מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

סיכום

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה ב In vivo הקשר. מכתים Immunofluorescent לדמיין במדויק מקלעת כלי הדם הוא מכריע להצלחה של סוגים של מחקרים אלה.

תקציר

אנגיוגנזה היא התהליך המורכב של היווצרות כלי דם חדשה שהוגדרה על ידי ההנבטה של ​​כלי דם חדשים מכלי רשת קיימת מראש. אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מרכזי לא רק בהתפתחות נורמלית של איברים ורקמות, אלא גם במחלות רבות שבן היווצרות כלי דם היא dysregulated, כגון סרטן, עיוורון ומחלות איסכמי. בחייו בוגרים, כלי דם הם בדרך כלל שקטים כל כך אנגיוגנזה היא היעד חשוב לפיתוח תרופה חדשני כדי לנסות ולווסת את היווצרות כלי חדשה במיוחד במחלה. כדי להבין טוב יותר את אנגיוגנזה ולפתח אסטרטגיות מתאימות כדי להסדיר את זה, מודלים נדרשים שמשקפים במדויק את הפעולות הביולוגיות השונות כי הם מעורבים. רשתית ילוד העכבר מספקת מודל מצוין של אנגיוגנזה כי עורקים, ורידים ונימים לפתח כדי ליצור מקלעת כלי דם בשבוע הראשון לאחר לידה. מודל זה יש גם את היתרון שיש שתי דימבנה mensional (2D) מה שהופך את הניתוח פשוט לעומת האנטומיה 3D המורכבת של רשתות כלי דם אחרות. על ידי ניתוח של כלי דם ברשתית מקלעת בזמנים שונים לאחר לידה, ניתן לקיים את השלבים השונים של אנגיוגנזה מתחת למיקרוסקופ. מאמר זה מדגים הליך פשוט לניתוח בכלי הדם של רשתית באמצעות עכבר מכתים ניאון עם נוגדנים ספציפיים isolectin וכלי דם.

מבוא

אנגיוגנזה היא תהליך התפתחותי מורכב שהוגדר על ידי היווצרות של כלי דם חדשים מרשת כלי קיים והוא מוסדר על ידי מספר מסלולי איתות. הבולט ביותר של אלה הוא מסלול VEGF. VEGF הוא שוחרר על ידי תאי איסכמי ומוביל לייזום של angiogenic הנבטה בכלי דם סמוכים. התא האנדותל בכלי הדם המוביל מחיטה חדש הוא התא 'קצה', אשר מייצר filopodia שלהושיט יד לעבר המקור של VEGF, ואחריו מתרבה תאי האנדותל "גבעול". בדרך זו, תאי האנדותל המופעלים להגר ומתרבים לכיוון אזור בו הם יוצרים avascular צינורות כלי דם חדשים. על מנת לייצב את הצינורות אלה כדי לתמוך בזרימת דם, תאי האנדותל אינטראקציה עם pericytes ותאי שריר חלק, המקיפים את כלי הדם החדשים ^1. אנגיוגנזה היא חיונית לכלי דם של העובר ורקמות גדלות. עם זאת, היא גם תורמת לרבים pathologiהפרעות cal כגון סרטן, ואילו פגמים באנגיוגנזה קשורים למחלות איסכמי. הפיתוח של טיפולים תרופתיים יעילים לויסות אנגיוגנזה כאמצעי לטיפול במחלה הוא אפוא עניין רב. לדוגמה, גורמים אנטי angiogenic יעילים יפחיתו צמיחת סרטן, בעוד אסטרטגיות פרו angiogenic יכולות לשמש לטיפול במחל איסכמית. לפיכך, מודלים של אנגיוגנזה הם חיוניים כדי להבין טוב יותר את הרגולציה של היווצרות כלי חדשה ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי לשפר או להקטין צמיחת כלי דם.

