מאמר שיטה

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

DOI:

10.3791/50597

⸱

6 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר של תאים בתרבית (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה חשובה לתוך מערכות ביולוגיות מורכבות. שיטות וציוד קונבנציונליות לניתוח במבחנה מתאימות גם ללמוד ממספר גדול של תאים (≥ 10 5) בכמויות בקנה מידת מ"ל (≥ 0.1 מ"ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם הוא נחוץ או רצוי להקטין גודל התרבות כדי להפחית את הצריכה של התאים של ריבית ו / או חומרים כימיים הנדרשים לתרבות שלהם, גירוי, או עיבוד. למרבה הצער, גישות קונבנציונליות אינן תומכות במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות מיקרו בקנה מידה, ואת המערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע הם מורכבות ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 - 2000 תאים) בנפח מיקרו בקנה מידהs (1 - 20 μl). הפלטפורמה מורכבת מסדרה של microcapillaries פיברונקטין מצופה ("תאי זלוף תא"), שבתוכה תרבויות מיקרו בקנה מידה שהוקמה, מתוחזק, והמגורה; התקן דיגיטלי מיקרופלואידיקה (DMF) לבוש עם "העברה" microcapillaries ("מוקד המרכזי "), שבו תאי מסלולים וריאגנטים ומתאי זלוף; משאבת מזרק דיוק גבוה, אשר סמכויות הובלה של חומרים בין תאי זלוף והמוקד המרכזי; וממשק אלקטרוני המספק שליטה על הובלה של חומרים, שהוא תיאם ואוטומטי באמצעות תסריטים שנקבעו מראש. כדוגמה, השתמשנו בפלטפורמה כדי להקל על מחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים. שימוש בפלטפורמה אפשרה לנו להפחית את הצריכה של תאים ריאגנטים, למזער את שונות ניסוי לניסוי, ומחדש ישירות הידיים על עבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, כמו גם הנגישות שלה ורבגוניות, oפלטפורמת ur צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים, ולהיות שימושית במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים שאינם זמינים בכמויות מוגבלות בלבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של תאים נשמר בתרבות (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה רבת ערך לעקרונות היסוד והמנגנונים מולקולריים השולטים במערכות ביולוגיות מורכבות ועל בריאות אדם. את השיטות המקובלות לתרבות, גירוי, ואוסף של תאים לניתוח, אשר מנצלים צלחות פטרי וצלחות microtiter, נועדו למחקר של אוכלוסיות גדולות של תאים (≥ 10 5) בכרכי תרבות מ"ל בקנה מידה (≥ 0.1 מ"ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם רק כמויות מוגבלות של תאים זמינות (תאים ראשוניים לדוגמה), או אוכלוסיות קטנות של תאים רצויים (לדוגמה, כדי להפחית את התא אל תא השתנות פני האוכלוסייה), או חומרים כימיים הנדרשים הם קשים להשגה או יקר מדי (למשל גורמים מטוהרים תא מופרש). בעיות מסוג זה יכול להיות מטופל בהצלחה על ידי שינוי קנה מידה למטה גודל התרבות, שבו יש לו היתרון נוסף של הפחתת הצריכה של כלחומרים כימיים הנדרשים לניתוח ב1,2 המבחנה. לרוע המזל, ציוד ושיטות קונבנציונליים אינם תומכים במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות בקנה מידת מיקרו והמערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע 3-11 הם מורכבים ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי.

