הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50523

⸱

18 בספטמבר 2013

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

במאמר זה

סיכום

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם חלבוני multidomain אשר לקודד שני GTPase ותחומים קינאז ואשר פוספורילציה בתאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתייג LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות phophorylation הסלולרי הכוללות שלהם.

תקציר

קינאזות אוצין החוזרת עשיר 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs אשר חולק ארגון תחום דומה, לרבות תחום קינאז סרין-תראונין, ראס של תחום חלבונים מורכב (ROC), C-מסוף של תחום ROC (COR), ולאוצין עשיר וחוזר כמו ankyrin-בN-הסופית. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד LRRK2 הוא מעורב בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול לתייג חלבוני LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות זירחון הכוללות של 2 החלבונים האלה בתאים. בקיצור, זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמהשעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנות ובכך רדיואקטיבית. באמצעות תג הזיקה (3xflag) חלבוני LRRK מבודדים ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי לפקח זירחון של כל חלבון אחר שיכול לבוא לידי ביטוי בתאים ומבודד על ידי immunoprecipitation.

מבוא

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs multidomain אשר חולק ארגון תחום דומה. שני החלבונים לקודד רצף GTPase דומה למשפחת ראס של GTPases (ראס של חלבונים מורכבים, או ROC), כמו גם בטרמינל C-של תחום ROC (COR), ביעילות סיווג שני החלבונים למשפחת חלבוני Roco 5,6. N-מסוף של טנדם תחום ROC-COR, שני החלבונים לקודד תחום חוזר לאוצין עשיר, כמו גם תחום כמו ankyrin-, בעוד שרק LRRK2 מקודד ארמדיל נוסף domein 6-8. בטרמינל C-של ROC-COR, שני החלבונים לשתף תחום קינאז סרין-תראונין בעוד שרק LRRK2 מקודד תחום WD40 באזור טרמינל C-8. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד נקודות ראיות גנטיות לתפקיד לLRRK2 בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4.

class = "jove_content"> זירחון של חלבונים הוא מנגנון רגולציה משותף בתאים. לדוגמא, זרחון יכול להיות חיוני להפעלה של אנזימים או לגיוס של חלבונים מורכבים איתות. זירחון הסלולרי של LRRK2 התאפיין בהרחבה ומיפוי phosphosite הראה רוב אתרי זירחון הסלולרי להתרחש באשכול בין חוזר ankyrin ותחומים חוזרים עשירים לאוצין 9-11. למרות שאתרי זירחון הסלולרי LRRK1 עדיין לא ממופים, ראיות ממחקרים באמצעות מכתים phosphoprotein של כתמי חלבון LRRK1 immunoprecipitated של מתאי COS7 מצביעות על כך שחלבון LRRK1 פוספורילציה בתאים 12.

מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת הגנה של מחזור LRRKתוספות באות לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הנוכחי משתמש orthophosphate P-שהכותרת רדיואקטיביים 32 לעקוב זירחון הסלולרי של LRRK2. חשוב לזכור כי כל הפעולות עם חומרים כימיים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאים כדי למזער את החשיפה של קרינה רדיואקטיבית למפעיל ואיכות הסביבה. תרכובות המכילות איזוטופים שפולטות קרינה מייננת יכולות להזיק לבריאות אדם ורישוי מחמיר ותקנות בשליטה ברמה מוסדית ולאומית את השימוש בם. הניסויים בפרוטוקול זה בוצעו לאחר אימון בשימוש בקרינת קוד פתוח מהאוניברסיטה הקתולית של לובן (KU Leuven) ובהתאם להנחיות לתרגול במעבדה טובות הניתנות על ידי מחלקת בריאות, הבטיחות והסביבה באוניברסיטה. מספר צעדים בפרוטוקול שלנו בפריסה רחבה כמו תרבות תאים, SDS-PAGE, מערבי סופג ונתנו כאן פירוט של הפרוטוקול כפי שהוחל במעבדה שלנו. זה זהלציין hould שתנאי ניסוי מדויקים משתנים ממעבדה למעבדה, ולכן צעדים מסוימים על מנת להבטיח טיפול נאות של חומר רדיואקטיבי צריכים להיות מותאמים לכל מעבדה הגדרה חדשה.