אלמנט בסיסי של מחקר אנגיוגנזה הוא הבחירה של דגם כלי דם מתאים. רבים במודלים חוץ גופית כבר נועדו לשחזר את הצעדים הבסיסיים של אנגיוגנזה כגון תא האנדותל הגירה, שגשוג והישרדות ^2,3. שימוש תכוף בassay חוץ גופית היא היווצרותה של רשת מסועפת של תאי האנדותל במטריצת Matrigel, אם כי לאשלו אינו ספציפי לתאי אנדותל, ואינו בדרך כלל לשלב תמיכה של pericytes או תאי שריר חלק. הערכה של אנגיוגנזה הנבטה vivo לשעבר באמצעות תרבות איבר עכבר כגון assay embryoid הגוף, assay טבעת אב העורקים ואת assay כף הרגל העוברי מאפשרת הניתוח של אנגיוגנזה של תאי האנדותל בהקשר של תאי תומכים נוספים. עם זאת, המגבלות העיקריות של מבחני אלה כוללים את חוסר זרימת דם ורגרסיה של כלי לאורך זמן, נותנים חלון מוגבל לניתוח. לכן, כדי להבין את הרגולציה של אנגיוגנזה בצורה מדויקת יותר, במודלי vivo נדרשים כגון אלו שפותחו בעכבר באמצעות ספוגים מושתלים מתחת לעור או תקעי Matrigel, כמו גם את מודל איסכמיה האיבר האחורי. עם זאת, המודלים האלה הם מאתגרים לנתח בשל ארכיטקטורת 3D המורכבת של neovessels. לעומת זאת, בעובר דג הזברה הוכיח מודל מצוין לאנגיוגנזה חזותית בכלהאורגניזם ^4. עם זאת, את העכבר הוא קשור אבולוציונית הרבה יותר הדוק לאדם מאשר דג הזברה, מה שהופך את עכבר מודל מועדף במקרים רבים. כתוצאה מכך אנגיוגנזה של רשתית העכבר לאחר הלידה מייצגת שיטה מאופיינת היטב של בחירה עבור מחקר אנגיוגנזה. זה לא רק מספק הגדרה פיזיולוגית, אלא גם כלי דם מקלעת 2D, שניתן בקלות דמיין באמצעות כתמי ניאון מתאימים. הארכיטקטורה של רשת הכלי, התפשטות האנדותל, הנבטה, גיוס תא perivascular ושיפוץ כלי כל יכולה להיחקר באמצעות טכניקה זו.

ברשתית עכבר הילוד, פיתוח של כלי דם ברשתית מתרחש בשבוע הראשון של חיים לאחר לידה. עכברים, שלא כמו בני אדם, נולדים עיוורים ואת הרשתיות הפכו vascularized רק לאחר לידה. להתעורר כלי רשתית ממרכז הרשתית הקרוב לעצב הראייה ביום הלידה 0 (P0), ולפתח על ידי אנגיוגנזה כדי ליצור מאוד לארגןד כלי דם המגיעה למקלעת הפריפריה הרשתית בכ P8 ^5. כלי דם לפתח בצורה אופיינית עם מקלעת הנימים גדלה בהדרגה החוצה מהדיסק האופטי לכיוון הפריפריה כדי ליצור דפוס קבוע לסירוגין של עורקים וורידים עם רשת נימים להתערב. כלי הדם ברשתית מספק מודל אידיאלי ללמוד אנגיוגנזה כפי שניתן לזהות בקלות את כלי כפי שהם גדלים במה הוא בעצם מטוס 2D, ובכך הופכים אותו קל יחסית לבחון את כלי הדם ברשתית בהר שטוח הכנות ^5. שיטה לבידוד רשתית ילוד העכבר לניתוח של תגובות תא אנדותל טיפ על כמה שעות vivo לשעבר כבר דווח ^6. לחלופין, בחקירה מפורטת יותר של כלי הדם ברשתית השלם וכלי דם סמנים הקשורים דורשת immunostaining של דגימות רשתית קבועות בשלבים שונים של פיתוח.

