שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה כללית להקרנת מטריצת microseed אקראית. טכניקה זו מוצגת להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ניסויי הקרנת התגבשות חלבון, להפחית את הצורך באופטימיזציה, ולספק אספקה ​​אמינה של גבישים לאיסוף נתונים וניסויים יגנד שרייה.

תקציר

הקרנה אקראית מטריצת microseed (rMMS) היא טכניקת התגבשות חלבון שבו גבישי זרע מתווספים למסכים אקראיים. על ידי הגדלת הסבירות כי גבישים יגדלו באזור metastable של דיאגראמת הפאזות של חלבון, מוביל התגבשות נוסף לעתים קרובות מתקבל, את האיכות של גבישים המיוצרים עשויה להיות מוגברת, ואספקה ​​טובה של גבישים לניסויי איסוף נתונים ושרייה מסופקת. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS שניתן להחיל גם ניסויים יושבים טיפה או תליית אדי ירידת דיפוזיה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב96 היטב או בתבנית מגש 24 גם.

מבוא

מהיישום לראשונה שלה על ידי פרוץ, Kendrew ועמיתים לעבודה בקביעת המבנים של המוגלובין ומיוגלובין, לצינורות אוטומטיים המודרניים תפוקה גבוהה של קונסורציומים גנומיקה המבניים, קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן macromolecular העניקה לנו הצצה מבנית חסרת תקדים אל עולם החלבון . טכניקה זו עדיין השיטה הניסיונית ביותר ישימה נרחב המאפשרת הדמיה הישירה של מבנה חלבון באטומי, או בסמוך לרזולוציה אטומית (כלומר בטווח Å 1-3). תנאי מוקדם לרנטגן עקיפה שיחול על חלבון הוא שזה חייב להיות ראשון התגבש, וזה בשלב זה של התהליך שנשאר צעד אחד הגדול שער הגבלה בקביעת מבנה בשיטות עקיפה ^{1, 2.} למרות התקדמות משמעותית בהבנתנו את התהליך של התגבשות חלבון, ושיפורים משמעותיים באיכות והזמינות של מסכים התגבשות,מגשים, וטכנולוגיות קשורות, הוא נשאר בלתי אפשרי לחזות את הסבירות של התגבשות הצלחה ³ באופן מהימן. ניתן ליישם שיטות ביוכימיות וbiophysical להעריך אם חלבון של מציג עניין מאפיינים נוחים להתגרענות גביש וצמיחה, כלומר הוא זה מקופל היטב, הומוגנית, monodisperse, וכו ', לעומת זאת, תובנות אלו בשום אופן לא מספקות מנבא סופי של גיבוש נטייה.

זריעה כבר התיימרה ארוכה להיות שיטה מעשית לשיפור במספר, הגודל והאיכות של גבישים קיימים או חומר גבישי ^4-7. גישה זו מבוססת על ההנחה שתנאים שתומכים בהתגרענות גביש לא יכולים להיות אופטימליים לגידול גבישים שלאחר מכן ולהיפך. על ידי העברת חומר גרעיני ממצב אחד למשנו, אפשר לנסות לנתק ביעילות תהליכים אלה, גישה ובכך נותנת למרחב חדש, שעדיין לא נחקר התגבשות,וכתוצאה מכך להגדיל את שיעור ההצלחה הכולל של ניסוי הקרנה. שיטות הוקמו תועדו לmacroseeding (i), ההעברה של גביש יחיד בשלמותו ממצב אחד לעוד ^8, (ii) זריעת פס, העברת חומר גרעיני, בדרך כלל מתקבל על ידי הפעלת לחץ כיוונית באמצעות למשל השפם של חתול אל פני השטח של גביש קיים, ואחרי המעבר הבא של הזיף דרך טיפה חדשה התגבשות ^9, וכן (iii) microseeding "קלאסי", ההעברה של "זרעים" קריסטל, שנוצרו על ידי קצירה כתוש גבישים (או גבישים חומר), לתנאים דומים לאלה שהניבו את הזרעים ^10. יש לציין את כל שלושת שיטות אלה הם זמן רב וגרוע להרחבה, בוודאי בהשוואה למה שהוא בר השגה עם רובוטיקה התגבשות טיפול הנוזל המודרנית. גורמים אלה תרמו, ברמה מסוימת לפחות, לתפיסה שזרעing הוא שיטה לביקורים רק כאשר גישות אחרות נכשלו לשאת פרי.

