לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

סיכום

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa ^{2 +,} sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

תקציר

פציעת קרום פלזמה היא אירוע תכוף, ופצעים צריכים להיות מתוקנים במהירות כדי להבטיח את הישרדות סלולרית. זרם של Ca ^{2 +} הוא אירוע איתות מרכזי שמפעיל את התיקון מפצעים מכאניים על קרום הפלזמה בתוך ~ 30 שניות. מחקרים שנעשה לאחרונה גילו כי בתאי יונקים גם לאטום קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם נקבובית ויוצר רעלים בCa ^{2 +} תלוי תהליך שכרוך exocytosis של sphingomyelinase חומצת אנזים lysosomal אחרי אנדוציטוזה הנקבובית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ששמשה כדי להדגים שהודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized ידי O streptolysin הרעל הוא גם מהירים ותלויים Ca ^{2 +} זרם. עיצוב assay מאפשר סינכרון של אירוע פציעה ומדידה קינטית מדויקת של היכולת של תאים כדי לשחזר את שלמות קרום פלזמה על ידי הדמיה וכימותים על ידי שצבע liphophilic FM1-43 מגיע קרומים תאיים המידה. als assay החי זהo מאפשרת הערכה רגישה ליכולתה של אקסוגני הוסיפה גורמים מסיסים כגון sphingomyelinase לעכב זרם FM1-43, המשקפת את היכולת של תאים לתיקון קרום הפלזמה שלהם. assay זה אפשר לנו להראות בפעם הראשונה שsphingomyelinase פועל במורד הזרם של ² exocytosis ⁺ תלוי Ca, שכן בנוסף תאי של האנזים מקדם הודבק מכתבים מחדש של תאי permeabilized בהעדר Ca ^{2 +.}

מבוא

זה כבר ידוע במשך כמה עשורים שתיקון קרום פלזמה לאחר פגיעה מכאנית הוא ^1,2 Ca ^{2 +} תלוי תהליך. מאוחר יותר מחקרים הראו כי זרם Ca ^{2 +} דרך הפצע מפעיל תהליך נמרץ של exocytosis של שלפוחית ​​תאית באתר של פציעה, אשר נדרש לresealing ^3,4. שיעור ההפסד של צבע פלואורסצנטי נטען לתוך הציטופלסמה של תאים שימש להערכה מהירה של תיקון, והגיע למסקנה כי resealing הושלם בתוך <30 שניות לאחר פציעה ^5. שני דגמים בתחילה הוצעו כדי להסביר את הדרישה לexocytosis בתיקון קרום פלזמה: 1) מודל "התיקון", שהציע כי Ca ^{2 +} זרם דרך הנגע מפעיל היתוך תחילה homotypic של שלפוחית ​​תאית, ויוצר "תיקון" גדול שהיית לאחר מכן ניתן יהיה להחיל את קרום הפלזמה ללאטום את הפצע ⁶ ו 2) מודל הפחתת מתח, אשר הציע כי adde הקרוםד על ידי ² exocytosis ⁺ תלוי Ca באזור הפצע הייתי להפחית את מתח קרום פלזמה, בהנחיית הודבקה מכתבים מחדש של bilayer ^7. התפקיד של ² exocytosis ⁺ מופעל-Ca בתיקון קרום פלזמה התחזק עוד יותר על ידי מחקרים המראים כי lysosomes מכיל מולקולת Ca ^{2 +} חיישן, synaptotagmin שביעי, המאפשרת exocytosis ותיקון קרום פלזמה בתאים נפצעו ^8,9,10,11 .

עם זאת, ראיות נוספות ציינו כי exocytosis לבד לא הייתה מספיק כדי לקדם את תיקון קרום פלזמה. בנוסף לדמעות מכאניות על קרום הפלזמה, צורה שכיחה של פגיעה בתא היא permeabilization ידי רעלים יוצרים נקבוביות המיוצרים על ידי חיידקים ^12,13 או תאים חיסוניים ^14,15. שלא כמו דמעות מכאניות, חלבוני יוצרים נקבוביות להכניס את עצמם בקרום הפלזמה יוצרים נקבובית שלא ניתן resealed פשוט על ידי יישום "תיקון" קרום או על ידי reduc יציב, מרופד בחלבוןing מתח קרום. מסקרן, מחקרים גילו כי יש לי תאי יונקים מנגנון יעיל כדי לתקן את קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, ותהליך זה דורש גם את הנוכחות של Ca ^{2 + 12} תאיים. ממצא זה העלה את השאלה האם ההסרה נקבובית הטרנסממברני מתא השטח הייתה גם תהליך מהיר, כפי שנצפה עם פצעים מכאניים ^5. באופן מפתיע, המחקרים האחרונים שלנו גילו כי הודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized עם רעלים יוצרים נקבוביות יש מאפיינים דומים מאוד לתיקון של פצעים מכאניים: התהליך דורש תאי Ca ^{2 +,} והוא יושלם תוך ~ 30 שניות. חוקר את התהליך הזה בפירוט רב יותר, נודע לנו לאחרונה כי בנוסף לCa ^{2 +} exocytosis המוסדר של lysosomes, תיקון קרום פלזמה כרוך צורה מהירה של אנדוציטוזה, אשר מופעלת על ידי שחרורו של lysosomal אנזים sphingomyelinase חומצה (ASM) והוא חיוני לא רק עבור ההסרת דואר של נקבוביות הטרנסממברני, אלא גם לתיקון של פצעים מכאניים ^16.

