דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

Summary

אנו מתארים את ההכנה של שלוש דגימות בדיקה וכיצד הם יכולים לשמש כדי לייעל ולהעריך את הביצועים של מיקרוסקופים סערה. שימוש בדוגמאות אלה אנו מראים כיצד לרכוש נתונים גולמיים ולאחר מכן לעבד אותו לרכוש תמונות ברזולוציה סופר בתאים של כ 30-50 ברזולוציה ננומטר.

Abstract

STORM הוא טכניקת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר שפותחה לאחרונה עם רזולוציה טובה יותר עד פי 10 מאשר טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטיות. עם זאת, כמו התמונה שנרכשה באופן שונה מאוד מהרגיל, על ידי בניית מולקולת מולקולה אחר תמונה, יש כמה אתגרים משמעותיים עבור משתמשים במנסים לייעל את רכישת התמונה שלהם. על מנת לסייע לתהליך זה ולהשיג יותר תובנה כיצד STORM עובד אנו מציגים את ההכנה של 3 דגימות בדיקה ואת המתודולוגיה של רכישה וSTORM עיבוד תמונות ברזולוציה סופר עם רזולוציות טיפוסיות של בין 30-50 ננומטר. על ידי שילוב של דגימות בדיקה עם השימוש בתוכנת עיבוד סופת גשמים זמין באופן חופשי ניתן להשיג מידע רב על איכות תמונה ורזולוציה. שימוש במדדים אלו אז זה אפשרי כדי לייעל את הליך ההדמיה מאופטיקה, לדגום הכנה, בחירת צבע, תנאי חיץ, והגדרות רכישת תמונה. אנחנודוגמאות מופע סימפוניות של כמה בעיות נפוצות הגורמים לאיכות ירודה של תמונה, כגון סחיפה לרוחב, שבו מהלכי המדגם במהלך רכישת תמונה וצפיפות הקשורים בעיות וכתוצאה מכך התופעה 'mislocalization'.

Introduction

לאחרונה מגוון רחב של טכניקות מיקרוסקופיה אופטיות פותחו, המכונה בדרך כלל כמיקרוסקופיה ברזולוציה סופר או Nanoscopy, שיכול לעקוף את המגבלה העקיפה וליצור תמונות עם רזולוציות של 100 ננומטר או טוב יותר ^1,2. מאז ההודעה של מיקרוסקופיה ברזולוציה הסופר כשיטת טבע השיטות של השנה ב2008, חל הרבה מאוד פיתוח של מיקרוסקופים מבוססי לוקליזציה. לדוגמא, ישנם יישומים רב צבע ^3-6, יישומי 3D ^7-12, ויישומים סלולריים ואפילו חיים ^5,13-17. יתר על כן, מערכות אלה להיות ממוסחרים וכעת הם עושים את דרכם מחוץ למעבדות אופטיקה לידיהם של ביולוגים תא שם צפוי להיות עלייה נוספת בשימוש וביישום שלהם לשאלות ביו.

ענף אחד של המשפחה הזאת הוא השיטות המבוססת על הלוקליזציה אשר עובדות על ידי בניית מולקולת מולקולה אחר תמונה. אניסדר n לעשות את זה, הרוב המכריע של מולקולות ניאון בתוך המדגם חייב להיות כבוי, כך שמולקולות מרחבית מופרדות רק כמה פעילות בכל זמן נתון. מולקולות אלה לאחר מכן במהירות מופעלת לסירוגין ותמונות רבות שצולמו, כך שחלק ניכר מהאוכלוסייה הוא הדמיה כדי לשקף את המבנה הבסיסי עם דיוק משנה עקיפה. מספר גישות פורסמו כולל ¹⁸ GSDIM, PALM ^19, fPALM ^20, סערה ^{21 ו22} RESOLFT. אלגוריתמים המודדים את העמדה של זיהוי מולקולה בודד לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לאתר את המיקום האמיתי של מולקולתם בדיוק טובה יותר מאשר 20 ננומטר באמצעות הולם גאוס ^23, למשל rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^26, palm3d ^{12 ו27} סופת גשמים. כאשר תא הדמיה או דגימות ביולוגיות אחרות, שבו יש צפיפות גבוהה מולקולה, זה לכן, יש לקחת באלפים רבים של מסגרות שלזה מהבהב, מופרד מרחבית, לאותת על מנת תמונת חלק משמעותי מהמולקולות שכותרתו.

מיקרוסקופיה סטוכסטיים השיקום אופטי (סערה) וdSTORM הקשור מאוד ושיטות GSDIM שיטות רזולוציה סופר מבוסס לוקליזציה, אשר הוכחו לעבוד עם צבעים אורגניים זמינים מסחרי ^21. מאז הם הוכחו להיות רלוונטיים למספר צבעים השונים ^28-30, מה שהופך את המתודולוגיה אטרקטיבית במיוחד בגלל הספציפיות והנוחות היחסית של גישות immunolabeling מבוססות היטב כדי לבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כתוצאה מכך, יש גישה קלה למגוון של conjugates צבע נוגדנים ולצבוע-biomolecule, אשר להם הפוטנציאל לשימוש בהדמיה ברזולוציה סופר מבוסס לוקליזציה. בעוד העקרונות הכלליים של סערה וגישות דומות הם פשוט יחסית, ובמבט ראשון הכנת החומרה והמדגם נראה יחסית straightforward, יש מספר השלבים בתהליך אשר הם קריטיים להשגת,, תמונות ברזולוציה סופר ללא חפץ באיכות גבוהה.

כמו בכל שיטות מיקרוסקופיה יכול להיחשב התהליך ב 3 שלבים עיקריים: ראשון, הכנת מדגם, שני, רכישת תמונה, ושלישי, עיבוד תמונה ו / או ניתוח תמונה ופרשנות. כוחו בפתרון נוסף והשיטה של יצירת תמונות ברזולוציה סופר באמצעות גישה המבוססת על לוקליזציה מציג כמה בעיות ושיקולים ^31-33 חדשות. מתחיל עם הכנת מדגם, בעת ביצוע immunolabeling, במיוחד immunofluorescence העקיף בי שילוב נוגדן ראשוני והמשני משמש, יש לציין שצבע פלואורסצנטי עשוי להיות עד 20 ננומטר מהמולקולה של עניין. במקרה של microtubules, זה תוצאות בקוטר של 35-50 ננומטר לעומת קוטר microtubule צפוי של 25 ^28,30 ננומטר. כמו כן, צפיפות התיוג צריך מ 'eet קריטריוני נייקוויסט על מנת ליצור תמונה באיכות גבוהה ^14. לדוגמא לרזולוציית תמונה צפויה של 20 ננומטר יחד מבנה פילמנטיות צריכה להיות מולקולה לצבוע לפחות כל 10 ²⁷ ננומטר. בעוד צבעים רבים כבר פורסמו לעבוד עבור מבוסס לוקליזציה מתקרבת לביצועים הכוללים של הצבע הוא שילוב של לפחות ארבעה קריטריונים חשובים, כלומר פוטונים זוהו למיתוג אירוע (הבהירות של כל מצמוץ - בהיר הוא טוב יותר), שיווי המשקל על פעמי מחזור העבודה (יחס ניגודיות של צבעים בהנחה לעומת במדינה - יותר מהוא בדרך כלל טוב יותר), את החלק יחסי ההישרדות (שיעור הלבנת נמוך הוא יותר טוב) ואת מספר מחזורי מיתוג (מספר מהבהב לfluorophore - יותר הוא טוב יותר לרזולוציה גבוהה, למרות שההרף 1 לfluorophore יכול להיות יתרון למטרות ספירת מולקולה). המצב מסתבך עוד יותר על ידי העובדה כי נכסים אלה לכל צבע נתון יכולים להשתנות בתנאי חיץ שונים ועם ^28,29 כוח הלייזר. בנוסף לכך, כמו גם שיקולי STORM הייחודיים אלה, ניתן לשפר את איכות תמונה על ידי אופטימיזציה של הכנת מדגם באותה הצורה כמו טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתיות יותר למשל על ידי צמצום autofluorescence על ידי שינוי של תנאי קיבעון והשימוש בחומרים כימיים מרווה. כמו כן, מזעור fluorophores מחויב הלא ספציפי הוא חשוב, אשר יכול להיעשות על ידי התאמת ריכוזי תווית, פעמים דגירה וצעדי חסימה וכביסה.