microseeding מטריצה ​​אקראית (rMMS) הוא חידוש המתודולוגי האחרון המשלב את היתרונות של microseeding המסורתי עם אלו של הקרנת תפוקה גבוהה ויכולת רחבה ^11-13. גישה זו מסתמכת על הדור של מניית זרע, המיוצר מחומר גבישים גרעיני, אשר עשוי להיות aliquoted ל/ על כל sub-well/coverslip בתוך מסך התגבשות 96 מצב סטנדרטי. שיטה זו ישימה גם בישיבה או בתליית ניסויי דיפוזיה אדי טיפה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב24 גם או בפורמט מגש 96 היטב. rMMS הודגם בניסוי כדי להגדיל באופן משמעותי את שיעור הצלחה של התגבשות, ולייצר גבישים באיכות עקיפה גדולה יותר וכמות ^{11, 13, 14,} ומייצג כלי חדשני בארסנל "crystallographers של גישות בoNgoing מאמץ לקראת הצלחה התגבשות. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS ולספק נתונים לדוגמה הממחישים את היעילות של טכניקה זו.

פרוטוקול

1. שיקולים אסטרטגיים

1. הבחירה של זרע גבישים המשמשת לניסויי microseeding תשתנה בהתאם למטרת הניסוי. בתחילת פרויקט כדאי למצוא כמה להיטי התגבשות שיכולה לספק נקודות התחלה חלופיות לגביש אופטימיזציה. rMMS מקטין באופן משמעותי את הצורך באופטימיזציה של גביש כי גבישים באיכות טובה יש סיכוי גבוה יותר לגדול באזור metastable של דיאגרמת פאזות, כלומר באזור שבו בעקבות הפרעה או התגרענות המערכת חוזרת לשיווי משקל. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש באופן שגרתי rMMS בהקדם הגבישים הראשונים מתקבלים (או יותר נכון, ברגע שהגבישים הראשונים להפסיק לגדול).
2. לסיבוב של rMMS הראשוני, מניית זרע צריכה להיעשות עם כמה שיותר חומר גבישים ככל האפשר. אם רק אחד גם הוא זמין המכיל גבישים, או אם הגבישים קטנים, זה עשוי להיות מועיל כדי להגדיר את החזרות מרובות שללהיט מקורי (ללא זריעה) כדי להגדיל את ההיצע של גבישים. אם, לעומת זאת, כמה להיטים שונים מתקבלים, ניתן לקצור גבישי זרע מכמה תנאים ומעורבבים יחד.
3. כדי להימנע מהפרדת פאזות, קריסטלים גדלו בתנאים עתיר מלח צריכים להיות שנקטפו בנפרד מגבישים גדלו בתנאים גבוה PEG. אם גבישים מכמה בארות מעורבבים, פתרון מאגר זה הוא פחות סביר לתת גבישי מלח יש לבחור עבור השעיה זרע. לדוגמא, יש להימנע מריכוזים גבוהים של פוספט, חומצה גופרתית, סידן ומגנזיום.
4. מאוחר יותר בפרויקט זה עשוי להיות חשוב לחפש גבישים עם תאי יחידה אחרים על מנת לשפר את העקיפה, להימנע מגבישי תאומים, ולקבל גבישים המתאימים למחייב ligands. בשלב זה יש להשתמש רק הגבישים המתאימים ביותר (למשל אלה שdiffract הטוב ביותר) על מנת להפוך את מניית הזרע. סבבים חוזרים ונשנים של microseeding לפעמים נדרשים, שבו רק את "הטוב ביותר"גבישים משמשים כדי להפוך את הזרעים לסיבוב הבא. במידת האפשר," צריך להיות בשימוש נמהר ניטראלי "כמו PEG 3000 להשעות את גבישי הזרע בלעודד אנשי קשר רומן גביש ולהתגבש מתחמים שעשויות להיות בלתי יציב בהיי מלח פתרונות ^12.
5. ניסויים קלאסיים microseeding, שבו מצב התגבשות יחיד משמש, לעתים קרובות הבאים מועילים זיהוי של מצב מבטיח ובמהלך אופטימיזציה שלאחר מכן. זה לעתים קרובות יש צורך לדלל את מניות הזרע על מנת לקבל את המספר הרצוי של גבישים לכל טיפה. ניסוי "קומבינטורית" microseeding (שבו סדרה של מניות זרע של דילול הגדלת מתווספות למצב התגבשות) הוא שיטה מהירה למציאת הדילול האופטימלי של מניית הזרע. גישה זו מתוארת בהמשך.

