לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

סיכום

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa ^{2 +,} sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

תקציר

פציעת קרום פלזמה היא אירוע תכוף, ופצעים צריכים להיות מתוקנים במהירות כדי להבטיח את הישרדות סלולרית. זרם של Ca ^{2 +} הוא אירוע איתות מרכזי שמפעיל את התיקון מפצעים מכאניים על קרום הפלזמה בתוך ~ 30 שניות. מחקרים שנעשה לאחרונה גילו כי בתאי יונקים גם לאטום קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם נקבובית ויוצר רעלים בCa ^{2 +} תלוי תהליך שכרוך exocytosis של sphingomyelinase חומצת אנזים lysosomal אחרי אנדוציטוזה הנקבובית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ששמשה כדי להדגים שהודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized ידי O streptolysin הרעל הוא גם מהירים ותלויים Ca ^{2 +} זרם. עיצוב assay מאפשר סינכרון של אירוע פציעה ומדידה קינטית מדויקת של היכולת של תאים כדי לשחזר את שלמות קרום פלזמה על ידי הדמיה וכימותים על ידי שצבע liphophilic FM1-43 מגיע קרומים תאיים המידה. als assay החי זהo מאפשרת הערכה רגישה ליכולתה של אקסוגני הוסיפה גורמים מסיסים כגון sphingomyelinase לעכב זרם FM1-43, המשקפת את היכולת של תאים לתיקון קרום הפלזמה שלהם. assay זה אפשר לנו להראות בפעם הראשונה שsphingomyelinase פועל במורד הזרם של ² exocytosis ⁺ תלוי Ca, שכן בנוסף תאי של האנזים מקדם הודבק מכתבים מחדש של תאי permeabilized בהעדר Ca ^{2 +.}

מבוא

זה כבר ידוע במשך כמה עשורים שתיקון קרום פלזמה לאחר פגיעה מכאנית הוא ^1,2 Ca ^{2 +} תלוי תהליך. מאוחר יותר מחקרים הראו כי זרם Ca ^{2 +} דרך הפצע מפעיל תהליך נמרץ של exocytosis של שלפוחית ​​תאית באתר של פציעה, אשר נדרש לresealing ^3,4. שיעור ההפסד של צבע פלואורסצנטי נטען לתוך הציטופלסמה של תאים שימש להערכה מהירה של תיקון, והגיע למסקנה כי resealing הושלם בתוך <30 שניות לאחר פציעה ^5. שני דגמים בתחילה הוצעו כדי להסביר את הדרישה לexocytosis בתיקון קרום פלזמה: 1) מודל "התיקון", שהציע כי Ca ^{2 +} זרם דרך הנגע מפעיל היתוך תחילה homotypic של שלפוחית ​​תאית, ויוצר "תיקון" גדול שהיית ....

פרוטוקול

1. תעתיק השתקה של ASM

1. זרעים 1.5 x 10 ⁵ תאי הלה ב2 מיליליטר של תקשורת צמיחת DMEM (גלוקוז גבוהה DMEM עם 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פן סטרפטוקוקוס) על מנות תחתית כוס 35 מ"מ (MatTek) ו דגירה לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO _2.
2. ביום שלאחר מכן, לשאוב את תקשורת הצמיחה ולהחליף אותו עם מדיום DMEM 2 מיליליטר מופחת סרום (DMEM עם 4% FBS), שעה לפחות 1 לפני הוספת תערובת transfection siRNA.
3. הכן 4 צינורות לתערו....

תוצאות

ריכוזים נמוך של תיקון קרום פלזמה הצלת sphingomyelinase (SM) חיידקים בתאים מדולדלים בsphingomyelinase חומצת lysosomal.

באמצעות assay ההדמיה FM1-43, הראינו בעבר כי תאים לקויים לASM אנזים lysosomal ונחשפו לSLO פצע בנוכחות של Ca ^{2 +} להיות בעל מום קרום פלזמה הוא חולץ על ידי בנוסף תאי של האנזים האנושי רקומביננטי ^19. מאז ASM lysosomal האדם יש אופטימלי pH נמוך, אנחנו בדקנו אם resealing יכול גם להיות מש.......

דיון

מחקרים קודמים על תיקון פגיעה וקרום פלזמה מכאני הסתמכו על מנגנונים שונים של תאים ופצעו, החל מהטלת חרוזי זכוכית, micropipetting, גז, שריטות או גירוד. את ההודעה של כל מבחני האלה היה איכותיים ולא כמוני, ולא לתת מידע מדויק על קינטיקה של מנגנון התיקון. היכולת של תאי reseal קרום הפלזמה שלהם אחרי צורות של פגיעה באלה נמדדה על ידי הנוכחות או עדר של קליעים נותבים הוסיפו לנוזל החוץ תאי בציטופלסמה, החדירה של צבעים בלתי חדירים קרום, אובדן של אנזימי cytosolic, רמות ה-ATP, או לטווח ארוך הישרדות ס.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Reagent
HeLa 229 קו תאים	ATCC	CCL2-1
DMEM גלוקוז גבוה	Invitrogen	11965
DMEM גלוקוז גבוה ללא סידן	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem סרום מופחת	Invitrogen	31985
ליפופקטמין RNAiMax	Invitrogen	13778
מדיום בקרה תכולת GC RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
סרום בקר עוברי	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase מ-Bacillus cereus	Sigma	S7651
כלי זכוכית תחתונים 35 מ"מ	MatTek	P35G-0-14
<חזק>חומר
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	Eclipse Ti
מצלמה	Hamamatsu Photonics	C9100-50
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב	PerkinElmer	UltraViewVoX
ניתוח תוכנה תוכנה	PerkinElmer	Volocity Suite
סביבתי	פתולוגיה מכשירים	תא מערכת

מופעל בחום תא LiveCell