השלב השני של רכישת תמונה הוא גם קריטי. ההגדרות אופטימליות על המיקרוסקופ יהיו תלויות בצבע, תנאי חיץ, צפיפות תיוג, וסוג המדגם, למשל monolayers על זכוכית, תאים או דגימות רקמה. השיקולים העיקריים הם זמן מצלמה חשיפה, מספר מסגרת, זווית תאורה (TIRF, הילו, Epi) וכוח הלייזר. המטרה היא לאסוף את מהבהב מופרדים מרחבית בהירה כמה שיותר מהר. אם אני רקעים גבוה מאוד או מהבהב הוא לא בהיר מאוד, במילים אחרות את יחס אות לרעש הוא עני, אלגוריתם השחזור לא תוכל למקם את העמדות באופן מדויק. כמו גם למקסם את דיוק הלוקליזציה, כלומר את הדיוק עם כל עמדת מולקולה ניתן למדוד, איכות תמונה תלויה גם במספר גבוה של גרסות מגוירות. אם מספר מספיק של המולקולות של עניין הם צילמו, או בשל יעילות עניי תיוג, photobleaching מוגזם או מספר מסגרת מספק, ואז התמונה ברזולוציה סופר שתתקבל תהיה punctate ורציפה כקריטריון נייקוויסט לא מולאו ^14,27 .

ולבסוף, בשלב השלישי, עיבוד תמונה, חשוב במיוחד בהשוואה לטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטיות. יש מגוון של באופן חופשי וזמינים מסחרי אלגוריתמים, שהוא גם יתרון, במונחים של בחירה, וחסרון, בכך שזה יכול להיות מבלבל לדעת w hich הוא מתאים ביותר לשימוש. אם לדוגמא את הנתונים הגולמיים כבר היטב במרווחים מהבהב מרחבית שונה אז אלגוריתם הולם מולקולה בודדת יכול להיות מאוד מדויק ויעיל, לדוגמא על ידי האלגוריתמים מתאימים הדליל זמינים ^ב27 סופת גשמים, rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² וQuickPALM ²⁶ תוכנה . אם הנתונים הגולמיים מכילים הרבה חופף אותות אז אלגוריתמים שעשויות להיות מתאימים יותר כולל DAOSTORM ^34, 3B ³⁵ וdeconSTORM ^36. יתר על כן, אלגוריתמים אלה מכילים ערכי סף לקריטריונים שונים, כגון ספירת אות, או פוטונים למצמוץ, כמו גם אפשרויות תצוגת תמונה מגוונות שונות כגון חזותי עם פונקציות גאוס מוחלקות או כהיסטוגרמות עם רשתות פיקסל, שבו גודל פיקסל ברזולוציה סופר יכול להיות שנבחר על ידי המשתמש. כל האפשרויות האלה לשנות את המראה של התמונה הסופית ויש להם השלכות לפרשנות תמונה וניתוח.

> לכן, אנו מציגים 3 דוגמאות בדיקה אשר תספק את המשתמש החדש עם נקודה מוצא לניסויים מבוססי צבע מבוסס לוקליזציה רזולוציה סופר, אשר למען הבהירות אנו מתייחסים כאל סערה, ומשתמשים מנוסים יותר ההזדמנות לייעל עוד יותר את הניסויים שלהם. ראשית, אפשר לצפות את משטח זכוכית בשכבת ניאון של הצמוד dextran צבען. זה מספק דרך מהירה ופשוטה כדי לקבוע, כי למיקרוסקופ, הצבע והחיץ פועלים כדי ליצור אות ניאון מהבהבת. השיטה לאחר מכן ניתן להרחיב על ידי השוואת מדדי דיוק לוקליזציה ומספר ממוצעים שנוצרו על ידי סופת גשמים כדי לייעל את תנאי חיץ, הגדרות רכישת תמונה ולבדוק את צבעים שונים. שנית, אנו מציגים פרוטוקול פשוט להכנה סיבי אקטין על זכוכית שיכול להיות מתויג בקלות באמצעות conjugates phalloidin צבען. אלה מספקים מבנים אידיאליים לקחת מדידות של רזולוציה ²⁷ ובדרך כלל מחצית מקסימום הרוחב מלא (FWHM)מנימה ניתנת כאומדן אמפירי של רזולוציה ^37. יצוין, כי ברזולוציה משתנה בין דגימות ובין תמונות בתוך המדגם זהה בגלל רזולוציה במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מבוסס לוקליזציה היא פונקציה של בהירות fluorophore, רעשי רקע וצפיפות לוקליזציה ²⁷ ואלה לא בהכרח קבועים לאורך כל הדגימה. סיבי אקטין הם משמשים כדי להדגים חפצים פוטנציאליים כגון mislocalizations ולהיסחף וכיצד הם יכולים להיות מזוהים עם תכונות תוכנה בתוך סופת גשם. יתר על כן, אנו מתארים את השימוש בסמני fiducial ניאון הן למדד ולהיסחף נכונים. ושלישית, צביעת תאים באפידרמיס גורם גדילה (EGF) conjugates לצבוע מתוארת. EGF מספק חיווי שימושי של ביצועי תמונה ברזולוציה סופר, כי חלקם של קולטן על פני התא עובר אנדוציטוזה באמצעות שלפוחית, שהם מבנים בגודל תת עקיפה של כ 50-150 nמ 'קוטר ^27,38,39.

Protocol

הערה: לאורך כל פרוטוקול זה, טיפים והצעות נמצאים ביצוע צעדים מסוימים. הסימון "* 1" מציין שההערה 1 היא רלוונטית לשלב הספציפי הזה, וכן הלאה.

1. פלורסנט Dextran ציפוי של זכוכית

1. הוסף 200 μl של 0.01%-L-ליזין פולי פתרון לכל טוב של coverglass 8 הקאמרית ודגירה של 10 דקות. הסר עם טפטפת כדי לוודא ששום הוא נוזל שנותר.
2. מחדש dextran-Alexa 647 ^{* 1} על פי הוראות יצרן, כדי ליצור פתרון מניית 2 מ"ג / מיליליטר. מכאן, לדלל 0.25 μl ל25 μl מים דה המיונן כדי ליצור פתרון 20 מיקרוגרם / מיליליטר.
3. כדי ליצור ציפוי צפיפות גבוה של dextran-Alexa 647 פתרון לדלל 20 μl של פתרון מיקרוגרם / מיליליטר 20 לסכום כולל של 200 μl מים דה המיונן. לפתרון צפיפות בינונית לדלל 2 μl ב200 μl מים דה המיונן (1:10,000 דילול מפתרון המניות המקורי). לנמוךפתרון צפיפות לדלל 0.2 μl ב200 μl מים דה המיונן (1:100,000 דילול מפתרון המניות המקורי).
4. הוסף 200 μl של dextran-Alexa 647 פתרונות מדוללים היטב כל אחד ודגירה של 10 דקות. פעמים דגירה ארוכות יותר ניתן להשתמש בו עלול לגרום לציפוי dextran צפוף יותר. להסיר ולשטוף עם H ₂ O שלוש פעמים ^{* 2}

הערה 1: ניתן להשתמש conjugates dextran-צבע אחר. dextran unconjugated גם יכול להיות מצומדת לצבעים אם שילובים רצויים אינם זמינים באופן מסחרי.

הערה 2: ניתן reimaged אותו תאי dextran על פני תקופה של שבועות אף את האחידות של הקרינה עלולה לגרום לירידה. אחסון על 4 מעלות צלזיוס בהעדר חיץ מומלץ.

2. פלורסנט אקטין הצטברויות על זכוכית

1. הוסף 200 μl של 0.01%-L-ליזין פולי פתרון היטב בכל החדר ודגירה של 10 דקות ^{* 3.} Reלעבור עם פיפטה כדי לוודא ששום נוזל שנותר.
2. הוספת 90 μl של חיץ כללי אקטין (מחדש על פי הוראות יצרן) לכל תא. הוסף 10 μl של 10 מיקרומטר preformed פתרון נימה אקטין וμl 1 phalloidin-Alexa 647 (0.2 יחידות, כאשר מומס ב1.5 מיליליטר של מתנול לפי הוראות יצרן) ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב. דגירה במשך 30 דקות ^{* 4.}

שים לב 3: הגדלת נפח פתרון נימה בתוך התוצאות קאמריות בפחות חוטי קשירה של הזכוכית המצופה פולי-L-ליזין.

הערה 4: דגירה פעמים של עד 48 שעות ב 4 ° C נבדק עם תוצאות טובות. איכות תמונת נימה אקטין מתדרדרת פעם בתא נחשף למיתוג חיץ כך שהוא אינו מומלץ לשימוש באותו מדגם ליותר מיום אחד.

3. Microsphere חרוזי ניאון כFiducial סמנים

1. לדלל 1 μl של חרוזים TetraSpeck ל200 μl PBS ומערבבים.
2. מוסיף את חרוזים מדוללים לחדר הדמיה והמתן 15 דקות ^{* 5.} הסר את הפתרון ולשטוף 3 פעמים עם PBS לפני ההדמיה.