כדי לקבוע את קינטיקה של תא הודבק מכתבים מחדש לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, במעבדה שלנו אנו הותאמו המתודולוגיה הדמיה חיה שהיה בשימוש בעבר כדי להעריך הודבק מכתבים מחדש של סיבי שריר מבודדים-נפצע לייזר ^17. assay זה מסתמך על מאפיינים של הצבע lipophilic FM1-43, שintercalates יציבות לעלון החיצוני של bilayers שומנים וגוברים בעוצמת הקרינה. כאשר bilayer קרום הפלזמה מופר מקבלת גישה לצבוע תאית לקרומים תאיים, מתן assay רגיש כדי לזהות פציעת קרום פלזמה ולתקן ^18,16,19,20. להסתגל assay זה להערכת הודבק מכתבים מחדש תא לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, אנו מראש מודגרות-תאים ב 4 ° C עם O חיידקי streptolysin רעלן (SLO), אשר נקשר לכולסטרול קרום ^21. תא סינכרוניpermeabilization אז יכול להיות מושגת בקלות על ידי הזזת התאים מקרח להתחמם בינוני בבמת מיקרוסקופ מחוממת, אשר מפעילה את oligomerization ושינוי בקונפורמציה שמוביל לtransmembrane היווצרות נקבובית. יתרון של גישה זו, על מבחני שפורסמו בעבר באמצעות פציעת לייזר, הוא שמספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח בו זמנית בשדה מיקרוסקופי, מתן דגימה טובה יותר של אוכלוסיית התאים. בהתחשב בדמיון מכניסטית בין התהליך הודבק מכתבים מחדש תא ראה לאחר פציעה מכאנית וpermeabilization עם רעלים יוצרים נקבוביות, assay אנו מתארים כאן מספק שיטה מאוד תכליתית ורבה עוצמה עבור לנתח גורמים מעורבים בתהליך היסודי של תיקון קרום פלזמה. כדוגמא, אנו מראים כי ניתן להשתמש assay זה לזהות צעדי Ca ^{2 +} תלויים ובלתי תלויים בתהליך התיקון.

פרוטוקול

1. תעתיק השתקה של ASM

1. זרעים 1.5 x 10 ⁵ תאי הלה ב2 מיליליטר של תקשורת צמיחת DMEM (גלוקוז גבוהה DMEM עם 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פן סטרפטוקוקוס) על מנות תחתית כוס 35 מ"מ (MatTek) ו דגירה לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO _2.
2. ביום שלאחר מכן, לשאוב את תקשורת הצמיחה ולהחליף אותו עם מדיום DMEM 2 מיליליטר מופחת סרום (DMEM עם 4% FBS), שעה לפחות 1 לפני הוספת תערובת transfection siRNA.
3. הכן 4 צינורות לתערובת transfection אוליגו siRNA. בצינורות A ו-C, להוסיף סרום מופחת 250 OptiMEM μl ו4 μl Lipofectamine RNAiMax, ל35 מנה מ"מ להיות transfected. בצינור B, להוסיף 250 μl של OptiMEM מופחת סרום ו8 μl (160 pmoles) השליטה אוליגו תוכן GC הבינוני (הבקרה siRNA), ל35 מנה מ"מ להיות transfected. בצינור D, להוסיף 250 μl של OptiMEM מופחת סרום ו8 μl (160 pmoles) של אוליגו SMPD1 (siASM), ל35 לא מנה מ"מo להיות transfected. דגירה הצינורות בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
4. לשלב צינורות A ו-B ליצירת מורכב transfection לבקרה siRNA, וצינורות C ו-D לsiRNA ASM. דגירה התגובות בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
5. מוסיף את תערובות הבקרה siRNA ו ASM siRNA תגובת transfection לאט, dropwise, למאכלי תחתית כוס 35 מ"מ המתאים ולדגור על 37 ° C / 5% CO _2. ב24 לאחר transfection שעות, לשאוב בעדינות את תקשורת ולהחליף עם תקשורת צמיחת DMEM טרי. למציאת ASM יעילה, המנות צריכה להיות מודגרות נוספות על 37 ° C / 5% CO ₂ למשך כשעות ביום 31 (סה"כ 55 hr) לפני הדמיה בשידור חי.

