מאמר שיטה

שיטה לCulturing עוברי ג elegans תאים

DOI:

10.3791/50649

⸱

21 בספטמבר 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סי אלגנס הוא מערכת מודל רבת עוצמה, שבו טכניקות גנטיות ומולקולריים הן ישימות בקלות. עד לאחרונה אם כי, טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים ובידוד של תאים מסוגים מסוימים, לא יכולים להיות מיושמות בג elegans. מגבלה זו הייתה בשל העובדה שרקמות מוגבלות בתוך ציפורן בלחץ שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול עם אנזימים ו / או חומרי ניקוי. בהתבסס על עבודה חלוצה מוקדם על ידי לרד בלום, כריסטנסן ועמיתים 1 פיתח שיטה חזקה לculturing ג elegans תאים עובריים בקנה מידה גדולה. ביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת על ידי טיפול עם אקונומיקה / NaOH ולאחר מכן טופלו בchitinase כדי להסיר את קליפות הביצים. לאחר מכן תאים עובריים הם ניתקו על ידי pipetting הידני ומצופים על זכוכית מכוסה מצע בתקשורת מועשר בסרום. בתוך 24 שעות של תאי בידוד מתחיל להבחין על ידי שינוי מורפולוגיה ועל ידי הבעת marke תאים הספציפיrs. ג elegans תאים בתרבית בשיטה זו לשרוד עד 2 שבועות במבחנה והיה בשימוש במשך אלקטרו, immunochemical, והדמיה מנתח, כמו גם שהם כבר מסודרים ומשמשים לאפיון microarray.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

elegans Caenorhabditis (סי אלגנס) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקירת הבסיסים המולקולריים של תפקוד תאי, התמיינות, והתנהגות. בעוד הגנום, חילוף החומרים ומסלולי biosynthetic דומים לבעלי חוליות ", העקיבות הגנטיות והמולקולרית שלו הן הרבה יותר גדולות 2. בין יתרונותיה לגודלה ואנטומיה פשוטה, המחזור המהיר שלה חיים (3 ימים ב25 מעלות צלזיוס), תוחלת חיים קצרה (2 שבועות) ומספר רב של צאצאים (> 200) הם. בשל אופי hermaphroditic ומחזור חיים קצר, מניפולציות מולקולריות וגנטיות הן פשוט בג elegans, הכולל את הדור של בעלי חיים מהונדסים 3,4 והיישום של טכניקות עקומות למטה גן כגון התערבות RNA 5. ג גוף elegans וקליפת ביצה הם שקופים. לכן ניתן דמיינו תאים בקלות בשני המבוגרים והעובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל. ב40 השנים האחרונות, ג elegans הקהילה יצרה משאבים רב ערך עבור ג מחקר elegans כולל אוסף גדול של מוטציות, knockouts וtransgenics, תיאור מפורט של האנטומיה ופיתוח 6,7, כולל השחזור המלא של מערכת העצבים 8, ולחלוטין הגנום רצף אשר מבואר וזמין לכל הקהילה גם ( www.wormbase.com).

למרות יתרונות הרבים, חלקם גישות ניסיוניות כבר מאתגרות בג elegans. אלה כוללים את אלה שדורשים נגישות לקרום הפלזמה של התאים והבידוד של רקמות או סוגי תאים. ואכן C. רקמות elegans מוגבלות בתוך השלד שלה בלחץ ההידרוסטטי, שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול או בדטרגנטים האנזימטית. בסופו של 1990 מרים גודמן וג'נט ריצ'מונד חלוץ שיטות עבור קלטות אלקטרו של ג elegansנוירונים ותאי שריר באתר 9,10. בעוד שיטות אלו נתנו לנו תובנות חשובות עצבי ותפקוד שרירים in vivo, הם מאתגרים ותפוקה נמוכה. שיטות אלטרנטיביים ללמוד את תפקוד תא in vivo שפותחו, בעיקר בעיקר בסידן ההדמיה vivo באמצעות חיישני סידן מקודד גנטי כגון GCamP וCameleon 11-13. שיטות אלה אף, אינן מאפשרים שימוש בכלים תרופתיים משום שהם חלים על בעלי חי חיים בשלמותה.