שימוש בקרינת קוד פתוח כפופה לאישור רגולטורים לפני והגוף הרגולטורי האחראי על קרינת קוד פתוח במחקר מעבדה משתנה ממדינה למדינה. משתמשים צריכים להתייעץ עם קצין הבטיחות שלהם מוסדי קרינה על מנת להבטיח הליך שמתאימים לכללים ותקנות מקומיים. ניתן למצוא מידע על גופים רגולטוריים: בבלגיה, הסוכנות הפדרלית לפיקוח גרעיני (http://www.fanc.fgov.be, אתר בצרפתית או הולנדי), בבריטניה, הבריאות ובטיחות ההנהלה (http: / / Www.hse.gov.uk / קרינה / מייננת / index.htm), בארצות הברית Nucועדת ליר תקינה (http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html), בקנדה הוועדה הקנדית לבטיחות גרעינית (http://nuclearsafety.gc.ca/eng/), ו בגרמניה דאס Bundesamt für Strahlenschutz (http://www.bfs.de/de/bfs). אמצעי בטיחות רלוונטי לפרוטוקול זה כבר ציין בטקסט, מודגש עם סמל תלתן רדיואקטיבי ( figure-protocol-1 ).

1. תיוג המטבולית של תאים

  1. הכן את התאים לתיוג.
    1. שורות תאי HEK293T התרבות בהתאם לתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C CO, 2 5%) בDMEM עם 8% עוברי עגל בסרום וgentamycin.
    2. הרחב את התאים מספיק כדילהשיג לפחות x 1 10 6 תאים לדגימה לבדיקה.
    3. Trypsinize תאים וצלחת החוצה אל 6 צלחות היטב (35 מ"מ קוטר) ב10 6 תאים / היטב.
    4. 24 שעות לאחר ציפוי את תאים, להביע את חלבון 3xflag-LRRK2 באמצעות transfection או התמרה בתיווך וקטור lentiviral.
      1. עבור transfection, לערבב לדגימה ה-DNA 4 מיקרוגרם (pCHMWS-3xflag-LRRK2 פלסמיד 13-15 או pCHMWS-3xflag-LRRK1 פלסמיד 15) ו -8 μl של polyethyleneimine יניארי (PEI ליניארי, 1 מ"ג / מיליליטר) ל80 DMEM μl (בלי תוספות ). לאפשר למורכב עבור 15-30 דקות לאחר מכן להוסיף את המתחם לתאים על ידי ערבוב גם לתוך הווה בינוני.
      2. לתמרת וקטור בתיווך lentiviral, לדלל וקטור קידוד 3xflag-LRRK1 lentiviral או -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, ככלל אצבע, transduce עם פי שתיים יחידות transducing רבות, דהיינו מספר חלקיקי וקטור הפונקציונליים, של Lentivector כפי שיש תאים) לתוך מדיום התרבות. תיאור של המוצר יון של LV-3xflag-LRRK1 / 2 כבר בעבר תאר 15.
    5. כאשר תאי מחוברות 80-100% (כ 48 שעות לאחר transfection או התמרה), לשטוף תאים עם DMEM prewarmed (37 מעלות צלזיוס) בלי פוספטים.
  2. תאי תווית עם 32 P-Ortho-פוספט.
    1. שמור בעקרונות כלליים את הדעה של בטיחות בעבודה עם קרינה.
      1. figure-protocol-2 לבצע את כל הפעולות עם 32 P באזור קרינה מיועד לכך.
      2. figure-protocol-3 ציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק - פי נוהל עבודה רגיל במעבדה שלנו אלה כוללים חלוק מעבדה, כפפות כפולות ומשקפי מגן.
      3. "Src =" g / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> כל העבודה עם 32 P צריכה להיות מוגן ממשתמשים ב -6 מסכי פרספקס מ"מ כדי לצמצם את החשיפה.
      4. figure-protocol-4 תמיד צריכים להיות בשימוש מכשירי ניטור אישי - בתוך KUL כל המשתמשים קרינת הקוד פתוח מוסמכים לובש תג סרט המצורף לכיס החזה של חלוק המעבדה כדי לפקח על חשיפה לקרינה במהלך ניסויים.
      5. figure-protocol-5 כל המשטחים הניסיוניים יש לבחון לרדיואקטיביות לפני ואחרי השימוש במונה גייגר.
      6. figure-protocol-6 כל החומרים המתכלים שעשוי להיות נגועים צריכים להיות מסולקים בהקפדה על הנחיות מוסדיות לraסילוק פסולת dioactive.
    2. תחת זרימה למינרית, להכין צינור פלקון עם 2.1 מיליליטר של DMEM ללא פוספטים (prewarmed ל37 ° C) לכל צלחת 6 היטב של תאים לתווית.
      1. לדוגמא, לתאי תווית בכל הבארות של צלחת 6 היטב, להכין 12.6 מיליליטר בינוני (= 6 x 2.1). זה הוא לספק ל2 בינוני מיליליטר כדי לשמש לכל גם צלחת 6 היטב של תאים עם עודף של 5% בנפח.