באור 5 - זמן הדילול ודגירה יכול להיות מותאם כדי להשיג צפיפויות שונות של חרוזים. פרוטוקול זה בדרך כלל תוצאות בין 3-10 חרוזים ל20.5 מיקרומטר x 20.5 מיקרומטר שדה של נוף.

4. מכתים תא עוריות Growth Factor

1. תרבות תאי הלה בתאי הדמיה לconfluency כ 80% בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין פתרון.
2. הסר את מדיום התרבות ולשטוף עם PBS. לאחר מכן להוסיף 500 μl של 4% תמיסת פורמלדהיד (4 מיליליטר 10% תמיסת פורמלדהיד, 1 מיליליטר 10X PBS, 5 מיליליטר מים) ל10 דקות. הסר את פורמלדהיד ולשטוף 3 פעמים עם PBS. אל תאפשר לתאים להישאר דPBS ר"י ותמיד להשתמש נאגר פתרונות כדי למנוע לחץ hypotonic.

זהירות - פורמלדהיד הוא רעיל ביותר. ודא שכפפות מתאימות, הגנה על העין וחלוקי מעבדה הם שחוקים. בדקו הנחיות מקומיות לסילוק של פורמלדהיד.

3. לשקם EGF-Alexa 647 על פי הוראות יצרן כדי ליצור פתרון מניות 50 מיקרוגרם / מיליליטר. הוסף 2 μl של פתרון מניות זה 200 μl של .0.1% פתרון BSA (PBS). הסר את PBS מהתאים, להוסיף את פתרון EGF ודגירה במשך 30 דקות.
4. הסר פתרון ולשטוף 3 פעמים עם PBS לפני הוספת פתרון חסימה של BSA 0.1% (PBS) במשך 15 דקות. להסיר את זה ולשטוף 3 פעמים נוספות עם PBS לפני ההדמיה.

5. מיתוג הצפת הכנה

1. תן פתרון אנזים מניות () עם 10 μl של קטלאז (20 מיקרוגרם / מיליליטר), 20 μl של 1 M טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyelthyl) (4 מ"מ), 2.5 מיליליטר גליצרין (50%), 125 μlשל 1 M KCl (25 מ"מ), של ה-pH M 1 7.5 טריס-HCl (20 מ"מ) 100 μl, 5 מ"ג של גלוקוז אוקסידאז (1 מ"ג / מיליליטר) והעליון עד 5 מיליליטר נפח עם diH20. זה מספיק כדי להפוך את 100 x 50 aliquots μl, אשר ניתן לאחסן ב -20 ° C ומשמשים לתקופה של עד 1 שנה.
2. ) בצע פתרון גלוקוז המניה (ב ') עם גלוקוז 4 גרם (100 מ"ג / מיליליטר), 4 מיליליטר גליצרין (10%) ו36 diH20 מיליליטר. זה מספיק כדי להפוך את 100 x 400 aliquots μl, אשר ניתן לאחסן ב-- 20 ° C ומשמשים לתקופה של עד 1 שנה.
3. הפוך פתרון מניות סוכן הפחתה (C) עם 113.6 מ"ג של MEA-HCl (1M) ו1 מיליליטר של diH ₂ 0. השתמש טרי או להפוך 10 x 100 aliquots μl, אשר ניתן לאחסן ב -20 ° C ומשמשים לתקופה של עד 1 חודש (לא יקפיא aliquots).
4. רק לפני ההדמיה, לערבב את האנזים (), גלוקוז (B) וצמצום פתרונות מניות סוכן (ג) יחד בμl יחס 50, 400 μl, 100 μl ולעשות עד 1 מיליליטר עם PBS ^{* 6.} חיץ עכשיו זה יהיה לחפש חמצן ויש להם סביבת הפחתה (100 MEA-MMHCl) ^{* 7.} ה-pH הסופי צריכה להיות בטווח 6.0-8.5 (התאמה היא בדרך כלל לא הכרחית) ^{* 8.}

באור 6 - החיץ הזה הוא מתאים לשימוש עם צבעים מבוססי carbocyanine כגון Cy5 וAlexa 647.

באור 7 - ריכוזי האנזים הסופיים הם 50 מיליליטר / מיקרוגרם (5 יחידות / מיליליטר) של גלוקוז אוקסידאז ו1 מיקרוגרם / מיליליטר (40-60 יחידות / מיליליטר) של קטלאז. הפעילות האנזימטית (יחידות) ניתנת על ידי ספקים ויכולה להשתנות. החישובים עבור קטלאז להניח כי 1 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי לאחר שלב 5.4 יכיל 50 יחידות של אנזים. ניתן למצוא יצירות חיץ שונות, כולל רכיבי הדחה חמצן דומים ^21,30,40. לסיכום של שילובי חיץ ולצבוע לראות אזכור ^28,29. גליצרין וTCEP נדרשים לאחסון לטווח ארוך ב -20 ° C.

באור 8 - אם סיבי אקטין הדמיה מוסיף 2 מ"מ MgCl ₂ ו0.2 מ"מ ATP כדי לעזור לייצב tהוא החוטים.

6. מיקרוסקופ רכישת STORM נתונים (באמצעות Alexa 647 צבע)

1. לעבור על המיקרוסקופ STORM / PALM, לפחות 3 שעות ורצוי לפני ההדמיה כדי לאפשר ליושג שיווי משקל תרמי. יש הדמיה לפני זה סיכוי מוגבר של סחיפה.
2. הכנס את חדר ההדמיה לבעל מדגם הבמה מיקרוסקופ. להבטיח כי המדגם הוא בתקיפות בבעל ושטוח.
3. הסר את PBS מחדר ההדמיה ולאחר מכן למלא את החלק העליון עם חיץ המיתוג. בזהירות במקום coverslip על החלק העליון של החדר, ולוודא כי אין בועות בכלל וכי כל התא מכוסה. למעלה מעלה עם חיץ נוסף או PBS אם כל בועות נראות אחרת חיץ ביצועים יכולים לרדת.

זהירות - כדי למזער את הסיכויים של סחיפה לרוחב והצירית של המדגם ביחס לעדשה האובייקטיבית מומלצת שהמדגם והחיץ נותרים לאזןלטמפרטורת חדר במשך לפחות 15 דקות לפני ההדמיה.

4. אתר מבנה ניאון של עניין להיות צילם. בחר את הזווית הרצויה של תאורה, במקרה זה, TIRF או זווית נוטה מאוד מומלץ כמו זה משפר את יחס אות לרעש על ידי צמצום אור מחוץ לפוקוס, שהוא בעיקר של תועלת לדגימות תאים. קח תמונה עקיפה מוגבל התייחסות של המבנה לפני ההדמיה סערה.
5. להגדיל את עירור הלייזר (עם גל עירור מתאים של כ 640 ננומטר) למתח גבוה, המקביל לכ 2 כ"ס / ² סנטימטר תוך הדמיה עם הגדרות מצלמה של 10 חשיפה אלפיות וזמן מחזור של כ 50 הרץ (פריימים לשניה) . ברגע שfluorophores שהעביר לתוך תבנית מהבהבת דלילה (כנראה בתוך 10 שניות לרוב הדגימות) לאסוף 10,000 מסגרות ^{* 9.}

באור 9 - 10,000 מסגרות מתאים לדגימות שתוארו כאןאבל ייתכן שיהיה צורך להגדיל את מספר המסגרות ל50,000 או יותר לדוגמאות אחרות.

7. שחזור תמונות סופר החלטה מנתונים גולמיים (באמצעות סופת גשמים)

1. פתח את קובץ rainSTORM.m מתוך MATLAB ולהפעיל (איור 1 א).
2. בחלון סופת גשמים (איור 1) בחר את קובץ התמונה להיות מנותח באמצעות כפתור העיון. זה צריך להיות קובץ. Tif (ImageJ יכול לשמש להמרת סוגי קבצים אחרים לפורמט TIF). לשנות את רוחב פיקסל כדי להתאים את הנתונים הגולמיים של מערכת המיקרוסקופ ששמשה לרכישת נתונים ^{* 10.} השאר את הערכים האחרים לברירת מחדל.

הערה 10 - יש מצלמה EMCCD טיפוסית גודל פיקסל של 16 מיקרומטר כל כך על מערכת עם עדשה אובייקטיבית 100X גודל פיקסל בתמונה יהיה 160 ננומטר. במערכות מסחריות בגודל פיקסל מוצג בדרך כלל בתוך התוכנה. גדלי פיקסל להשתנות בין 100 ננומטר ו160 ננומטר עבור רוב המיקרוסקופים לוקליזציה.