כאן אנו מספקיםתיאור מפורט של שיטה אמינה וטכנית ישר קדימה, כי אנו משתמשים עבור כל צביעת הר כלי הדם ברשתית העכברית מקלעת, מenucleation הראשוני של העין לאחר הלידה (ראה גם ⁷⁾ באמצעות פרוטוקולי הצביעה להדמיה סופית מתחת למיקרוסקופ.

פרוטוקול

כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוינו אחרת.

1. Enucleation וקיבוע של עיניים אחרי לידה

1. הנח את העכבר הרג גור אנושי בצד שלה, להסיר את העור מכסה את העין עם מספריים.
2. השתמש במספריים ומלקחיים לenucleate העין.
3. מספריים מקום מתחת לעין enucleated, חתכו את עצב הראייה ורקמות הסובבות ולהרים את העין. מעבירים לצלחת 24 גם מכילה paraformaldehyde 4% (PFA) מורכבים ב2x PBS בטמפרטורת חדר.
4. אפשר לכל עין כדי לתקן עבור 10 - 15 דקות, ולאחר מכן להעביר לקור 2x PBS על קרח במשך 5 - 10 דקות. עדיף להתנודד enucleations וקיבעון שלאחר מכן על מנת להבטיח את מידת הקיבעון היא שווה לכל עין.

2. Dissection של רשתיות Murine אחרי לידה

1. עיניים להעביר לתוך צלחת פטרי המכילה 2x PBS באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק שנחתך להרחיב את השעם והמקום תחת dissecting מיקרוסקופ.
2. הסר כל שומן סביב העין באמצעות מלקחיים ומספריים.
3. פירס הקצה של הקרנית במספריים חדים ולחתוך סביב הקרנית וקשתית העין וזורקת.
4. הכנס מלקחיים בין רשתית ולובן עין ולהסיר את לובן העין נזהרת שלא לקרוע את הרשתית. ניתן גם להסיר את השכבה דמית העין, אבל אם יש סיכון לנזק לרשתית המתרחשת במהלך שלב זה, ניתן להשאיר את השכבה דמה כבזה לא אמור להשפיע על איכות immunostaining באופן משמעותי.
5. הסר את העדשה ואת הומור הזגוגית באמצעות מלקחיים.
6. הסר את כלי hyaloids על ידי איסוף אותם יחד במרכז עין עם מלקחיים עדינים ואז למשוך משם במהירות ממרכז הרשתית (לחלופין חיתוך בבסיס של כלי hyaloid עם מספריים עדינים).
7. יש לשטוף את הרשתית בצורת הגביע עם PBS בצלחת פטרי נקי.
8. הפוך 4 עד 5 חתכים רדיאליים המגיעים לכ 2/3 מהרדיוס של הרשתית באמצעות קפיץ scissoRS כדי ליצור צורה "כותרת".
9. צייר את PBS באמצעות פיפטה פסטר כדי לשטח את הרשתית, ולאחר מכן להסיר כל PBS עודף עם חתיכה קטנה של נייר סופג.
10. לאט לאט טפטפת קר (-20 מעלות צלזיוס) טיפה אחר טיפת מתנול על פני השטח של רשתית עד מכוסה לחלוטין ולאחר מכן מבול עם מתנול נוסף. זה יעזור לתקן את הרשתיות ויאפשר permeabilization. את הרשתיות יהפכו לבנה.
11. מעביר צינור 2 מ"ל בעזרת פיפטה פסטר פלסטיק שנחתכה להרחיב את הקידוח.
12. השאר רשתית במתנול הקר במשך לפחות 20 דקות לפני שתמשיך עם immunostaining. מהנוגדנים המשמשים כאן, לא ניתן להשתמש רק VE-cadherin בהצלחה על רשתית קבועה מתנול. במקרה זה רשתיות צריכים להמשיך ישר לimmunostaining לאחר שלב 9.
13. במידת צורך, ניתן לאחסן ברשתיות מתנול ב -20 ° C עד כמה חודשים לפני מכתים.