    3. figure-protocol-7 הכן את הספסל שבניסויים בקרינה מייננת יבוצעו. מקום העבודה הוא מכוסה על ידי מחצלת לשפוך עליו אניה המגנה של חומר סופג ממוקמת. במקרה שאתם משתמשים בתוחם עם משטח אחד עמיד למים, למקם אותו בצד עד הסופג.
    4. figure-protocol-8 גם לספק לצנצנת פרספקס במקום העבודה ובמקום הצינור של מדיום נטול פוספט בזה.
    5. figure-protocol-9 קח את המכל מרופד ההובלה בבקבוקון של 32 orthophosphate P שכותרתו מהמקרר ולהביא אותו לספסל הרדיואקטיביות. לפקח על המכל לזיהום רדיואקטיבי חיצוני באמצעות מונה גייגר.
    6. figure-protocol-10 לדלל 32 orthophosphate P שכותרתו לתוך הצינור של DMEM ללא פוספטים בריכוז של 24 μCi / מיליליטר.
      1. הערה: ב2 מיליליטר לכל צלחת 6 היטב היטב של תאים, הדבר מקביל ל 5 μCi 32 P כותרת orthophosphate / 2 סנטימטר של תאים בתרבית.
      2. figure-protocol-11 לשמורהצינור בצנצנת פרספקס.
    7. figure-protocol-12 סגור את המכל עם שארית orthophosphate P כותרת 32 ולהחליף במקרר.
    8. figure-protocol-13 הסר את 6 צלחות היטב עם תאים שכותרתו מהחממה והמקום על ספסל הרדיואקטיביות.
    9. figure-protocol-14 הסר supernatant הבינוני וזורק. הוסף 2 מיליליטר של המדיום נטול פוספט המכיל 32 P הכותרת / טוב orthophosphate.
    10. figure-protocol-15 מקם את צלחות התרבות לתוך תיבת פרספקס לאחר מכן לעקוב אחר מיכל עבורr זיהום רדיואקטיבי חיצוני באמצעות מונה גייגר.
    11. figure-protocol-16 העבר את תיבת פרספקס עם תאים לתא חממת אוקריוטים מוקדשת לתיוג מטבולית איזוטופי.
    12. figure-protocol-17 דגירה של 1-20 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2.
      1. באופן כללי, זמן שילוב של 3 שעות או יותר מומלץ. זמן הדגירה האופטימלי ניתן להעריך באמצעות ניסויים כמובן זמן לכל חלבון מסוים בהתאם לצורך.
    13. figure-protocol-18 אופציונאלי: טיפול בתאים עם מתחם.
      1. בניסויים עם טיפול מורכב (כגון מעכבי קינאז), צעד טיפול מתחם כלול לאחר בitial זמן דגירה מבלי מתחם כדי לאפשר לתיוג. לאחר זמן דגירה הרצוי, תיבת פרספקס המכילה את צלחות התרבות יוסרו מן החממה, והביאה לספסל הרדיואקטיביות.
      2. figure-protocol-19 בינוני תיוג יוסר והוחלף על ידי בינוני פוספט prewarmed החופשי לתוך שהמתחם הוא מדולל בריכוז הרצוי. בטל בינוני בצינור 50 מיליליטר לאיסוף פסולת אשר ממוקם בצנצנת פרספקס.
      3. figure-protocol-20 תאים מוחלפים בתיבת פרספקס והניחו בתא החממה בפעם איש הקשר הרצוי.
  3. figure-protocol-21 לאסוף lysates של Labeתאים הובילו.
    1. figure-protocol-22 הסר בינוני מהתאים וזורקים לתוך צינור האיסוף פסולת אשר ממוקם בצנצנת פרספקס.
    2. figure-protocol-23 יש לשטוף את תאי 2X עם TBS הקר כקרח (טריס 50 מ"מ, NaCl 150 מ"מ, pH 7.4, 2 מיליליטר / שטיפה), השלכת פתרון שטיפה לתוך צינור איסוף פסולת הוצב בצנצנת פרספקס.
    3. figure-protocol-24 הוסף 0.5 מיליליטר של immunoprecipitation הקרח הקרה מאגר תמוגה (IP) זה טוב ולאסוף lysate ידי pipetting lysate למעלה ולמטה על מנת לשחרר את כל תאי lysed.
      1. הכן את הנפח הנדרש של חיץ תמוגה IP (0.5 מיליליטר / מדגם בתוספת עודף של 5%) מבעוד מועד, והוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז ו phosphataseקוקטייל מעכב טרי רק לפני השימוש.
      2. הרכב מאגר תמוגה הוא טריס pH 20 מ"מ 7.5, NaCl 150 מ"מ, EDTA 1 מ"מ, טריטון 1%, גליצרול 10%, מעכבי פרוטאז קוקטייל וקוקטייל מעכב phosphatase.
    4. figure-protocol-25 העבר את lysate לצינור microcentrifuge ולדגור על קרח במשך לפחות 10 דקות.
    5. figure-protocol-26 צנטריפוגה lysates microcentrifuge ב> XG 5,000 10 דקות.
    6. figure-protocol-27 השלך פסולת רדיואקטיבית בפחי אשפה ייעודית אשר מאוחסנים מאחורי מגיני פרספקס.