3. לחץ על לחצן "תמונות תהליך 'ולחכות עד שתמונה ראשונית מופיעה. משך העיבוד יהיה תלוי בגודל הקובץ, מפרט מחשב ואת מספר מהבהב מועמד בתוך נתוני הגלם ^{* 11.}

הערה 11 - 10,000 רצפי מסגרת אקטין ונתונים EGF לקחו 23 שניות ו25 שניות לעבד בהתאמה באמצעות מחשב עם מעבד Intel Xeon E5420. משתמשים באותו מחשב בלי ארגז כלים עיבוד מקביל בMATLAB, או עם מחשב ללא עיבוד ליבה מרובה, פעמים היו 66 שניות ו81 שניות בהתאמה.

4. כדי ליצור עיתונות תמונה ברזולוציה סופר מעודכנת על הכפתור 'פתח סוקר' וחלון שני יופיע (תרשים 1C). לחץ על כפתור 'כוונון ניגודיות "על מנת לשנות את תצוגת התמונה כרצויה (1D איור). במקרים מסוימים, שבו התמונה היא כהה מאוד צריך להיות ירידת הערך המקסימאלי.
5. השתמש revחלון iewer (איור 1 ג) להפקת מדדי איכות תמונה שימושיות ולחדד את התמונה ברזולוציה סופר נוספת. הגדר את שלושת הפרמטרים בקרת האיכות הראשונות לערכים של 4,000, 0.1 ו0.8-2.0 בהתאמה ^{* 12.} לעדכן את הספירה לערך פוטון, שאמור גם להיות מבוסס על מדידת כיול פוטון או תוך שימוש בערכים עקום כיול פוטון עקום שצוינו על ידי יצרן המצלמה להגדרת רווח EM מסוים. זה קריטי להשגת דיוק מדויק ומדידות ברזולוציה ^{* 13.}

הערה 12 - ספירת האיתותים דוחה תהבהב על פי קריטריוני בהירות. ככל שהערך גבוה בהיר חייב להיות כהרף כדי להיות מקובל כמו לוקליזציה בתמונה הסופית. זה ייתכן שיהיה הצורך לשנות בהתאם את פלט הפוטונים של צבע וזמן חשיפה ואת הרגישות של המצלמה. הסובלנות דוחה תהבהב אם יש שגיאה מרובעת משמעותית בין האות וד כלומר גאוס המצוידפסגות ouble. טווח Sigma כוחות הביטחון הפלסטיניים דוחה יהבהב אם הרוחב המצויד של כוחות הביטחון הפלסטיניים נמצא מחוץ לטווח זה, כלומר בטווח צר יכול לשמש כדי לדחות אותות וכתמים מצטברים גדולים של הקרינה קבועה מחוץ לפוקוס. שימוש במגוון רחב יותר עלולה לגרום לחפצי mislocalization המופיעים בתמונה הסופית. בפועל, מומלץ לבצע בקרת איכות ראשונית באמצעות פרמטר הפסקת דיוק לוקליזציה.

הערה 13 - במשך יותר על מדדי רזולוציה רואה אזכור ^23,27. בקצרה על ידי לדעת את מספר הפוטונים המיוצרים על ידי כל למצמץ זה ניתן לחשב את דיוק הלוקליזציה של כל לוקליזציה וכתוצאה מכך להפיק כולל מתכוון הערכות מדויקות לכל התמונה. באמצעות אנדור iXon DU-897E עם הגדרת רווח של 200 הרוזנים לערך פוטון הוא 9.04.

6. לשנות את הפסקת דיוק לוקליזציה (איור 1 ג) לאיזון בין אופטימיזציה תמצית לוקליזציה ממוצעתיון נגד מספר לוקליזציה בתמונה הסופית. ערכים של 30-50 ננומטר מומלצים בהתאם לאיכות של הנתונים והמדגם. שני היסטוגרמות וקבצי info.txt יכולים לשמש כדי להודיע ​​על החלטה זו (1F דמויות ו1G).
7. גורם קנה המידה שיחזור ברירת המחדל (איור 1 ג) הוא 5, שיפיק פיקסלים ברזולוציה סופר של 32 ננומטר בהנחה שרוחב פיקסל בתמונות המקוריות הוא 160 ננומטר. אם יש תמונות גולמי גודל פיקסל של 100 ננומטר זה יהיה לייצר תמונות ברזולוציה סופר עם פיקסלים של 20 ננומטר. להגדיל את גורם קנה המידה כדי לייצר פיקסלים ברזולוציה סופר קטנים יותר בתמונה הסופית ^{* 14.}

הערה 14 - רזולוציה של מיקרוסקופ הלוקליזציה תלויה בהחלקה הדרושה להדמיה (כלומר, גודל פיקסל של שיקום היסטוגרמה פשוט) כמו גם דיוק הלוקליזציה. בפועל, גודל פיקסל שיקום בדרך כלל צריך להיות קטן יותר מהלוקליזציהדיוק (ראה מדד הממוצע Precision אומדנן בקובץ טקסט המידע - על השלבים 6.11 & 6.12). במקרה זה ההפסד של רזולוציה בהתאם לגודל פיקסל שיקום יהיה קטן ^23,27. לדוגמא הערכות דיוק הממוצעת בשורה ועמודה של כיוון איור 4E הן 16.1 ננומטר ו16.2 ננומטר. גודל פיקסל של 16 ננומטר כבר בשימוש כדי להמחיש נתונים זה (גורם קנה מידה שחזור של 10 עם רוחב פיקסל מקורי של 160 ננומטר).

8. שנה את טווח מסגרת מגבלה (איור 1 ג) כדי להגביל את השיקום לקבוצות משנה של נתונים הגולמיים, למשל [2001-inf] היה לכלול 2,000 המסגרות הראשוניות של נתונים גולמיים.
9. לחץ על לחצן 'הפעלה סוקר' (איור 1 ג) כדי ליצור תמונה מעודכנת רזולוציה סופר (איור 1E).
10. לחץ על לחצן "צפו בהיסטוגרמות '(איור 1 ג), על מנת להציג מדדי איכות תמונה (איור 1F) ^{* 15.}

הערה 15 - הגרף בפינה הימנית העליונה המתארת ​​את מספר מגויר קיבלו נגד מספר מסגרת המצלמה והיסטוגרמה בדיוק לוקליזציה תומפסון בפינה הימנית התחתונה (איור 1F) יכול לשמש כדי ליידע את אפשרות ביקורת הפסקת דיוק לוקליזציה. לדוגמא, באמצעות הפסקת 50 ננומטר היה לכלול את כל הגרסות המגוירות עם דיוק יותר גרוע מלהיות כלול בתמונה ברזולוציה הסופר הסופית.

11. לחץ על הכפתור 'שמירת התמונה' בסוקר (איור 1 ג) על מנת להציל את כל הנתונים הללו ^{* 16.}

אור 16 - ניתן לשמור בין 3 ל 5 קבצים בהתאם לאפשרויות שנבחרו (תמונת סיכום, STORMdataImage, STORMprocessed, מידע וhists), ראה איור 1G. התמונה המעובדת STORM מוצגת עם מפות ניגודיות וצבע שונה. STORMdataImage היא תמונה בגווני אפור, שבו הרמה האפורה של כל פיקסל שווה הקההאה של מגוירים שזוהו בתוכו.

12. תמורה לאחר שבחן את הנתונים (למשל Info.txt קובץ והיסטוגרמות) לשלב 7.6 וחזור על השלבים הבאים עם פרמטרים מבקר אחרים במקרה צורך. לחיצה על 'שמירת תמונה' בשלב 7.11 תחליף את הנתונים שנשמרו בעבר.

8. תיבת מעקב ותיקון הסחף (באמצעות סופת גשמים)

1. בצע את הפעולות 7.1-7.9 כדי ליצור תמונה בדרך הרגילה.
2. לחץ על לחצן "תיבת המעקב" בסוקר (איור 1 ג) ולחץ וגרור את תיבה מעל הסמן או מבנה fiducial ריבית על התמונה הנסקרת.
3. חכה עד שתמונה חדשה מופיעה, שיציג את "פוזיציות בקופסות" (ראו האיורים 6B, 6C ו6F לדוגמאות). שמור את התמונה הזאת אם תרצה בכך.
4. אם האובייקט של עניין הוא סמן fiducial אז להיסחף תיקון יכול להתבצע על ידי לחיצה על הכפתור "הגדרה עוגן" ואחריו "תתכפתור הסחף בדרכי '. לבסוף לחץ שוב 'רוץ סוקר' כדי ליצור תמונת STORM חדשה, שכעת יש את כל הגרסות המגוירות תוקנו בהתאם לעמדות סמן fiducial. עמדות חרוז נמחקות מהתמונה הנסקרת הסופית.
5. אם יש סמני fiducial אחרים בתוך התמונה להיסחף מתוקן הסופית, אלה ניתן להסיר על ידי לחיצה על 'תיבת המעקב', 'מחיקה בקופסות' ולאחר מכן פעמים רבות "רוץ סוקר 'בהתאם לצורך.