בדו"ח זה, אנו מתארים הרכבה ושימוש בפלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 - 2000 תאים) בכמויות בקנה מידת מיקרו (1 - 20 μl). ארכיטקטורת הפלטפורמה (איור 1) היא מודולרי בעיצוב: קבוצה של פיברונקטין מצופה microcapillaries ("תאי זלוף סלולריים" מודול) משמש כאתר להקמה, תחזוקה, וגירוי של תרבויות מיקרו בקנה מידה; ומיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF ) מכשיר 12,13 לבוש עם "העברה" microcapillaries (מודול "המרכזי רכזת") 14,15 תאי מסלוליםוריאגנטים ומתאי זלוף. DMF מאפשר למשתמש לטפל בנפרד טיפות מרובות בו זמנית ולשנות מחדש או להזמין את המניפולציות (רכבות עיבוד מדגם להגדיר מחדש כלומר) מבלי לשנות את חומרת המכשיר. הגמישות העצומה שלו באה לידי ביטוי בהופעה האחרונה שלה כטכנולוגיה מרכזית במגוון רחב של יישומים, כולל תא תרבות 16,17, מבחני אנזים 18,19, 20,21 immunoassays, ה-DNA ניתוח 22,23, עיבוד חלבון, 24,25 ועיבוד דגימה קליני. 26,27 המוקד המרכזי שלנו מנצל את הגמישות המובנית למכשירי DMF, ומשפר עוד יותר אותו באמצעות תוספת של ממשקי microcapillary, אשר מספק הזדמנות לבצע את משנה של מניפולציות (תרבית תאים לדוגמה) בהיקפי מיוחד מודולים, ולא על המכשיר עצמו. DMF מידור של רכבות עיבוד בדרך זו גם מפשט את התכנון של PLAtform ארכיטקטורה (אין צורך לבנות מכשיר DMF שיכול לבצע את כל פעולות העיבוד) ומאפשר ההתפתחות שלה כפונקציות חדשות נדרשות (פשוט לשלב מודולים חדשים פריפריה בהתאם לצורך). הובלה של תאים ריאגנטים בתוך המוקד המרכזי היא מונע על ידי כוחות חשמלית הנוצרים על ידי הפעלה רציפה של אלקטרודות בתוך מכשיר DMF 13,28; תחבורה ל, מ, ובתוך תאי זלוף הוא מופעל על ידי שינויים בלחץ שנוצרו על ידי מזרק דיוק גבוה משאבה. כל תנועות של נוזלים אלה נשלטים באמצעות ממשק אלקטרוני פשוט ואוטומטי באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש.

כדוגמה מייצגת, אנחנו מדגימים את השימוש בפלטפורמה למחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים (איור 2). ביצוע ניסויים אלה על הפלטפורמה אפשר לנו לעבוד עם מספר קטן של תאים (~ 1,000 לניסיונימצב טל), למזער את שונות ניסוי לניסוי, ריאגנטים לשמר, ומחדש ישירים הידיים על העבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, וכן הנגישות והצדדי שלה, פלטפורמה זו צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים ולהוכיח שימושי במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים הזמינים רק בכמויות מוגבלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול כללי זו נועד לתמוך ביישום של הפלטפורמה למגוון רחב של מחקרים; היבטים ספציפיים למחקר הנציג תואר בדו"ח זה מופרדים בסוגר איור 2 ממחיש מחקר נציג מתבצע באמצעות הפרוטוקול.. יצוין, כי בפרוטוקול, כל פקודות "להורות" הן אוטומטיות באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש. שימו לב גם שניתן לבצע את שלב 2 במקביל עם שלב 1 (לדוגמה, במהלך שלבי 1.7 ו -1.8), ובשלב זה הוא לעתים קרובות עקף 2.1 (כי ניתן לכבס צלחות מכשיר DMF דוגמת / מצופים ושימוש חוזר; ראה שלב 5.2) .