2. הכנת מאגר הזרעים

1. הפוך בדיקה זכוכית מעוגלת מהזכוכית פיפטה פסטר באמצעות להבה בונזן.
   1. מחממים את פיפטה קרובה לאמצע עד שהוא הופך להיות רך, ולאחר מכן להסיר במהירות אותו מהאש ולהוציא אותו על ידי משיכת לגזרים את הקצוות. מטרה למשוך את הכוס בקוטר מתחת 0.25 מ"מ.
   2. לשבור את הזכוכית בנקודה שבה היא סביב 0.25 מ"מ ובקצרה לצלול הסוף נשבר ללהבה. חזור על פעולה זו עד לחצי כדור זכוכית בקוטר של ~ 0.75 מ"מ נוצר בסופו של הדבר. בדיקה זו שימושית לריסוק חומר גבישים כפי שהוא בגודל מתאים עבור בולט עצמים מוצקים בסולם 0.01-1.0 מ"מ והוא אינו פוגע במשטח הפלסטיק של משנה גם מגש התגבשות או coverslip. בדיקות גדולות יותר (~ 1.0 מ"מ) עלולות למחוץ גבישים קטנים בצורה יעילה יותר, כי הגבישים לכודים בין הזכוכית והפלסטיק.
2. הנח צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל זרעים חרוזים על קרח.
3. בדוק מגש גיבוש שנקבע מראש באמצעות מערכת הדמיה גביש מיקרוסקופ או משקפת ובחר ap אחד או יותרpropriate בארות מהמגש שממנו למסוק חומר גבישים עבור דור מניית הזרע. ניתן להשתמש בכל חומר, כולל מחטים דקות, spherulites, microcrystals וגבישים בלתי סדירים, שהוקמו בצורה גרועה. מניית הזרע צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר הגבישים להפסיק לגדול, כחומר ישן יותר הוא סיכוי גבוה יותר להיות בחלק צולבים, ובכך להקטין את התאמתה לשימוש בניסויי זריעה. אם כל ספק קיים, האם חומר גבישים להיות שנקטפו הוא מלח או חלבון גם ניתן דמיינו באמצעות מערכת ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי UV או לפני הפתיחה, או חומר גבישים עשוי להיות נתון באתר ניתוח עקיפה X-ray במגש. בעת השימוש בגבישי חלבון גישה לשעבר לזרוח תחת קרינת UV, גבישי מלח יופיעו חסרי צבע.
4. פתח את מגש ההתגבשות שנבחר היטב. ל96 היטב יושבים מגשי טיפה לחתוך את גיליון איטום הפלסטיק העליון סביב נבחר גם USIng להב סכין מנתחים. למגשי טיפה תלויה 24 גם להסיר את coverslip באמצעות פינצטה. הפוך את coverslip ולמקם אותו על משטח נקי ויציב. הסר 50 μl של פתרון המאגר ולהעביר את הנוזל לצינור microcentrifuge המכיל את הזרע ביד כדי להבטיח שהצינור נשאר על קרח לאורך כל הדרך.
5. יסודיות לרסק את הגבישים בsubwell (מגש 96 היטב) או coverslip (מגש 24 גם) טיפות, באמצעות הבדיקה הזכוכית שהוכנה בסעיף 2.1, הצגת התוצאות תחת מיקרוסקופ. גבישים קטנים עשויים להימשך מספר דקות לרסק ביסודיות. שלב זה מאפשר למנהל הניסוי כדי לבדוק שהגבישים קלים לרסק ולכן אינו צולבים, וגם כי הם לא גבישי מלח. גבישי מלח לייצר לחצו ייחודי שניתן יהיה לשמוע והרגישו כשהם מרוסקים. אם הגבישים קשים וקשים למחוץ לנסות להשיג ולהשתמש בחומר טרי.
6. הסר 5 μl של פתרון המאגר מהצינור ביד הזרע ולאransfer למשנה גם שווה הערך (יושב ניסוי טיפה), או coverslip (תלוי ניסוי טיפה) המכיל את חומר גבישים להיות שנקטפו. פיפטה נוזלית את זה ולמטה 5-6 פעמים כדי resuspend כמה שיותר את תוכן משנה טוב או coverslip ככל האפשר. להחזיר את ההשעיה לצינור ביד הזרע ולחזור על פעולה זו פעמיים נוספות, על מנת להבטיח שחומר גבישים כמה שהוא שנקטפו ככל האפשר.
7. מערבולת ביד הזרעים לשתי דקות, עוצרת כל 30 שניות כדי לקרר את הצינור על קרח.
8. לעשות סדרת דילול, דילול מניות הזרע בפתרון מאגר בפקטור של 4 עד 10 בכל שלב. בדרך כלל, יתקבלו גבישים רבים מדי בעת השימוש במניית זרע חי, כדי להשתמש במניות הזרע המדולל לשלוט במספר של גבישים לכל טוב. בסיבוב הראשון של rMMS, חשוב שלא לדלל את פתרון מניות הזרע, שכן ככל שהריכוז של זרעים יתקבלו יותר להיטי התגבשות.
9. אם זה לא כדי לשמש היא מידately, להעביר את ההשעיה מניית הזרע וזרע המניה מדוללת ל-20 ° C, או -80 ° C במקפיא לאחסון. כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים, אשר עשוי להפחית את היעילות של מניית הזרע, לאחסן את החומר הזה בaliquots נפח הקטנים, כלומר 10-20 μl. ברגע קפוא, מניות זרעים נשמרות ללא הגבלת זמן עד הצורך.