Results

Dextran

ציפוי מוצלח של dextran צריך לייצר monolayer ניאון. בריכוז הגבוה זה אמור להופיע אחיד יחסית. בריכוזים נמוכים יותר היא תופיע דלילה (איור 2 א). יש מיקרוסקופים STORM / PALM רבים את היכולת לשנות את הזווית של תאורה מepifluorescence לTIRF. בעת שימוש בתצוגת מצלמה מסגרת מלאה, למשל ב512 x 512 פיקסלים במצלמה EMCCD טיפוסית, יש לשים לב אפילו תאורה. אם יש פסים או אזורים מחוץ לפוקוס זה יכול להצביע על כך שהמדגם צריך להיות להכניס מחדש לבעל המדגם בשמן טרי על העדשה האובייקטיבית. לחלופין הוא עשוי להצביע על בעיה במיקרוסקופ.

בעת רכישת נתונים גולמיים רזולוציה סופר לייזר ההדמיה צריך להיות מוגבר בחשמל לכ 2 קילוואט / ² סנטימטר. יהיה פרץ ראשוני של הקרינה ואחרי מהבהבים כמו fluorophores מונעים בלמדינות חשוכות זמניות. בצפיפויות הגבוהה dextran מהבהב עשויים לחפוף, במיוחד סמוך לתחילת רכישת התמונה (וידאו 1). בצפיפויות בינוניות ונמוכות מהבהב אלה צריכים להיות דלילים, כלומר מופרדים מרחבית, ובפוקוס ללא רקע ברור (ראה מסגרות 2,000, 5,000 ו -8,000, איור 2 א, וידאו 2 ו -3). בשלב רכישת תמונה זו, בתאורת לייזר קבועה, מספר מהבהב יפחת עם זמן (השווה מסגרת 2,000 עם מסגרת 8,000 במדגם הצפיפות הגבוהה, איור 2 א). ההבדל העיקרי בין התמונות ברזולוציה סופר השונות של הריכוזים השונים dextran (גבוה, בינוני ונמוכה) הוא המספר הקטן והולך של גרסות מגוירות (2A דמויות ו2B). במילים אחרות, הריכוז של מולקולות ניאון, מספר מהבהב בנתונים הגולמיים ומספר הגרסות המגוירים לקיים יחסים פרופורציונליים. מערכת יחסים זו,עם זאת, הוא לא ליניארי אחד פשוט כמו בצפיפויות גבוהה מאוד מולקולת התוכנה אינה יכול למקם בהצלחה מולקולות (להשוות את הקווים האדומים וכחולים, איור 2C). הסיבה לכך היא שבריכוז הגבוה זה לא אפשרי עבור תוכנת העיבוד כדי להתאים את העמדות באמצעות האלגוריתם המתאים גאוס בי מהבהבים הם לא דלילים. כמהבהבים להקטין דרך שלב הרכישה בשל photobleaching התוכנה יכולה להתאים יותר ויותר של מהבהבים כאשר הם הופכים לדלילים (2A דמויות ו2C). יתר על כן, מולקולות צבע בודדות יכולות למצמץ, ולכן להיות מקומיות יותר מפעם אחת ^28,41,42.

בעיה נפוצה כאשר הדמיה כלשהי של דגימות אלה, אבל בעיקר בצפיפות הגבוהה dextran אחד, יכולה להיות הנוכחות של אובך ניאון בוהק, אך לא ממוקד שנראה שמהירות לשדר בשלב רכישת תמונת הסערה. זו שונה מfluorophores ניגודיות הגבוה עלפני השטח של הזכוכית, אשר ניתן לראות מהבהבים (איור 3 א, וידאו 5). ניתן למנוע מולקולות ניאון מנותקים אלה או הוסרו על ידי הגדלת מספר הצעדים לשטוף עם PBS לפני הוספת חיץ המיתוג או על ידי הוספת חיץ מיתוג טרי לתא (איור 3B, וידאו 6). עיבוד והשוואת הנתונים מתוצאות תמונה ברצף בתמונות ברזולוציה סופר שונות מאוד שבו יש ירידה בשני מספר המגויר והדיוק שבו הם יכולים להיות מצוידים בתוכנה כדי למקם את מהבהב (3C איורים, 3D, 3E ו3F).

סיבי יקטין

ניתן לראות סיבי אקטין preformed תקוע אל פני השטח של הזכוכית על ידי הדמיה עקיפה מוגבל (איור 4A-4C). אם המספר של סיבים מופיע נמוך מאוד, אז זמן דגירה ארוך יותר ניתן להשתמש או ירידה בהיקף של אקטיןפתרון נימה גם עוזר. בחירת חוטים בודדים יחסית בהירים (איור 4D) ולא תוצאות אזורים סבוכים בתמונות באיכות טובות יותר. בשלב הרכישה, יש לראות מהבהב בפוקוס בהיר לאורכו של חוט הלהט (וידאו 7). מהבהב דליל יש לראות בשלב הרכישה ולאחר מכן לאחר מכן בעיבודים צריך להיות שיש נימה דקה רציפה (איור 4E) ומגויר לכל מסגרת צריכה ירידה הדרגתית (איור 4F), שלא כמו באיור 3E.

אם מהבהב הוא שאינם דליל, או אם התוכנה לא להיות מסוגלת למקם את המולקולות, חפץ עדין יותר, שנקרא mislocalization ^32, עלול לגרום. זו מתעוררת כאשר ממוצעי תוכנת המיקום של שתי מולקולות חופפות והלוקליזציה היא עמדה באמצע דרך ביניהם. אינדיקציה לכך שלא קיים כבר מספר לא מבוטל של חפיפת BLInks, וכתוצאה מכך mislocalizations, הוא כי אומדני הדיוק הממוצעים צריכים להיות זהים בכיווני השורות ועמודות, כלומר אופקי ואנכי, שבו יש mislocalizations האלה היו מתרחשים לאורכו של חוט הלהט, שהופק גדול ממצמוץ רגיל ( כלומר משתרעים על פני יותר פיקסלים), שכתוצאה מכך היו מקומי עם פחות דיוק באחד הכיוונים. הדבר בא לידי הביטוי בקלות בו יש נימה אקטין יחידה באזור ההדמיה והוא שוכב בצורה אופקית או אנכי. במקרה זה, את המיקרוסקופ הסערה, השיג דיוק ממוצע של 16 ננומטר בשני הכיוונים. התוצאה היא מגבלת דיוק, מידה של רזולוציית תמונה האפקטיבית של כ 34 ננומטר. מדדים אלה ניתנים על ידי ²⁷ סופת גשמים, עם זאת, כפי שיש לנו מבנה פילמנטיות בקוטר אחיד, 7 ננומטר עם phalloidin-Alexa 647 התווית קטנה מאוד שאנחנו יכולים לקחת מידה של FWHM להעריך את הרזולוציה של התמונה. על ידי DRAאגף קו ישר דרך חוט הלהט של התמונה ברזולוציה הסופר בImageJ (איור 4G), תוך שימוש בתכונת פרופיל עלילה (איור 4H) ולאחר מכן ביצוע גאוס כושר (איור 4I) FWHM מחושב כ43.2 ננומטר. כאשר מנסה מדידה זו אנו ממליצים כי גודל פיקסל צריך להתאים או להיות מעט קטן יותר מאומדן הדיוק הממוצע לתמונה (ראה קובץ info.txt איור 1G). במקרה זה, 16 פיקסלים ננומטר שימשו לשחזר תמונה.