2. נתח את התיוג של חלבונים של עניין

  1. figure-protocol-28 בודד חלבון של עניין על ידי immunopurification (IP).
    1. figure-protocol-29 העברת צינורות microcentrifuge עם lysates centrifuged חזרה לקרח ופיפטה את supernatant לתוך צינור המכיל microcentrifuge 10 μl מיטת נפח של חרוזים agarose הדגל-M2 equilibrated.
      1. הכן את הצינורות עם חרוזים agarose הדגל-M2 equilibrated לפני הזמן.
      2. לשם כך, פיפטה בנפח של slurry agarose הדגל-M2 המתאים ל10 μl מיטת נפח לדגימה בתוספת עודפת של 5%.
        1. באופן כללי, 10 μl מיטת נפח של חרוזים מתאים ל20 slurry μl. עיין בגיליון הנתונים של המוצר לקבלת פרטים נוספים.
      3. לאזן את חרוזים על ידי שטיפת 3x ב10 כרכים (יחסית למיטה נפח) של חיץ תמוגה ה-IP.
      4. הפיצו חרוזים equilibrated באופן שווה ב10 מיטת נפח / צינור μl לתוך צינורות רבים כמו שיש דוגמאות. תווית הצינורות עם מזהה עבור כל דגימה.
    2. figure-protocol-30 העברת צינורות microcentrifuge 50 צינורות מיליליטר (כ -6 צינור מיליליטר tubes/50 microcentrifuge) שכותרתו עם סמל תלתן רדיואקטיבי ולשמור על קרח.
    3. figure-protocol-31 העברת דגימות למכשיר מסתובב מאחורי מגן פרספקס באזור המיועד של חדר קר מקצה אל קצה ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 1-20 שעות.
    4. figure-protocol-32 העברת הדגימות למקום עבודה ייעודית על קרח.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> ספין למטה החלבון קשור חרוזים agarose הדגל-M2 בmicrocentrifuge (XG 1,000, 1 דקות) וזורקים supernatant לתוך צינור איסוף פסולת.
    6. figure-protocol-33 שטוף את חרוזי agarose חלבון קשור הדגל-M2 על ידי resuspending במאגר לשטוף מיליליטר IP 1.
      1. הרכב של חיץ לשטוף IP: טריס 25 pH מ"מ 7.5, NaCl 400 מ"מ, טריטון 1%. מומלץ לכלול גם מעכבי פרוטאז ו phosphatase בחיץ לשטוף לחלבונים רגישים לפירוק על ידי פרוטאזות שיתוף טיהור או לdephosphorylation ידי phosphatases שיתוף טיהור.
      2. figure-protocol-34 ספין למטה חרוזים החלבון קשור הדגל-M2 agarose בmicrocentrifuge (XG 1,000, 1 דקות) וזורקים supernatant לתוך קולקטיבית פסולתצינור tion.
      3. figure-protocol-35 חזור על השלב לשטוף 3x.
    7. figure-protocol-36 לאחר שטיפה, resuspend את החרוזים לחיץ לשטוף מיליליטר IP 1 (טריס 25 pH מ"מ 7.5, MgCl 2 10 מ"מ, dithiothreitol (DTT) 2 מ"מ, טריטון 0.02%, בטא glycerophosphate 5 מ"מ, Na 3 VO 4 0.1 מ"מ).
    8. figure-protocol-37 ספין למטה חרוזים החלבון קשורים הדגל-M2 agarose בmicrocentrifuge (XG 1,000, 1 דקות) וזורקים supernatant לתוך צינור איסוף פסולת. הסר את כל החיץ העודף.
    9. figure-protocol-38 חרוזים resuspend ל40 & mu; ליטר של חיץ מדגם SDS טעינת ה-IP (טריס-HCl 160 מ"מ pH 6.8, SDS 2%, DTT 0.2 M, 40% גליצרול, 2 מ"ג / מיליליטר כחול bromophenol).