1. להרכיב ולאכלס את צ'יימברס הזילוף הסלולרי

  1. מעיל המשטחים הפנימיים של עיקור microcapillaries (autoclaved) (סיליקה התמזגו-; 679 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 534; אורך 15 ס"מ) עם פיברונקטין, על ידי מורה משאבת המזרק לצייר פתרון פיברונקטין סטרילי (30 μl של 50 מיקרוגרם / מ"ל) לכל אחדmicrocapillary, דוגרים (37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2), מורה למשאבת המזרק למשוך את הפתרון, ולתת יבשים microcapillaries (טמפרטורת חדר (RT) עבור 6 שעות).
  2. חבר אחד (חדר זלוף) microcapillary פיברונקטין מצופה לצינורות פוליקרבונט (500 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 100) וצינורות למשאבת מזרק יציאות מרובות, תוך שימוש באבזרי CapTite (6 תאי זלוף, 8 יציאות משאבת מזרק).
  3. באמצעות קלטת, לאבטח את גופו של כל תא זלוף לגוש חום המוגדר לטמפרטורה רצויה (37 מעלות צלזיוס).
  4. לטבול את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף במאגר (צינור microcentifuge או microtiter צלחת היטב) (תאים המכילים P388D.1 מקרופאגים העכבריים) המושעים במדיום גידול טרי (RPMI-1640, 10% FBS, 500 יחידות / מיליליטר פניצילין, 500 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל) בריכוז רצוי (10 6 תאים / מ"ל).
  5. להורות למשאבת המזרק לצייר תאים (10 μl, 10 4 תאים) לתוך כל חדר זלוף אחריו מספיק AIR כדי להעביר את התקע הנוזלי (~ 4.5 ס"מ) לסעיף מאובטח לגוש החום.
  6. אפשר התאים לדבוק במשטחי הפנים פיברונקטין מצופים של תאי זלוף (37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 1 שעה). בינתיים, להעביר את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף ממאגר התאים למאגר חדש המכיל מדיום גידול טרי.
  7. לאחר תקופת הדבקות, להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (תקשורת ממוזגות ותאים פנויים) לבזבז, לסגת בינונית טרי (10 μl), ופעל עם מספיק אוויר כדי למקם את האטמים הנוזליים החדשים (בינונית טרי) על דבק תאים.
  8. המשך לבצע חילופי בינונית (כלומר חזור על שלב 1.7) במרווחי זמן קבועים (כל שעה 2) עד שאוכלוסיות התאים הן מספיק equilibrated ומורחבים (16 - 24 שעות של אוכלוסיות שנוצרו תרבות מיקרו בקנה מידה של כ -1,000 תאים / קאמרית).

2. לפברק התקני DMF ולהרכיב אדריכלות Hub

    כפי שתוארתי קודם לכן 14,29, דפוס את צלחת תחתית מכשיר DMF עם ארבעים ושש תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) אלקטרודות (נהגים של אגל actuation) על ידי photolithography ותחריט, ואת מעיל עם 5 מיקרומטר של Parylene-C ו -50 ננומטר של טפלון AF. טופס הצלחת העליונה של מכשיר DMF על ידי ציפוי מצע זכוכית איטו unpatterned עם טפלון AF, כאמור לעיל.
  1. שימוש במסגרות דחיסת מתכת, לתקן את צלחות DMF ליציקת פולימר 14,30 עם גומחות, כי לשמור על מרווח בין 400 מיקרומטר בין הלוחות; מרווח זה, בשילוב עם גודל אלקטרודה actuation (2.5 מ"מ 2), מגדיר את נפח הטיפה (2.5 μl לאלקטרודה). שים לב שיכולה להיות מושלמת DMF הרכבה באמצעים פשוטים יותר 24.
  2. הוספה מצופה טפלון ההעברה microcapillaries (360 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 100; 3.5-4.0 סנטימטר) אל תוך החלל בין לוחות DMF, מיצוב כל אחד להארכה לקצה האלקטרודה actuation מאותו המקור שלה.
  3. לen ההפךד של כל העברה להדביק microcapillary הולם CapTite.
  4. להעסיק את המחברים החשמליים לאספקת מתח לאלקטרודות איטו. רצפי הפעלת האלקטרודה הם אוטומטיים באמצעות שימוש בממשק אלקטרוני מבוקר מחשב פועל תסריטים שנקבעו מראש.
  5. אופציונלי: העבר את רכזת DMF התאסף על הבמה translational של מיקרוסקופ (SZ-6145TR (אולימפוס, יפן)) מצוידת במכשיר תשלום מצמיד (CCD) מצלמה (DCR-HC96 (סוני, יפן)) כדי להקל על המעקב של טיפות 31.