שתי בעיות הקשורות יכולות להתרחש עם סערה, שבי fluorophores המהבהב יהפוך כלומר מולקולות שאינן דלילות, בודדות בתוך כ 250 הרף ננומטר באותו הזמן, ולכן האותות חופפים. הראשון הוא כי בהתאם לאלגוריתם וקריטריוני בקרת איכות שהוא משתמש, הנורית לא יכולה להיות מקומית בכלל. התוצאה היא תמונות ברזולוציה סופר עם מעט או לא מגויר. הבעיה השנייה שלmislocalizations מתרחש כאשר שני מהבהבים התרחש קרוב מספיק זה לזה כדי להופיע כהרף אחד. במקרה זה את העמדה בתמונה הסופית מייצגת ממוצעת של שתיים. לפרטים נוספים על זה ראה התייחסות ^32. בשני המקרים זה יכול להתרחש עם דגימות צפיפות גבוהות מאוד, כוח הלייזר מספיק או עם מיתוג בעיות חיץ. בעיה זו היא לכאורה שבו מספר של סיבי אקטין הסתעפות ו / או חוצה זה את זה (איורים 5A-D, 9 וידאו). על ידי עיבוד תת קבוצות של מסגרות, ומשווה 5,000 המסגרות הראשונות ואחרונה שאנחנו יכולים לראות את תמונה וכתוצאה מכך שונה. בתמונה ברזולוציה סופר באמצעות 5,000 המסגרות הראשונות (איור 5 ג) אנו יכולים לראות כי יש מגוירים רבים באמצע התמונה, אולם בעת השימוש ב5,000 המסגרות שעברה, מעט מאוד מאלו יבואו לידי הביטוי ואנחנו נשארים רק עם החוטים, אם כי במידה מסוימת רציף חיב המספר הנמוך של מגוירים במתארים לעצמידואר (איור 5D). אם צפיפות מהבהב גבוהה מדי חשודה השוואה של התמונות עם הלוקליזציה לנתוני מסגרת יכולה מאוד מציעה כי בעיה זו מתרחשת, במהלך הסט הראשון של מסגרות קיים מספר ממוצע של מגוירים לכל מסגרת של מעל 10 לעומת הסט האחרון של מסגרות שבו הוא (5E איור) כ 4. על מנת למזער את הסבירות להתרחשות mislocalizations זה אידיאלי יש כמה כמו מגויר לכל מסגרת האפשרית, אם כי אם יש מספר גדול של מולקולות להיות צילמו, כלומר למדגם בצפיפות גבוהה, זה דורש כי מספר גדול של רכישה להילקח מסגרות מובילות לבעיה אחרת במיקרוסקופיה STORM שהיא להיסחף.

רוחב הסחף - סיבי תקטין ועטים Fiducial

הסחף מתרחש כאשר מהלכי המדגם ביחס לעדשה האובייקטיבית דרך שלב רכישת נתונים. זה קשה או בלתי אפשרי לראות דוריןגרם שלב רכישת תמונה, במיוחד אם זה לרוחב ולא צירי, או אלא אם כן הוא מתבצע באופן ספציפי שנמדד, כפי שהוא בדרך כלל פחות מ 50 ננומטר במשך כמה דקות למערכות מיקרוסקופ יציבים יחסית. עם זאת, בתמונות משוחזרות של מבנים ידועים כמו סיבי אקטין עם מבנה מוגדר היטב, זה יכול להיות מזוהה בתמונות ברזולוציה סופר. הסימן הראשון לכך להיסחף לרוחב ייתכן שאירעו הוא שהמבנה הוא גדול מהצפוי (תרשים 6A, וידאו 8) למשל עם FWHM גדול יחסית בהשוואה לנתונים מגבלת דיוק מסופת גשמים, במקרה זה 90 ננומטר לעומת 67 ננומטר. עם זאת, דרך טובה יותר לזהות סחף היא על ידי השוואה לגרסות המגוירות כפונקציה של זמן, כלומר לראות אם המגוירים במסגרות אחר כך הם עקורים בהשוואה לאלו במסגרות מוקדמות. ניתן לראות זאת במקרה של סיבי אקטין, שהם מאוד קטנים ומבנה אחיד, באופן ברור, כאשרמוצג עם קוד צבע באמצעות תכונת מעקב התיבה בסופת גשמים (6B דמויות ו6C).

הסחף הוא בעיה מוכרת היטב ויש מספר האסטרטגיות שניתן להשתמש בם כדי למזער אותו ¹⁹ או לתקן אותו לאחר הרכישה או באמצעות סמני fiducial ^21,43 או מתאמים צולבים ^44. על מנת למדוד את הסחיפה ונכונה עבורו, חרוזי ניאון של 100 קוטר ננומטר יכולים לשמש כסמני fiducial (איור 6 ד '). בגלל שהם קטנים ובהירים את עמדתם ניתן למדוד במדויק באמצעות אלגוריתמים מתאימים גאוס, כגון סופת גשמים. בדוגמה שבו יש סחף חמור יחסית של כ 100 ננומטר במשך 3 דקות 10 שניות, בשלב הרכישה (איור 6E), תכונת המעקב אותה התיבה יכולה לשמש לקוד צבע ולאשר סחף שחל (איור 6F ). כפי שכל ארבעת חרוזים בדוגמא זו מראים סחף כמעט זהה זה possible כדי לבחור אחד מהם, במקרה זה חרוז 2, לשימוש כנקודת התייחסות ולהפחית את הנדידה מהחרוזים האחרים (איור 6G). על ידי הוספת סמני fiducial לדגימה ביולוגית של עניין זה אז ניתן יהיה למדוד ולתקן כל סחף שבו המבנה הבסיסי אינו ידוע או הרבה יותר משתנה מנימה אקטין או חרוז ניאון.

עוריות Growth Factor

לבסוף, ניתן להשתמש בתאי הלה צבעוניים EGF לתת דוגמא מציאותית של רזולוציית תמונה בתאים (איור 7 א, וידאו 10). תאים אלה הם פשוטים יחסית לתמונה כצריכה יש להם רוב של EGF-הקרינה במוקד המטוס-of-בתא השטח בסמיכות לcoverglass. האזור פחות הבהיר במרכז תואם את עמדתו של הגרעין. תאורת TIRF יכולה לשפר את איכות תמונה על ידי ביטול הקרינה מחוץ לפוקוס המגיע מחלקים מ 'התאembrane לא בסמיכות לכוס (כ 150 חדירת ננומטר לתוך תאים). הוגדל באזורים של עניין בתמונה העקיפה מוגבל הם בדרך כלל לא ברורים (7 ב דמויות ו7C), לעומת זאת בתמונות ברזולוציה סופר צריכה להיות תערובת של אשכולות ופיקסלים בודדים מבודדים מדי פעם (איורים 7D-7F). אלה לייצג גם קולטני EGF מבודד על פני התא או אפשרי כמות קטנה של מחייב שאינו ספציפי. האשכולות יהיו כ 100 ננומטר בקוטר צפויים מתאימות לבורות להרכיב ושלפוחית, המסלול שדרכו EGF הוא למטה מוסדר בעיקר וendocytosed. הערכות דיוק ממוצעים אופייניות הן סביב 20 ננומטר עבור סוג זה של מדגם עם מגבלת דיוק של כ 45 ננומטר. יש לציין כי מדד מגבלת הדיוק הזה של רזולוציה אפקטיבית אינו לוקח בגודל תווית חשבון, או כל הנדידה, שניתן למדוד עם סמני fiducial, אבל הוא עדיין noticeable ידי "זנבות שביט" באשכולות או באמצעות תכונת מעקב התיבה כפי שמתואר באיור 6 ומתוארים בסעיף 8 בפרוטוקול.

רכיב	ריכוז סופי
קטלאז	1 מיקרוגרם / מיליליטר (50 יחידות)
גלוקוז	40 מ"ג / מיליליטר
גלוקוז אוקסידאז	50 מיקרוגרם / מיליליטר
גליצרין	12.50%
KCl	1.25 מ"מ
MEA-HCl	100 מ"מ
TCEP	200 מיקרומטר
טריס	1 מ"מ

לוח 3. החלפת חיץ

הגדרות רכישה טיפוסיות	ערך
גודל פיקסל (ננומטר)
זמן חשיפה (אלפיות שני)	10
השג	200
גודל מסגרת (פיקסלים)	128 x 128
זמן מחזור (fps)	52.5
מספר מסגרת	10,000
640 צפיפות הספק לייזר ננומטר (קילוואט / 2 סנטימטר)	2

160

לוח 4. הגדרות רכישה

איור 1. שחזור תמונת STORM שימוש בסופת גשמים. () פתיחת סופת גשמים מתוך MATLAB. (ב) ממשק משתמש גרפי סופת גשמים (GUI). (C) סופת הגשם סוקר GUI. (ד) התאם חלון ניגוד. (ה) תמונת STORM לאחר בדיקה והתאמת ניגוד. (F) שלוtograms של מדדי איכות תמונה. (G) קבצים שנוצרו לאחר הלחיצה על כפתור שמור תמונה בGUI מבקר. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