הניסיון הראשון בג culturing תאי elegans במבחנה בקנה מידה גדולה נעשו על ידי לרד בלום במהלך תקופת ההכנה של עבודת הדוקטורט שלו 14. למרבה הצער, קשיים עם הידבקות לקויה של התאים למצע, התמיינות תאים עני והישרדות מנעו את הקמתו של הפרוטוקול בתחילת כשיטת תרבית תאים חזקה. בשנת 1995 אדגר ועמיתיו פרסמו נוהלכדי לחקור את חלוקת תא והמורפוגנזה ידי בידוד והתרבות של C אחד. elegans עוברי 15. תאים עובריים שהושגו על ידי עיכול של קליפות הביצים עם שילוב של טיפול אנזימטי וניתוק ידני, המשיכו להתרבות, לייצר עד ~ 500 תאים 15. בהמשך לכך, ליונג ועמיתים לעבודה בתרבית מספר קטן של לסטומרים ללמוד המורפוגנזה מעיים. הם הראו כי במבחנה blastomere E המבודדת אחד המיוצר בתאי מעיים מקוטבים שיצרו מבנה מקביל ללומן מעיים על ידי אינטראקציה אחד עם השני דרך צמתים adherens פסגת 16. Buechner ועמיתיו גם דיווחו בשיטה דומה לC culturing. elegans תאים עובריים במבחנה 17.

בהתבסס על עבודה מוקדמת זו, כריסטנסן ועמיתיו פיתחו פרוטוקול חזק עבור culturing C העוברי. elegans תאים במבחנה 1. הםהראה כי C המבודד. elegans תאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ולשמור על התכונות שיש להם in vivo, כולל הביטוי של סמנים ספציפיים בתא. כמה טכניקות שמאתגרות in vivo, יכולות להיות מיושמות על ג המבודד elegans תאים עובריים. אלה כוללים 1,18 19 אלקטרו, הדמיה וטכניקות immunochemical 20,21, כמו גם בידוד של סוגי תאים ספציפיים על ידי Cell-Activated פלורסנט מיון (FACS) לבניית ספריות cDNA תא ספציפי 22,23. ניתן ליישם טכניקות ג'ין מציאה כגון התערבות RNA (RNAi) בג בתרבית elegans תאי 1 ושיטת תיוג מטבולי רומן באמצעות Azido סוכר ככלי לגילוי גליקופרוטאין פותחו לאחרונה במבחנת ג בתרבית תאי elegans 24.

לסיכום, שיטת תרבית תאים מרחיבה את מערך oטכניקות ו שיכול להיות מיושמות על ג דגם elegans במאמץ לפענח את תפקוד גן בהקשר של האורגניזם חי. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול לculturing ג elegans תאים עובריים במבחנה, המבוססת במידה רבה על הפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי כריסטיאנסן ו1 עמיתים לעבודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כוכביות (*) מצביעות על צעדים חדשים או שונה בהשוואה לכריסטנסן et al. 1

1. התקנת חומר

  1. הליך תרבית תאים דורש כמויות גדולות של ביצים מבודדות ממבוגרים הרה. לגדול ג elegans על 8P צלחות אגר זרע עם NA22 (זמין באמצעות ג elegans הגנטי Consortium - CGC) חיידקים לבודד כמויות גדולות של ביצים. בלוחות אלה הסכום של peptone משמש הוא 8 פעמים את הסכום שמשמש בדרך כלל לצלחות NGM. ריכוז peptone גבוה יותר מקיים את הצמיחה של חיידקים NA22 יעילות רב יותר, אשר בניגוד לOP50, לגדול בשכבות עבות.

8P צלחות מתכון:

להמס 3 גרם NaCl, 20 גרם bacto-peptone, 25 אגר גרם ב1 ליטר של מים סטריליים מזוקקים וחיטוי ל30 דקות. בואו מגניב הבינוני על 55 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף מיליליטר סטרילי מסונן-1 של כולסטרול (5 מ"ג / מיליליטר בEtOH), 1 מיליליטר של 1 MgCl 2, 1 מיליליטר של 4 MgSO ו25 מיליליטר של חיץ KP (המניה של 500 מיליליטר: 5 גרם K 2 HPO 4, 30 גרמו KH 2 PO 4, pH 6.00). יוצקים בינוני אגר נוזל לתוך 10 סנטימטר צלחות פטרי (25 מיליליטר / צלחת).

  1. למחרת להפיץ את פני השטח של כל צלחת אגר peptone מועשר השלם עם 1 מיליליטר של NA22 E. לילה בתרבית חיידק בתקשורת 2XYT (16 גרם Tryptone, תמצית שמרי 10 גרם, 5 גרם NaCl ב1 ליטר של מים סטריליים, pH 7.0) ב 37 ° C. חיידקים אלה מהווים מקור מזון בשפע שיהווה שכבה עבה התומכת בצמיחה של כמויות גדולות של מבוגרים הרה. השאר צלחות seeded לילה בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר צמיחה של החיידקים. התהליך יכול להיות מואץ על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-5 שעות.
  2. העבר את החיות מורעבות ל8P צלחות שנזרעו. שטוף חיות מצלחת NGM מורעבת באמצעות 5-6 מיליליטר של חיץ או מים M9 ולהוסיף 1-2 מיליליטר של השעיה זו לכל צלחת 8P.
  3. לאפשר צמיחה והכפלה של בעלי החיים האנטil הצלחות מאוכלסות במפגש על ידי מבוגרים הרה.
  4. לבודד את הביצים הנדרשות להכנת ג elegans תאים עובריים, ממבוגרים הרה להולדת באמצעות 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה.