      1. ניתן לנתח דגימות באופן מיידי או מאוחסנות ב-20 ° C מקפיא לניתוח נסתר.
        1. figure-protocol-39 לאחסון של דגימות ב -20 דגימות C °, מקום במחזיקי צינור או תיבות בקופסא של פרספקס במקפיא שכותרתו רדיואקטיבית סמל תלתן המוקדש לאחסון של דגימות רדיואקטיבי.
    10. figure-protocol-40 השלך פסולת רדיואקטיבית בפחי אשפה ייעודית אשר מאוחסנים מאחורי מגיני פרספקס.
  2. figure-protocol-41 לפתור דגימות ה-IP באמצעות SDS-PAGE וbloלא קרום PVDF.
    1. figure-protocol-42 דגימות מחמם בחיץ טעינה ל-C ° 95 למשך 2 דקות ו צנטריפוגות 1 דקות ב> 1,000 XG כדי גלולה את החרוזים.
    2. figure-protocol-43 הכן את מודול ג'ל אלקטרופורזה החלבון על ספסל הרדיואקטיביות מאחורי מסך פרספקס.
    3. figure-protocol-44 דגימות עומס על ג'לי-SDS טריס יצטט 3-8%.
      1. סוג זה של ג'ל מתאים לפתרון במשקל מולקולרי גבוה (HMW) חלבונים. סוגים אחרים ג'ל גם יכולים להיות מתאימים, כגון 4-20% ג'ל Bis-tricine או ג'לי 4-20% טריס-גליצין.
      2. כולל סמן משקל מולקולרי אשר מתאים להבחין בגדלים של חלבוני HMW.
    4. figure-protocol-45 לבצע אלקטרופורזה ב150 V במשך שעה 1.
    5. figure-protocol-46 לאחר אלקטרופורזה, להסיר את הג'ל ממעטפת הפלסטיק שלה ולהעביר את הג'ל למכל עם חיץ העברה מערבי סופג.
      1. הרכב של חיץ העברה מערבי סופג: טריס 50 מ"מ, גליצין 40 מ"מ, SDS 0.04%, מתנול 20%.
      2. figure-protocol-47 חותכים את החלקים של ג'ל שיבלוט כגון מפרידים היטב וחלק תחתון של ג'ל שבולט.
    6. קרום להכין פלואוריד polyvinylidene אחד (PVDF) לג'ל על ידי הטבילה במתנול דקות 1, ואז למקם את חיץ העברה.
      1. קרומים נחתכים לים גודל Ame כמו ג'ל בתוספת מרווח של 3 מ"מ.
    7. הנח מודול סופג חצי יבש על ספסל הרדיואקטיביות ולהסיר את הכיסוי וצלחת אלקטרודה עליונה.
    8. figure-protocol-48 הכן את הכריך סופג על פני השטח של המודול סופג חצי היבש.
      1. הרטב עבה במיוחד (2.5 מ"מ עובי, 7.5 x 10 סנטימטר גדול) סופג מסנן במאגר העברה ומניחים על צלחת תחתונה של מודול הסופג.
      2. figure-protocol-49 מניחים את קרום PVDF מראש רטוב על המסנן הסופג.
      3. figure-protocol-50 בזהירות להניח את הג'ל על קרום PVDF ולהסיר כל בועות אוויר.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> השלם את כריך הכתם על ידי הרטבת מסנן סופג עבה נוסף במאגר העברה ומניחים על הצלחת התחתונה של מודול הסופג. הסר את כל האוויר בועות סופו של דבר בהווה בכריך הסופג.
        שים לב שהתיאור שניתן כאן הוא תואם את מערכת SD טרנס כתם BioRad בי אלקטרודות הן כאלה שחלבונים נודדים כלפי מטה על הממברנה. מערכות סופגות אחרות הן גם תואמים את השלבים הבאים בעיבודים קלים כגון אלו הנדרשים סופו של דבר לקחת בחשבון עוד כיוון סופג או, במקרה של סופג טנק, פסולת נוזלית נוספת כדי להיות מסולקים באותה הצורה כמו חיץ אלקטרופורזה לעיל.