תמונות השתברות איור 2. () מוגבלות (DL) מראות ריכוזים שונים של לפני dextran ההדמיה סערה. יש שחזורי תמונה ברזולוציה סופר (SR) גודל פיקסל של 25 ננומטר. 10,000 תמונות נאספו עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת ומסגרות בודדות מוצגים מרצף ש( 2,000, 5,000, 8,000). רכש עם זמן 10 חשיפת msec ב52.5 פריימים לשניה. יש תמונות בגודל פיקסל של 160 ננומטר. לשם בהירות של צפייה 0.1% שיפור לעומת הרוויה פיקסל יושם באמצעות ImageJ. הדיוק הממוצעהערכות הן 28 ננומטר (גבוה), 24 ננומטר (בינוני) ו16 ננומטר (נמוך) לתמונות dextran השונות. צפיפויות הלוקליזציה הן 724 למיקרומטר ² (גבוה), 526 למיקרומטר ² (בינוני) ו13 לאממ ² (נמוכים). (ב) תרשים המציג ממוצע של שלושה רצפי 10,000 מסגרת של כל ריכוז של dextran. ברים שגיאה מראים סטיית תקן. (C) תרשים זומם מספר המגויר מקובלים לכל מסגרת שימוש ממוצעת מסגרת 100 מתגלגל. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3. איכות גרועה Dextran נתונים. () מסגרת מוגבלת השתברות מתוך רצף 15,000 STORM המסגרת. שים לב לאובך הניאון המפוזר על פני התמונה. זו נגרמת על ידי fluoropho מיל לשדר דרך המדיום. 128 x 128 גודל פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. (ב) זהה (א ') לאחר החיץ היה שונה. שים לב לניגוד השתפר כfluorophores מאוגד כבר נשטף. (ג) שחזור תמונה ברזולוציה הסופר המתאים לנתונים שנאספו ב (א). גודל תמונה זהה אבל עם פיקסלים של 25 ננומטר. אומדן הדיוק הממוצע הוא 35 ננומטר. (ד) שחזור תמונה ברזולוציה הסופר המתאים לנתונים שנאספו ב( ב '). גודל תמונה זהה אבל עם פיקסלים של 25 ננומטר. אומדן הדיוק הממוצע הוא 30 ננומטר. (ה) תרשים זומם מספר המגויר מקובלים לכל מסגרת, תוך שימוש בממוצע מסגרת 100 מתגלגל. הקו האדום מתאים לרצף STORM (& C) שבו יש רקע גבוה. הקו הכחול מציג נתונים המתאימים (B & D), שבו הרקע הוא נמוך. (F) תרשים המציג את מספר הלוקליזציה המקובלת לתמונות המתאימות לגבוה (C) ונתוני רקע (ד ') נמוכים.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 4. אופייניים אקטין נתונים. תמונות (AC) מוגבל דיפרקציה של סיבי אקטין לפני תוספת של מיתוג חיץ והדמיה סערה. אורכים משתנה של סיבים ניתן לראות. חוטים בהירים מאוד לעתים קרובות כמה חוטים סבוכים יחד. גודל פיקסל הוא 160 ננומטר. תמונה עקיפה המוגבל של נימה אקטין יחידה (ד '). (ה) תמונת STORM (שיפור לעומת 0.1% מיושם בImageJ). מתוך רצף 10,000 מסגרת עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. גודל פיקסל הוא 16 ננומטר. אומדן הדיוק הממוצע הוא 16 ננומטר. (F) תרשים זומם מספר הלוקליזציה המקובלתs לכל מסגרת, תוך שימוש בממוצע מסגרת 100 מתגלגל. (G) מוגדל באזור של נימה אקטין מ( E) לפני לעמת שיפור בפרופיל קו צהוב נמשך על פני. צפה בפרופיל עלילה מהקו הצהוב נמשך על פני נימה אקטין (H). נוצר בImageJ. (I) בכושר גאוס של פרופיל העלילה באמצעות הכלי המתאים העקום בImageJ. סטיית התקן, ד, הוכפל ב 2.35 כדי לקבל מדידת FWHM של 43.2 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 5. Mislocalized אקטין חוטים. () נימה אקטין עקיף מוגבלת. 160 פיקסלים ננומטר. תמונת STORM (ב) לנימה אקטין מוצגת ב( א '). מתוך רצף 20,000 מסגרת עם Fram פיקסל 128 x 128גודל דואר, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכש ב52.5 פריימים לשניה. גודל פיקסל STORM הוא 16 ננומטר. כל 20,000 המסגרות עובדו. אומדן הדיוק הממוצע הוא 17 ננומטר. (ג) כ( ב '), אבל רק עם 5000 המסגרות הראשונות של רצף 20,000 מסגרת מעובד. אומדן הדיוק הממוצע הוא 18 ננומטר. (ד ') כ( ב'), אבל עם רק 5,000 המסגרות האחרונות של רצף 20,000 מסגרת מעובד. אומדן הדיוק הממוצע הוא 17 ננומטר. גרף (E) של גרסות מגוירות לנתוני מסגרת מתצוגת מסגרת מלאה 128 x 128 פיקסל.

איור 6. רוחב הסחף. (א) תמונת STORM של נימה אקטין שוחזרה מתוך רצף 10,000 מסגרת עם גודל 64 x 64 מסגרת פיקסל, 10 זמן חשיפה אלפיות ונלקחו ב64.6 פריימים לשניה. גודל פיקסל STORM הוא 32 ננומטר. אומדן הדיוק הממוצע הוא32 ננומטר. (ב) תמונת STORM מוצגת באמצעות התכונה 'תיבת המעקב' בסופת גשמים. מגוירים מוצגים עם צבע שמתאים למספר המסגרת של עת רכישתן, למשל, מגוירים ממוקדם ברצף הרכישה הם כחולים; מגוירים מהסוף ברצף הרכישה הם אדומים. עקורי הצבעים מצביעים על כך שהסחף התרחש. (ג) בטיסה באזור () מוצג באמצעות תכונת קופסא המעקב בסופת גשמים. עקורי הצבעים מצביעים על הנדידה התרחשה. (ד) תמונת התאבכות מוגבלת של ארבעה 100 חרוזי ניאון ננומטר, אשר יכול לשמש כסמני fiducial. גודל פיקסל 160 ננומטר. מספרים מראה 1-4 קצוצים ודהרו חרוזים בנפרד. (ה) כל חרוז ניאון המתאים (ד ') שוחזר בסופת גשמים מרצף 10,000 מסגרת עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. גודל פיקסל STORM הוא 5 ננומטר. אומדן הדיוק הממוצע הוא 7 ננומטר. חרוזים (F) המתאימים ל( ד) ו (ה),מוצג באמצעות התכונה 'תיבת המעקב'. עקורי הצבעים מצביעים על הנדידה התרחשה. (ז) שימוש בחרוז מספר 2 כהתייחסות, חרוזים 1, 3 ו -4 מוצגים לאחר התכונה 'חיסור הסחף "משמש בסופת גשמים. השוואה עם (ה ') מראה כי להיסחף לרוחב תוקן. גודל פיקסל STORM הוא 5 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 7. אופייניים EGF נתונים. (א) תמונה מוגבלת השתברות של חלק מתא הלה התמקד על פני השטח של תאים הבזליים. צהובים תיבות מצביעות על הגדלה באזורים של עניין מוצגים ב( B) & (C). (ב) הוגדל בתמונה מוגבלת עקיפה מהאזור הסמוך לקצה של התא (תיבה ב '). (ג) הוגדל בעקיפה מוגבלת תמונה מהאזור מתחת לגרעין (C תיבה). (ד) תמונת STORM המתאימה (). מתוך רצף 10,000 מסגרת עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. גודל פיקסל STORM הוא 25 ננומטר. אומדן הדיוק הממוצע הוא 21 ננומטר. (ה) תמונת STORM המתאימה לתיבת דואר (ד '). (F) תמונת STORM המתאימה לתיבת F (ד '). (G) Localizations לנתוני מסגרת מ( ד '). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

. וידאו 1-4 וידאו מתאימות לאיור 2A עם ריכוזי dextran שונים: 1 = גבוה 2 = בינוני, 3 = 4 = נמוך אף אחד,,). 10,000 רצפי מסגרת עם 128 x 128 גדלי מסגרת פיקסל, שנרכשו עם זמן 10 חשיפה אלפיות שנייה ב52.5 פריימים לשניה. לחצו כאן לצפייה בוידאו 1,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> וידאו 2, 3 וידאו, וידאו 4

וידאו 5-6. וידאו מתאימות לאיור 3 & B. וידאו 5 הוא קדם שטיפה ווידאו 6 הוא לשטוף את הפוסט לאחר fluorophores מאוגד הוסר. 15,000 רצפי מסגרת באמצעות גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכש ב52.5 פריימים לשניה. לחצו כאן לצפייה בסרטון 5, 6 וידאו.

וידאו 7. וידאו המראה את רצף מסגרת הגלם שיעובד על מנת ליצור את תמונת הסערה באיור 4E. 10,000 seque מסגרתNCE עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. לחץ כאן לצפייה בוידאו 7.

וידאו 8. וידאו המראה את רצף מסגרת הגלם שיעובד על מנת ליצור את תמונת הסערה באיור 5. רצף מסגרת 20,000 עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. לחץ כאן לצפייה בוידאו 8.