3. חיסוני / מכתים isolectin של Vascu הרשתיתlature

1. מוציא בזהירות / לשפוך את מתנול ולשטוף בעדינות רשתיות בקצרה ב PBS (בשלב זה היא עדיין הרשתית באותו צינור 2 מ"ל מצעד 11 לעיל).
2. הסר PBS ורשתיות כיסוי עם 100 μl של הפתרון פרם / בלוק (PBS + 0.3% + טריטון 0.2% BSA) + 5% מהסרום המתאים (ראה טבלת מס '1) וללחוץ בעדינות במשך שעה 1.
3. הסר Perm / חסום ודגירת רשתיות עם עדין רועד הלילה בשעה 4 ° C עם 100 μl של נוגדנים עיקריים שנבחרו (ראה טבלת מס '1) ו / או IsolectinB4, כל שהוכן על ידי דילול בפרם / חסום.
4. הסר את הנוגדן / isolectin ולשטוף רשתיות 4 X 10 דקות בPBS + 0.3% טריטון (PBSTX).
5. במקרים מסוימים, למשל עם הכתמים הבאים IsolectinB4-Alexa488 או נוגדן ראשוני ישירות מצומדת, נוגדנים משני אינם נדרשים ויכולות להיות מותקנים באופן ישיר רשתיות (שלב 7). כאשר נוגדן ראשוני unconjugated נעשה שימוש בשלב 3, ולאחר מכן 100 μl של פלואוריד המתאיםנוגדנים משני escent (בדילול 1/200 בPBSTX) הוא הוסיף ועזבו לדגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת חדר.
6. הסר נוגדנים משני ולשטוף דקות רשתיות 4 X 15 ב2 מ"ל PBSTX.
7. העבר את הרשתיות על גבי שקופיות באמצעות רחבה משעממת פלסטיק פיפטה פסטר ולהסיר PBSTX העודף עם רקמה סופגת. רשתיות הר על ידי הוספת 50 μl של להאריך mountant על coverslip ועדינות עמדה על הרשתית.
8. העברת שקופיות למקרר למשך הלילה ב 4 ° C, על מנת להבטיח שהם שטוחים ומוגנים מפני אור, כדי לאפשר להאריך mountant להגדיר.
9. רשתית תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ epifluorescence.

תוצאות

לאחר נתיחת הרשתית צריכה להיראות כמו פרח שטוח (איור 1). על ידי שימוש בפרוטוקול, שתואר לעיל, ניתן לראות תאי האנדותל באמצעות מכתים B4-Alexa488 isolectin ותמיכה בתאי שריר לב וכלי דם הם דמיינו באמצעות אקטין שריר חלק אנטי אלפא (איור 2). צפה בצריכת החשמל הנמוכה באמצעות מטרת 5X באיור 2 מאפשרת סקירה של ארגון כלי הדם של הרשתית. כמו כן, על ידי שימוש בשילוב של נוגדנים שניתנו בפרוטוקול לעיל שונה, ניתן לראות תאי האנדותל באמצעות immunostaining א...