2. הכנת ריאגנטים לחיים מיקרוסקופית

1. הכן פתרון של הרעלן יוצרים הנקבובית רקומביננטי Streptolysin O (SLO) בריכוז של 100 ng / μl בקור 1x PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +.} SLO בשימוש במבחנים אלה הוא constitutivelהמוטציה y פעילה ציסטאין שאינו דורשת צמצום סוכנים לפעילות, ובלבד באדיבות על ידי ד"ר רוד Tweten, אוניברסיטת אוקלהומה. רעלן בא לידי ביטוי בE. coli BL21 DE3 ומטוהר בתנאים מקומיים, כפי שתואר לעיל ^16.
2. הכן את פתרון מניות FM1-43: FM1-43 אבקת lyophilized Resuspend ב DMSO כדי ליצור פתרון 25 מ"מ.
3. הכן את הפתרון: לדלל את פתרון מניות FM1-43 בDMEM הקר עם Ca ^{2 +} לריכוז סופי של 4 מיקרומטר (1.5 מיליליטר יש צורך לכל צלחת MatTek) ולאחסן על קרח עד צורך.
4. הכן את הפתרון ב ': לדלל את פתרון מניות FM1-43 בDMEM הקר ללא Ca ^{2 +} ו10 מ"מ EGTA (Ca ^{2 +} ללא DMEM) לריכוז סופי של 4 מיקרומטר (1.5 מיליליטר דרוש לכל צלחת MatTek) ולאחסן על קרח עד צורך.
5. טרום חם (37 מעלות צלזיוס) 1 מיליליטר aliquots של הפתרון ופתרון B בצינורות Eppendorf.
6. שמור על פתרונות קרח של DMEM עם Ca ^{2 +,} ו-CDMEM ² ללא ^+.

3. תא חי הדמיה של פליטה FM1-43 לSLO מטופלים ותאים שלא טופלו

1. מלא מיכל מתכת רדוד בגודל בינוני עם קרח כתוש, להפוך אותו למכל זכוכית גדול עם קרח, ולהוסיף קרח נוסף עוזב את המשטח התחתון בלבד של מיכל המתכת החשוף. הנח מגבת נייר רטובה בתחתית המתכת חשופה, כדי לאפשר העברה אפילו תרמית.
2. קח אחד מנה שטופל siRNA הבקרה MatTek (לדוגמא 1) ולמקם אותו במגבת נייר הרטובה והקרה. בעדינות לשאוב את כל המדיה ולשטוף 3x עם Ca ² DMEM ⁺ ללא קר. לאחר השטיפה האחרונה, לשאוב את כל אמצעי התקשורת בצלחת.
3. לתמונה הקשורים תא FM1-43 בתאים ללא פציעת SLO (לדוגמא 1) בנוכחות של Ca ^{2 +,} להוסיף 180 μl של פתרון קר 'לcoverslip זכוכית מרכז צלחת הזכוכית התחתונה 35 מ"מ ודגירה של 5 דקות על קרח (טבלה 1).
4. מניחים צלחת MatTek על הבמה של מיקרוסקופ confocal מחומם ל37 מעלות צלזיוס ומצוידים בתא סביבתי (ששומר על טמפרטורה, לחות _ו2 רמות CO). מצא את תחום התאים שיהיו צילמו מחפשים דרך אובייקטיבי 1.3 40X NA (ניקון). אם זמין, הפעל את PerfectFocus או מכשיר דומה כדי לתקן את סחיפה תרמית.
5. הוסף 1 מיליליטר של פתרון prewarmed בעדינות לצד השני של צלחת 35 מ"מ ולהחליף את הכיסוי של תא סביבתי (טבלה 1).
6. לרכוש תמונות למשך 4 דקות במסגרת 1 כל 3 שניות באמצעות תוכנת הדמיה מתאימה (Volocity במערכת מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובב UltraView ווקס פרקין אלמר). עירור של FM1-43 מושגת באמצעות קו לייזר 488 ננומטר באמצעות מסנן dichroic עם להקה לעבור 488 ננומטר, ואפליה פליטה מושגת באמצעות שימוש במסנן 527 פליטה (W55). רמות כוח הלייזר ורגישות מצלמה נקבעות על מנת להשיג חשיפת תמונה של 100 אלפיות שניים.
7. חזור על שלבים 3.2-3.6 לזהות FM1-43 בתאים שטופלו ב-siRNA בקרה ללא פציעת SLO (דוגמא 2) בהעדר Ca ^{2 +,} חוץ מזה ב3.5 פתרון B צעד יש להוסיף (טבלת 1).
8. כדי למדוד את זרם FM1-43 לתאים שטופלו ב-siRNA הבקרה פצוע עם SLO או בנוכחות (לדוגמא 3) או העדרה של Ca ^{2 +} (דוגמא 4), להוסיף 180 μl של פתרון ב 'קר המכיל SLO לcoverslip זכוכית מרכז צלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה ודגירה במשך 5 דקות על קרח כמו בשלב 3.3. חזור על שלבים 3.2 דרך 3.6; להתאים הוספה או פתרון או פתרון B בשלב 3.5 (טבלה 1).
9. כדי לקבוע את תפקידו של ASM בתיקון קרום פלזמה, חזור על שלבים 3.2-3.6 שימוש בתאים שטופלו siRNA ASM לכל התנאים (דוגמאות 5-8) (טבלת 1).
10. כדי לקבוע את תפקידו של sphingomyelinase תאי רקומביננטי (SM) עלקינטיקה של תיקון קרום פלזמה (באה לידי ביטוי בעיכוב בזרם FM1-43) (דוגמאות 9-10), SM מתווספת (0-50 μU) לאו פתרון או פתרון B בשלב 3.5 ולאחר מכן הוסיף לתאים במהלך תא חי הדמיה בנפח כולל של 1 מיליליטר (טבלת 1).