וידאו 9. וידאו המראה את רצף מסגרת הגלם שיעובד על מנת ליצור את תמונת הסערה באיור 6 א. רצף מסגרת 10,000 עם גודל 64 x 64 מסגרת פיקסל, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונלקח ב64.6 פריימים לשניה. CLIck כאן לצפייה בוידאו 9.

וידאו 10. וידאו המראה את רצף מסגרת הגלם שיעובד על מנת ליצור את תמונת הסערה באיור 7D. רצף מסגרת 10,000 עם גודל 128 x 128 פיקסל מסגרת, 10 זמן חשיפה אלפיות שני ונרכשו ב52.5 פריימים לשניה. לחץ כאן לצפייה בוידאו 10.

Discussion

אנחנו מראים עם כמה דגימות בדיקה פשוטות וסופת גשמי תוכנת עיבוד באופן חופשי, הזמינים שאפשר לייעל את ההדמיה ברזולוציה סופר סערה. כלים ושיטות אלה יספקו נקודות התחלה שימושיות עבור משתמשים חדשים ודרכים למשתמשים מנוסים כדי להגביר את האמון במיקרוסקופים שלהם והשימוש שלהם באותם ללמוד מבנים ביולוגיים ותאיים עם פירוט חסר תקדים. באמצעות שילוב של דוגמאות עם מבנים ידועים או מובנים ואלגוריתם שיכול לייצר מספר מדדי איכות תמונה השימושיים, כגון הערכות ממוצעת דיוק, מספר לוקליזציה והיסטוגרמות מראה שניתן לשפר את איכות תמונה ויש ביטחון גדול יותר בתהליך ההדמיה הסערה. אין אחד בגודל מתאים לכל הגישה לרכישת נתונים כמו שיש מספר תצורות מיקרוסקופ המסחריים ועצמיות בנויים שונות שניתן להשתמש בם. יתר על כן, יש הכנת מדגם רבות ותמונת צעדי רכישה אשר יכול influence התמונה הסופית ולכן יש כלי תוכנה ודגימות בדיקה היא קריטית להבנה וייעול איכות תמונת סערה.

בנוסף פרוטוקולים אלה יכולים לספק דרכים שימושיות ופחות מעורפלות של פתרון כל בעיות שעלולות להתעורר. לדוגמא מדגם dextran הוא דרך מאוד שימושית כדי לזהות אם יש חוסר תיאום קרן לייזר או תאורה לא אחידה של המדגם. אם יש חששות שחיץ המיתוג לא יכול לעבוד חזותית בדיקה פשוטה מאוד, כדי לראות אם יש בכלל 'מהבהב' יעזור. סיבי אקטין הם דרך יעילה למדידת רזולוציה באמצעות השוואות FWHM כמו גם הדגשת חפצים להיסחף וmislocalization. עם זאת, יש לציין כי בשיטות רזולוציה סופר מבוסס לוקליזציה יכולה להיות צפיפות fluorophore רגישה, על אף גורמים תורמים האחרים, כגון זמני חשיפה, מסגרת חליפין, סמכויות לייזר ואת הדרך את התמונה מעובדת, אי אפשר להקצות החלטהמיקרוסקופ המסוים ולהניח שכל התמונות תהיה ברזולוציה זו. מה אפשרי, עם זאת, הוא למדוד היבטים שונים של רזולוציה כמוהם בדיוק הלוקליזציה ממוצעת, מספר לוקליזציה ולהיסחף ^27. גם אם לא ניתן לשלב סמני fiducial לכל ניסוי שהם יכולים, לפחות, לשמש כדי לאפיין מערכת מיקרוסקופ, סביבתו ולהבין טוב יותר את השיקולים מבצעיים כגון כיצד נדרש הרבה זמן כדי להגיע לשיווי משקל תרמי לאחר להתחיל. כמו גם תיקון לסחיפה לרוחב, יכולים לשמש סמנים fiducial לאפיין ונכון לסחיפה צירית, אם כי זה דורש שימוש בעדשת astigmatic ומנגנון משוב כדי לתקן את העמדה המדגם בעוד התמונות הנרכשות ^43. מערכות רזולוציה סופר מסחריות בדרך כלל יכללו סוג מסוים של בקרת יציבות או מנגנון להתמקד נעילה, מה שעשוי להיות פתרון מעשי יותר לתיקון סחיפת פוקוס.

ישמחדש חלופות הלא ספציפי ציפוי הזכוכית עם dextran, כגון שימוש בצבעים באופן ישיר או מולקולות המצומד אחרות, כגון נוגדנים משני. הגבלה של גישות אלה היא כי מספר המולקולות נקשרות לזכוכית אינו ידוע. מבני פילמנטיות אלטרנטיביים שהיה בשימוש כוללים microtubules ²⁸ ו-DNA ^21. עם זאת, השילוב של גודל קטן מאוד וחומרים כימיים זמינים מסחרי נוחים לעשות יקטין חלופה אטרקטיבית, בעיקר כמרחק ההפרדה של סיבים לסטות או קנים יכול להיות גם שימושית מדידה של ביצועי מערכת ^27.

יש מקום לפיתוח נוסף של דגימות בדיקה, למרות ההתקדמות האחרונה בתחום זה ^28,29,46,47. בפרט, הדמיה צבע רב מציגה מספר האתגרים בכל 3 ההיבטים העיקריים של ההדמיה, תיוג מדגם, רכישת תמונה (חומרה), ותוכנה (עיבוד תמונה ויישור). היומספר הפרסומים העוסקים בהיבטים אלה ^4-6 ולכן ברור כי דגימות בדיקה מתאימות ומתודולוגיות הן קריטיות ליצירת אמינות ובלפרש אלו סוגים של תמונות. ואכן, לאחרונה זה היה הראה כי dSTORM יכול לשמש כדי לקחת שתי תמונות צבע של, ולפתור, הטבע סימטרי מאוד של המתחם הנקבובית הגרעין והמחברים הציעו שזו תהיה דרך אידיאלית כדי להעריך את הביצועים של תיקוני סטייה כרומטית ^45. גישה מעניינת נוספת היא השימוש באוריגמי של DNA כדי ליצור nanoruler, אשר יוצרת את האפשרות של fluorophores מיצוב במלבד ⁴⁶ מרחקים תת עקיפה ספציפיים. זה מספק דרך להעריך החלטה וביצוע מדידות מרחק. עם זאת, המטרה הסופית היא ליישם טכניקות הרזולוציה סופר אלה לדגימות שאינן אידיאליים, כגון תאים, שהם שלושה מבנים ממדיים מורכבים. במקרה זה, שילוב של הבנה מעמיקה יותר של tהוא טכניקה בשילוב עם כלי תוכנה שיסייעו למשתמשים ברכישת נתונים, עיבודו בדרכים מתאימות, ומתן תמונת מדדים עשויה להיות התשובה האולטימטיבית. ^28,29,47,48

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Imaging chamberglass	Fisher	CBR-166-390E	הכנת דגימה
מיקרוסקופ הפוך	Olympus	IX71	* ראה להלן לחלופות
100 X TIRF Objective Lens	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* ראה להלן לחלופות
EMCCD Camera	Andor	iXon 897	* ראה להלן לחלופות
לייזר	640 ננומטרToptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - להדמיית צבעי Alexa 647 או Cy5
	LabVIEW National Instruments		*תוכנת רכישה (שליטה בחומרה)
PC	Dell		Windows XP (64 סיביות), מעבד Intel Xeon E5420, זיכרון RAM של 16 GB *בקרת מכשירים ועיבוד תמונה
ImageJ			ניתוח ועיבוד תמונה http://rsbweb.nih.gov/ij
rainתוכנת STORM	Laser Analytics Group (Cambridge) <		a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*דוגמה למיקרוסקופי			בעצמם ראו גם הפניה 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*מיקרוסקופים מסחריים ברזולוציה גבוהה של STORM/PALM Leica			SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) חלופות למיקרוסקופים שנבנו בעצמם
טבלה 1. חומרים & ציוד
[header]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
מאגר אקטין כללי	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
חוטי אקטין מוכנים מראש	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
TetraSpeck Microspheres (0.1 מיקרון)	Invitrogen	T-7279	3.1
תאי HeLa	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
עט/שלב	Invitrogen	15070063	4.1
כלי פלסטיק	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
פורמלדהיד - 10% תמיסה EM	כיתה Polysciences	04018-1	4.2
Catalase	Sigma	C100	5.1
גלוקוז אוקסידאז	סיגמא	G2133	5.1
KCl	סיגמא	P9541	5.1
TCEP	סיגמא	C4706	5.1
טריס	סיגמא	93352	5.1
גלוקוז	סיגמא	C7528	5.2
MEA-HCl	סיגמא	M6500	5.3
גליצרין	סיגמא	G2289	5.1; 5.2
<חזק>טבלה 2. ריאגנטים