3. חברו את צ'יימברס הזילוף לרכזת DMF ולעורר את אוכלוסיות התאים

  1. הסר את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף מהמאגר הבינוני (ראה שלב 1.6) ולהכניס אותם לתוך אבזרי CapTite מודבקים לקצות microcapillaries העברת רכזת DMF (ראה שלב 2.4).
  2. להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (תקשורת ממוזגות) בתאי זלוף לבזבז.
  3. Instruct רכזת DMF לצייר גירוי (E. coli BioParticles ב 100 מיקרוגרם / מ"ל במדיום טרי עם 0.1% Pluronic F127 w / V) ממאגר על לוח ולספק טיפה בגודל המתאים (10 μl) לכל העברה microcapillary . המאגרים על הלוח מורכבים מתאים בצורת גלילית (1.5 x 1.5 ס"מ כל אחת) ומחוברים לרכזת DMF דרך צינורות.
  4. להורות למשאבת המזרק כדי לצייר את הגירוי מתחבר לmicrocapillaries ההעברה, ופעל עם מספיק אוויר כדי למקם את האטמים על אוכלוסיות תאים בתאי זלוף.
  5. דגירה התאים עם גירוי (37 מעלות צלזיוס למשך 4 - 1 שעה). אופציונלי: Exchange לגירוי טרי (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4) במרווחי זמן קבועים.

4. לסיים את גירוי ולשחזר lysates תא לניתוח

  1. אופציונלי: אם נדרש תקופה שלאחר גירוי, להחליף את אטמי הנוזל המכיל-גירוי למדיום חדש (חזור על שלבים כלומר 3.2-30.4, החלפת מדיום חדש לגירוי), ותמשיך לדגור ולהחליף במידת הצורך.
  2. להחליף את התקעים הנזילים בתאי זלוף לחיץ לשטוף (הצפת מודול תמוגה ישירה פרלוד ב) (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4, החלפת חיץ לשטוף לגירוי), ודגירה לפי צורך (5 דקות).
  3. להחליף את התקעים הנוזליים (לשטוף חיץ) לפתרון תמוגה (חיץ מודול תמוגה ישירה פרלוד עם 0.1% Pluronic F127 w / V) (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4, החלפת פתרון תמוגה לגירוי), ודגירה לפי הצורך (5 דקות) .
  4. להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (lysates תא) לרכזת DMF.
  5. לפרק את רכזת DMF, להסיר את הצלחת העליונה של מכשיר DMF (באמצעות טיפול לא כדי להטות את הצלחת הצידה, כמו זה יכול לגרום לטיפת ערבוב), ולאסוף את lysates באמצעות Pipetman או מזרק לניתוח פלטפורמה (את פרופיל ביטוי גנטי דרך qPCR).

5. פלטפורמת חומרה נקיות עבורלהשתמש שוב

  1. לטבול microcapillaries ההעברה ואבזרי CapTite באקונומיקת 10% (V / V במים) במשך 10 דקות ב RT, לשטוף היטב עם מים deionized, ויבש באמצעות גז חנקן.
  2. לטבול את צלחות מכשיר DMF באקונומיקת 10% במשך 10 דקות ב RT, יש לשטוף היטב עם isopropanol ואחריו המים deionized, ושימוש בגז חנקן יבש ואחרי האפייה ב 160 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. צינור פוליקרבונט של משאבת המזרק, וצוות שחקני הפולימר של מכשיר DMF ומסגרת דחיסה, יכולים להיות שימוש חוזרים בלי ניקוי. זלוף קאמרי microcapillaries מבוטלים לאחר כל ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כהדגמה של הפלטפורמה האוטומטית, השתמשנו בו כדי לבצע את המחקר שבו אוכלוסיות קטנות של תאים חיסוניים גדלו בתרבויות בקנה מידת מיקרו, תיגר עם חיידקים, וlysed לניתוח את הפלטפורמה של תגובות פרו דלקתיות (איור 2 ).