    9. figure-protocol-51 הסר את כל עודפי החיץ עם רקמה סופגת ומניח את הצלחת העליונה וכיסוי של חצי ד ר"י סופג מודול.
    10. figure-protocol-52 העבר את החלבונים ב15 V עבור 1-2 שעות.
    11. figure-protocol-53 במהלך הזמן הזה, לנקות את מודול אלקטרופורזה.
      1. figure-protocol-54 השלך פסולת רדיואקטיבית בפחי אשפה ייעודית אשר מאוחסנים מאחורי מגיני פרספקס.
      2. figure-protocol-55 יש לשטוף את מודול אלקטרופורזה עם מים מזוקקים (לספירה) וזורקים את מי שטיפה במכל פסולת הנוזלי רדיואקטיבי.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> לאחר העברה, להסיר את קרום PVDF עם חלבונים מוספגים ממודול הסופג.
    13. figure-protocol-56 אופציונאלי: לבצע צביעת Ponceau S של חלבונים מחקו לדמיין חלבונים.
      1. figure-protocol-57 העבר את הכתם לכלי דגירה כתם רדוד המכיל פתרון Ponceau S ו דגירה במשך 5 דקות.
      2. figure-protocol-58 יש לשטוף 2x במהירות בספירה.
    14. figure-protocol-59 ייבש את הממברנה.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> בצע autoradiography.
    1. figure-protocol-60 לחשוף את הקרום לצלחת זרחנית ל1-5 ימים.
    2. figure-protocol-61 קראו 32P הנחה של הצלחת זרחנית נחשפה באמצעות סורק זרחני סטורם 840 או שווה ערך ולשמור את התמונה כקובץ TIFF ברזולוציה גבוהה.
  4. figure-protocol-62 זיהוי רמות חלבון באמצעות immunodetection.
    1. figure-protocol-63 רעננותם ממברנות על ידי טבילתם בקצרה למתנול, ולאחר מכן להעביר לכלי דגירה כתם רדוד עם PBS.
    2. figure-protocol-64 לחסום את הקרומים ב-PBS-T (PBS עם 0.1% Triton) המכיל 5% חלב.
    3. figure-protocol-65 דגירה הכתמים עם 13,16 אנטי LRRK2 נוגדנים או נוגדני דגל אנטי ותהליך נוסף עם צעדים לשטוף מתאימים ודגירת נוגדנים משני.
    4. figure-protocol-66 לבצע זיהוי chemiluminescence כדי לאשר את רמות החלבון היחסית של LRRK2.
  5. לכמת שילוב של 32 P בLRRK2.
    1. ביצוע ניתוח densitometric של הלהקות בautoradiograms הכתם וimmunoreactivity באמצעות תוכנה מתאימה כמו תוכנת ImageJ, תכנית זמינה תוכנה חופשית במוסד 'הלאומיאוטי של אתר בריאות (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. חישוב רמות התאגדות פוספט כיחס בין אות autoradiographic מעל רמת immunoreactivity.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על מנת להשוות רמות זירחון הכוללות של LRRK1 וLRRK2 בתאים, 3xflag מתויג LRRK1 וLRRK2 בא לידי ביטוי בתאי HEK293T 15. תאים בתרבית 6 צלחות היטב ומסומן עם 32 P ונותחו כפי שתוארו לעיל בטקסט הפרוטוקול. איור 1 מציג תוצאות נציג לתיוג המטבולית של LRRK1 וLRRK2 בתאי HEK293T. התאגדות פוספט רדיואקטיבי הוא ציינה עבור שתי LRRK1 וLRRK2. על כימות של הרמות מנורמלות לרמות החלבון, כפי שנמדד על ידי ניתוח densitometric של immunodetection עם נוגדן אנטי דגל