3. הקמתה של התגבשות מגשים

1. בהתאם לזמינות של מתקני התגבשות וההעדפות של הנסיין, הקרנת התגבשות rMMS יכולה להתבצע באמצעות שני מגשים 24 גם המעסיקים בשיטת דיפוזיה אדי טיפה התלויה, או מגשים 96, גם תוך שימוש בשיטת דיפוזיה אדי הטיפה יושבת. מגשי התגבשות לrMMS ניתן להקים גם ביד, תוך שימוש בנוזל טיפול מתקן רובוטית, או שילוב של שתיים.
2. ניסוי rMMS טיפוסי שהוקם על ידי יד יהווה, 1.0 פתרון חלבון μl, מצב התגבשות 1.0 μl, ו0.5 מניית זרע μl. ניסוי טיפוסי להגדיר באמצעות רובוט התגבשות יכלול, פתרון חלבון 0.3 μl, מצב התגבשות 0.2 μl, ו0.1 מניית זרע μl.
3. כדי לבצע סינון rMMS ב24 גם תלוי מגשי טיפה, ראשית, באמצעות פיפטה ידנית, להעביר 300 μl של כל מצב ממסך התגבשות מצב 96 היטב ב10 מיליליטר פורמט צינור אחד לתוך באר כל 4 x 24 גם התגבשות pregreased מגשים.
   1. μl העברת 1 של כל תנאי התגבשות ממאגר μl 300 על פני השטח של coverslip פלסטיק המתאים שממנו שני רצועות גיבוי מגן הקדמיות ואחוריות הוסרו.
   2. כדי μl 1 של כל תנאי התגבשות להוסיף 1 μl של פתרון חלבון ואחריו 0.5 μl של מניית זרע גביש. הפוך כל coverslip כך שהירידה של נוזל כלפי מטה מול והעמדה מעל למתאים היטב.
   3. לחץ כלפי מטה על coverslip, דחיסת sealing שומן ויוצר שכבה אטומה והמאובטח. ברגע שכל 96 הטיפות מבוססות, המגש צריך להיות מועבר לאינקובטור או בחדר טמפרטורה קבוע, בדרך כלל במעלות צלזיוס הטווח 4-18 לאחסון.
4. כדי לבצע סינון rMMS ב96 היטב יושב מגשי טיפה ראשית להעביר 20-50 μl של כל מצב ממסך התגבשות מצב 96, גם בפורמט לחסום גם עמוק לתוך כל מקביל גם של מגש ההתגבשות. צעד העברה זו יכול להתבצע או באמצעות רובוט התגבשות, או על ידי העברה ידנית באמצעות פיפטה 8 ערוצים.
   1. פתרונות מניות העברת מאגר, חלבון וסיד לטיפין ביד או עם רובוט באמצעות הכרכים מפורטים ב3.1. כמה רובוטים התגבשות זמינים מסחרי לא לפנות לוותר, והעברת מניות זרע ביצועים באמצעות מערכת כזו עלולה לגרום לחסימה של מחלק טיפים או צינורות קשורים. סדר מחלק משתנה: כמה רובוטים לוותר כל הפתרונות בו זמנית. אםזה לא אפשרי, תחילה לוותר על חלבון, ולאחר מכן מאגר, ואז זרע מניות.
   2. אם איש קשר מחלק רובוט הוא לא העברה זמינה באמצעות הזרעים מצוידים במחט בוטה מזרק זכוכית בנפח נמוך. יש לשטוף את המחט על ידי העברתו דרך פתרון המאגר אז לוותר מניית הזרע לכל טיפה.
   3. לאטום את המגש באמצעות גיליון איטום שקוף ולהעביר לאינקובטור או בטמפרטורת חדר הקבוע לאחסון.

