, בהתאמה. לאחר זיהוי בזהירות את הנקודות המגע בעקומות, כוח indenting כפונקציה של עיוות תא הוא להתוות איור 2b. תחת כוח בסדר גודל קטן יותר מאשר 0.3 NN, פירמידת כניסות צורת קצה 3 מיקרומטר לתוך תא בתרבית על ג'ל polyacrylamide kPa 3. בניגוד לכך, בכוח יותר מ 1.6 NN הוא נדרש לכניסת 500 ננומטרים לתוך התא גדל על צלחת ה...

דיון

יש שיטת כניסת AFM יתרונות לאפיין תכונות מכאניות של תאי חיים. אם כי פחות רגיש מאשר cytometry המגנטית הפיתול ופינצטה אופטית, שיכול למדוד את הכוחות ברמת piconewton ^32, AFM יכול לזהות כוח התנגדות מדוגמאות הנעות בין עשרות Pico-ניוטון למאות ננו ניוטון, דומות לטווח של כוח ש יכול להיות מיושם על תאים באמצעות micropipette ^19. מגוון זה של כוח מתאים לצרכים ליצור עיוותים מדידים בכל סוגי תאים ^19. הרזולוציה מרחבית הגבוהה הופכת אותו ניתן לאפיין ברמת submicron את h...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחקר מקלט	מיקרוסקופ כוח אטומי	MFP3D-BIO