כל אחד משישה תאי זלוף סלולריים נזרע עם 10 4 תאי מערכת חיסון (מקרופאגים P388D.1 עכבריים) resuspended ב10 μl של מדיום גידול. לאחר תקופה דבקות (37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2) ומטבע בינוני, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פלטפורמה אוטומטית פשוטה ותכליתית לתרבית תאים בקנה מידה מייקר ניסויים וגירוי. הפלטפורמה מאפשרת לנו לעבוד עם כמויות קטנות תרבות ואוכלוסיות תאים (1 - 20 μl ו100 - 2,000 תאים, לכל תא); גדלי התרבות יכולים להיות מופחתים עוד יותר באמצעות שימוש בmicrocapillaries של קוטר קטן יותר. עובדים בקני מידה אלה מפחית את עלות לימודים שגרתי ועושה מחקרים אפשריים הדורשים שימוש בחומרים כימי ו / או תאים יקרים. ניסויים שבוצעו בפלטפורמה גם להראות פחות השתנות, ככל הנראה בשל הדיוק והשחזור שבו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים רונלד פ רנזי ומייקל ס Bartsch על תרומתם לעיצוב והפיתוח של מכשירי DMF ורכזת DMF. מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי מעבדת מחקר בימוי ותכנית פיתוח במעבדות הלאומית Sandia. Sandia היא מעבדה תכנית רבת מנוהלת ומופעלת על ידי חברת Sandia, חברה בת בבעלות מלאה של החברה לוקהיד מרטין, למחלקה הלאומי לביטחון הגרעיני של מנהל האנרגיה האמריקנית תחת חוזה DE-AC04-94AL85000.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מודול ליזה ישיר PreludeNuGEN1400-24
טריפן כחול (0.4% w/v)GIBCO15250-061
חשפנית תאיםCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR מבחןיישומי ביוסיסטמסMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR מבחןיישומי ביוסיסטמסMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR מבחןיישומי ביוסיסטמסMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR מבחןיישומי ביוסיסטמסMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR מבחןיישומי ביוסיסטמסMm99999915_g1
פלורוניק F127סיגמא כימי2594628
פלואורינרט FC-40סיגמא כימיקל51142-49-5
פארילן C דימרמערכות ציפוי מיוחדות28804-46-8
טפלון-AFDuPontAF1600
סרט פולימידULINES-11928
מצעי זכוכית מצופים תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) Delta TechnologiesCB-40IN-1107
רכזת DMF מיקרו-נימי סיליקה התמזגו מצופים טפלוןPolymicro TechnologiesTSU100375
מיקרו-נימי תא זלוףPolymicro TechnologiesTSP530700
צינורות ואביזרי מיקרו-נימימעבדות לאומיות סנדיה
צינורות פוליקרבונטParadigm OpticsCTPC100-500-5
משאבת מזרק מדויקת עם 8 יציאות המצוידת ב-30 מ"מ (500 & #956; קיבולת l) מזרקיםחברת המילטון54848-01
מכשיר תצהיר אדים Parylene-Cמערכות ציפוימיוחדות PDS 2010 Labcoter 2
מחולל פונקציות מתח גבוהטרק615A-1 615-3
מיקרוסקופ MVX10אולימפוסאופציונלי (מקל על מעקב אחר טיפות ברכזת DMF)
מצלמת CCD דיגיטלית QIClickQImagingQIClick-F-CLR-12אופציונלי (מקל על מעקב אחר טיפות ברכזת DMF)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  2. Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
  3. Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
  4. Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
  5. Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
  6. Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
  7. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  8. Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
  9. Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
  10. King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
  11. Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
  12. Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
  13. Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
  14. Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
  15. Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
  16. Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
  17. Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
  18. Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
  19. Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
  20. Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
  21. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
  22. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
  23. Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
  24. Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
  25. Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2(2009).
  26. Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
  27. Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
  28. Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603(2009).
  29. Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
  30. Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
  31. Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
  32. Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
  33. Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
  34. Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
  35. Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
  37. Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
  38. Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
  39. Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
  40. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Micro scale Cell CultureDigital MicrofluidicsCell Perfusion ChambersSyringe Pump ControlAutomated Cell StimulationQuantitative RT PCR AnalysisFibronectin CoatingMicrocapillary TransportCell Lysate RecoveryImmune Cell Stimulation

מאמרים קשורים