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש מחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים גם למייקל ג'יי פוקס קרן תמיכה במחקר זה. אנו מודים לקרן המחקר - פלנדריה FWO (פרויקט FWO G.0666.09, מלגת חוקר בכירה לJMT), Neuro-TARGET פרויקט IWT SBO/80020, לובן KU (OT/08/052A וIOF-KP/07 / 001) על תמיכתם. מחקר זה נתמך גם בחלקו על ידי קרן Druwé-Eerdekens מנוהל על ידי קרן המלך בודואן לJMT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זרחן-32 רדיונוקליד, 1 mCi, חוצץ דיסודיום-פוספט ב-1 מ"ל מיםפרקין אלמרNEX011001MC
Dulbecco’ s מדיום נשר שונה (D-MEM) (1X), נוזלי (גלוקוז גבוה)Invitrogen11971-025מדיום זה אינו מכיל פוספטים
Anti Flag M2 affiinty gelSigmaA2220למוצר שווה ערך עם ג'ל בצבע אדום (שימושי להמחשת החרוזים ביתר קלות), השתמש בחתול. מס' F2426.
פילטר ספיגה עבה במיוחדBio-Rad1703965
Ponceau S SolutionSigmaP7170

מקורות

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158(2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472(2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16(2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153(2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

LRRK1 LRRK2שיקוע חיסוני (Immunoprecipitation)SDS-PAGEאוטורדיוגרפיהWestern Blotתאי HEK293Tאנליזת פוספורילציהגילוי רדיו-איזוטופי
מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.