4. בדיקה של התגבשות מגשים

1. דמיינו את כל ניסויי ההתגבשות או באמצעות מערכת הדמיה גביש מיקרוסקופ או משקפת. לשעבר בדרך כלל מעניק למשתמש שליטה רבה יותר על עומק נוף ואת מידת הגדלה מאשר האחרון, אך הוא זמן רב יותר.
2. בדוק כל sub-well/coverslip ברצף ולהקליט כל ראיה של היווצרות גבישים. יש לבדוק ניסויים אחת לשעה 24 במשך 5 ימים לאחר ההקמה וn לאחר מכן פעם ב 7 ימים לתקופה של עד 4 שבועות.
3. מחזורים רבים של rMMS נדרשים לעתים קרובות לפני גבישים באיכות עקיפה אופטימלית מיוצרים.

תוצאות

(א) דוגמא לניסוי rMMS

כדי להדגים את האפקטיביות של הקרנת rMMS אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי ההתגבשות של ליזוזים ביצת תרנגולת הלבן (HEWL) וכבד שור קטלאז (BLC). שני אנזימים אלה הם crystallizable בהחלט ומבניים מאופיינים היטב מטרות ^{15, 16.} ככזה גם לספק נבדקי מבחן מצוינים כדי להמחיש את שיעור הצלחה התגבשות המשופר השגה עם rMMS. ניסויי התגבשות הוקמו ב96 היטב יושב בפורמט מגש טיפה באמצעות רובוטיקה טיפול נוזלית. פתרונות ...

דיון

במאמר זה שתארנו שיטה כללית להקרנת התגבשות חלבון rMMS. אנחנו הוכיחו באמצעות שני חלבוני מבחן שיפור משמעותי בשיעור הצלחה גיבוש בשיטה זו. ניתוח עקיפה באמצעות קרינת סינכרוטרון של קבוצת משנה של גבישים שנוצרו באמצעות rMMS ושיטות שאינם rMMS חשף וריאציה מעט באיכות עקיפה בין הגבישים גדלו בשני שיטות, אם כי מחברים קודמים דיווחו כי גבישים באיכות טובה יש סיכוי גבוה יותר לגדול בניסויי rMMS ^{11, 13.} HEWL וBLC אולי נתנו תוצאות לא טיפוסיות משום שהם קלים בצורה יוצאת דופן כדי להתגבש. אנחנו ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
MRC 96 מגשי התגבשות	באר מידות מולקולריות בע"מ	MD11-00-100	לא תואם UV, למסכים שהוקמו על ידי רובוט
ClearView יריעות איטום	מידות מולקולריות בע"מ	MD6-01S
ליזוזים חלבון ביצה תרנגולת	סיגמא-אולדריץ'	L6876	~ 95% טוהר
קטילאז כבד בקר	סיגמא-אולדריץ'	C9322	95% טוהר
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	למסכים שהוקמו על ידי רובוט
PACT premier HT-96 מסך	מידות מולקולריות בע"מ	MD1-36	למסכים שהוקמו על ידי רובוט
מורפיאוס HT-96 מסך	מידות מולקולריות בע"מ	MD1-47	למסכים שהוקמו על ידי רובוט
קריסטל Ph– מערכת טיפול בנוזלים nix	Art Robbins Instruments	602-0001-10
ערכת חרוזי זרעים	Hampton Research	HR2-320
מיקרוסקופ סטריאו דו-עיני	Leica	M165C
להבי אזמל	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μ l פיפטה	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μ l פיפטה	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μ l פיפטה	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus מסך	מידות מולקולריות בע"מ	MD1-37	למסכים שהוקמו ביד
PACT פרמייר מסך	מידות מולקולריות בע"מ	MD1-29	למסכים שהוקמו ביד
מסך מורפיאוס	מידות מולקולריות בע"מ	MD1-46	למסכים שהוקמו בעבודת יד
פינצטה	סיגמא-אולדריץ'	T5415-1EA
CrystalClene כיסויים 18 מ"מ	מידות מולקולריות בע"מ	MD4-17
2 מ"ל זכוכית פסטר פיפטות	Sigma-Aldrich	Z722669
מערבולת	פישר סיינטיפיק	02-215-360
24 באר מגש התגבשות XRL	מידות מולקולריות מוגבל	MD3-11	למסכים שהוקמו בעבודת יד
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M אמוניום גופרתי, 0.1 M נתרן קקודילאט pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M מגנזיום אצטט, 0.1 M נתרן קקודילאט pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 מ"מ חומצת לימון pH 5.0