4. כימות פליטת FM1-43 לתוך תאים

1. אחרי הסרטים נרכשו, למדוד את עוצמת הקרינה תאית של FM1-43 באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (Volocity Suite, PerkinElmer). צייר אזור של עניין באזור cytosolic של כל תא בתחום וליישם את כלי תוכנה כדי לקבוע את עוצמת הקרינה FM1-43 הממוצעת בכל המסגרות של הווידאו.
2. כדי להתאים לשינויים בכתמי FM1-43 הראשוניים, הנתונים עבור כל סרטון וידאו מתבטא כגידול של פי בעוצמת הקרינה לאורך זמן, ולהתוות לכל מצב אחר. הגידול של פי בקרינה של כל timepoint הבודד לכלתא מחושב כF _T / ₀ F, כאשר F _T הוא הקרינה הממוצעת בtimepoint הספציפי, וF ₀ הוא הקרינה הממוצעת בזמן t = 0 (איורים 1-2).

תוצאות

ריכוזים נמוך של תיקון קרום פלזמה הצלת sphingomyelinase (SM) חיידקים בתאים מדולדלים בsphingomyelinase חומצת lysosomal.

באמצעות assay ההדמיה FM1-43, הראינו בעבר כי תאים לקויים לASM אנזים lysosomal ונחשפו לSLO פצע בנוכחות של Ca ^{2 +} להיות בעל מום קרום פלזמה הוא חולץ על ידי בנוסף תאי של האנזים האנושי רקומביננטי ^19. מאז ASM lysosomal האדם יש אופטימלי pH נמוך, אנחנו בדקנו אם resealing יכול גם להיות מש...

דיון

מחקרים קודמים על תיקון פגיעה וקרום פלזמה מכאני הסתמכו על מנגנונים שונים של תאים ופצעו, החל מהטלת חרוזי זכוכית, micropipetting, גז, שריטות או גירוד. את ההודעה של כל מבחני האלה היה איכותיים ולא כמוני, ולא לתת מידע מדויק על קינטיקה של מנגנון התיקון. היכולת של תאי reseal קרום הפלזמה שלהם אחרי צורות של פגיעה באלה נמדדה על ידי הנוכחות או עדר של קליעים נותבים הוסיפו לנוזל החוץ תאי בציטופלסמה, החדירה של צבעים בלתי חדירים קרום, אובדן של אנזימי cytosolic, רמות ה-ATP, או לטווח ארוך הישרדות ס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Reagent
HeLa 229 קו תאים	ATCC	CCL2-1
DMEM גלוקוז גבוה	Invitrogen	11965
DMEM גלוקוז גבוה ללא סידן	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem סרום מופחת	Invitrogen	31985
ליפופקטמין RNAiMax	Invitrogen	13778
מדיום בקרה תכולת GC RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
סרום בקר עוברי	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase מ-Bacillus cereus	Sigma	S7651
כלי זכוכית תחתונים 35 מ"מ	MatTek	P35G-0-14
<חזק>חומר
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	Eclipse Ti
מצלמה	Hamamatsu Photonics	C9100-50
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב	PerkinElmer	UltraViewVoX
ניתוח תוכנה תוכנה	PerkinElmer	Volocity Suite
סביבתי	פתולוגיה מכשירים	תא מערכת

מופעל בחום תא LiveCell