דיון

השיטה שהוצגה כאן מציעה דרך פשוטה ויעילה כדי להשיג תמונות של כל הכנות הר מוכתמות של רשתית עכבר ילוד, מה שהופך אותו מודל בקלות לכימות ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית של אנגיוגנזה. בתחילה, עין העכבר יכולה להיות די קשה לנתח בשל גודלו הקטן וצורת גלובוס, ולכן חלק באימון וכלים טובים לנתיחה דרושים לתוצאות אמינות. Dissection של עיניים שהוכנו בריכוז 2x של PBS הוא חשוב כי זה גורם לכמות קטנה של אובדן מים מהעין ומפחית את לחץ התוך מסלולית, המאפשר לנתיחה. הכנה טובה של הרשתית היא חשובה מכמה סיבות. ראש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>חומר
>פיפטות פלסטיק 3 מ"ל	ציוד מעבדה מדעי	PIP4210	הסר את הקצה עם מספריים ליצירת צלחות BD Falcon 24 בארות עם קדח רחב
	353226		צלחות מעבדה מדעיות
נבחרות טלוויזיה 90 מ"מ	ציוד מעבדה מדעית	SLS2002
שקופיות היסטובונד	VWR	631-0624
כיסויים 22 x 22 מ"מ	VWR	631-1336
פינצטה דומונט #5	מכשירי דיוק עולמיים	14095
מספריים קפיציים באורך 10.5 ס"מ, עם להבים ישרים 8 מ"מ	מכשירי דיוק עולמיים	501235	משמש להסרת גרעין
מספריים Vannas באורך 8.5 ס"מ, עם להבים ישרים של 7 מ"מ, וקצות עדינות של 0.025 x 0.015 מ"מ	מכשירי דיוק עולמיים	500086	משמש לניתוח רשתית
מספריים ואנה סופר עדינים באורך 8 ס"מ עם להבים ישרים 3 מ"מ, וקצות סופר עדינות 0.015 x 0.015 מ"מ	מכשירי דיוק עולמיים	501778	משמש לניתוח רשתית
צלולה קריסטל ’ צינורות 2 מ"ל	Starlab	E1420-2000
<חזק>ריאגנטים
נתרן פוספט dibasic	Sigma	S0876	מגיב PBS
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma	P5655	מגיב
PBS נתרן כלורי	סיגמא	S9625	מגיב PBS
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	להרכיב ב-2x PBS ולאחסן ב -20 & #176; C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
סרום חמור	Sigma	D9663
סרום עזים		וקטור S-1000
Prolong Gold מגיב נגד דהייה	Invitrogen	P36930	מגיב הרכבה
איזולקטין GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	שימוש ב דילול 1:200
איזולקטין GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	שימוש ב-1:200 דילול
<נוגדנים חזקים>ראשוניים
אנטי-NG2 (רב-שבטי ארנב)	Millipore	AB5320	מזהה פריציטים
Anti-GFAP (שיבוט GA5, חד-שבטי של עכבר)	Millipore	MAB360	מזהה אסטרוציטים
אנטי-דסמין (שיבוט Y66, ארנב חד שבטי)	Millipore	04-585	מזהה פריציטים
אנטי-קולגן IV (רב-שבטי ארנב)Chemicon		AB756P	מזהה קרום בסיס כלי דם
אנטי-אלפא שריר חלק אקטין-Cy3 (שיבוט 1A4, חד-שבטי עכבר)	Sigma	C6198	מזהה תאי שריר חלק בכלי הדם.
אנטי-אנדוגלין (שיבוט MJ7/18, חד-שבטי של חולדות)	BD Pharmingen	550546	מזהה תאי אנדותל
אנטי-CD31 (שיבוט MEC13.3, חד-שבטי של חולדות)	BD Pharmingen	553370	מזהה תאי אנדותל
Anti-VE-Cadherin (שיבוט 11D4.1, חד-שבטי של חולדות)	BD Pharmingen	550548	מזהה צמתים של תאי אנדותל
Anti-Alk1 (רב-שבטי עז)	R& D Systems	AF770	מזהה תאי
<נוגדנים חזקים>משניים
עז נגד ארנב-Alexa594	Invitrogen	A11012	כל הנוגדנים המשניים נקלטים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 °C.
עיזים נגד חולדות-Alexa488	Invitrogen	A11006	כל הנוגדנים המשניים נקבעים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 °C.
עז נגד חולדות-Alexa594	Invitrogen	A11007	כל הנוגדנים המשניים נקבעים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 °C.
עז נגד עכבר-Alexa488	Invitrogen	A11029	כל הנוגדנים המשניים מצוטטים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 °C.
חמור נגד עזים-Alexa594	Invitrogen	A11058	כל הנוגדנים המשניים נקלטים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 °C.
<חזק>מיקרוסקופים
דיסקציה מיקרוסקופ	Zeiss	Stemi SV6
מצלמה	Zeiss	Axiocam HRc	מצלמה למיקרוסקופ
דיסקציה מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי	Zeiss	Axioimager עם מצלמת אפוטום
	מצלמת Zeiss	Axiocam HRm	עבור אקסיואימג'ר
מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון	A1R

אנדותל