מתכון פתרון תמוגה

5 מיליליטר של אקונומיקה טריות, 1.25 מיליליטר של 10 N NaOH ו18.5 מיליליטר של סטרילי H 2 O. תערובת זו חייבת להיות מוכנה טרי לפני כל שימוש.

  1. לשטוף את הביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת באמצעות חיץ ביצה:

מתכון חיץ ביצה

118 mM NaCl, 48 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2, 25 HEPES מ"מ, 7.3 pH, mOsm 340 אוסמולריות.

  1. הסר את קליפת הביצה שמקיפה את הביצים על ידי טיפול עם chitinase. Chitinase הוא אנזים עם הפעילות הגבוהה ביותר ב-pH חומצי 25. ממיסים chitinase (Sigma, לקטלג לא. C6137) בpH חיץ הביצה 6.5 בריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר. אחסן את מניית chitinaseפתרון ב -20 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר aliquots בצינורות חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. ניתן לאחסן aliquots ב -20 ° C עד כמה חודשים.
  2. לגדול ג תאים בתרבית elegans על coverslips autoclaved (בקוטר מ"מ 12) מכוסה בקטיני בוטנים. ממיסים קטיני בוטנים במים סטריליים (0.5 מ"ג / מיליליטר). פתרון לקטיני בוטנים לא צריכים להיות מסונן או autoclaved. זה גם לא צריך להיות מטופלים עם אור האולטרה סגול. חנות 2 aliquots מיליליטר ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  3. בינוני מלא תרבית תאים (500 מיליליטר) מכיל L-15 מדיום תרבות 500 מיליליטר מGibco, 50 מיליליטר בסרום שור עוברי (חום מומת), 7.7 סוכרוז גרם (mOsm 45), 5 מיליליטר של 100 U / ml פניצילין ושל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (2%). הבינוני המלאה לאחר מכן מסונן באמצעות מסנן נקבובית 0.20 מיקרומטר.

שים לב שיש לי חיץ הביצה ובינוני תרבות osmolarity של 340 ו345 mOsm בהתאמה. ואכן, בניגוד לתאי יונקים, ג יש תאי elegans osmolarity גבוה יחסיתשצריך להילקח בספירה בעת הכנת פתרונות שיבואו במגע ישיר עם קרום הפלזמה של התאים. המתכונים של חומרים כימיים אלה הותאמו להגיע osmolarity הרצוי, אשר נמדד באמצעות osmometer 1. אין זה הכרחי להשתמש osmometer אם המתכונים האלה אחריו בדיוק וטיפול משמש בהכנת חומרים כימיים אלה. עם זאת, יש להשתמש osmoter אם פתרונות אחרים צריכים להיות מוכנים, שמתכונים אינם מדווחים כאן או בכל אחד מהפרסומים המשתמשים בג elegans תאים בתרבית.

2. בידוד ביצה

  1. מומלץ להתחיל עם לפחות ארבעה 8P צלחות כדי לאסוף מספיק ביצים ל12 בארות של תאים בתרבית (ב24 גם צלחות).
  2. לפני שמתחיל עם ההליך להפשיר צינור אחד של פתרון מניות לקטינים בוטנים. הנח coverslips autoclaved בתחתית הבארות בצלחת 24 היטב ולהוסיף 200 μl של קטיני בוטנים לcoverslips. דגירה עבור שעה 1 או until התאים מוכנים להיות מצופה. להסיר לחלוטין את קטיני בוטנים ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מיליליטר של מים autoclaved סטרילי. הסרה מלאה של קטיני הבוטנים מcoverslips היא חיונית למניעת clumping תא.
  3. שטוף את המבוגרים הרה להולדת את הצלחות אגר באמצעות מים autoclaved סטרילי. אסוף את ההשעיה לשני צינור 50 מיליליטר חרוטי סטרילי. השאר את הצינורות על קרח לתקופה של עד 5 דקות, כדי לאפשר למשקעים של התולעים בחלק התחתון של הצינורות (*). הסר את המים עם טפטפת פלסטיק העברה ולהחליף אותו עם מים סטריליים autoclaved טריים. גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה בטבלה העליונה ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות (*). חזור על השלב אחרון זה לפחות 3.
  4. העבר את התולעים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי וגלולתם ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות (*). אל תשתמש במהירות גבוהה יותר צנטריפוגה כדי למנוע איסוף החיידקים בחלק התחתון של הצינור גם כן. לפעמים אחרי centrifugations התולעים אינם pelleted לחלוטין. After כל לשטוף ולפני הסרת supernatant, למקם את הצינורות במשך 5 דקות על קרח. במצונן תולעי מים לזרז לחלק התחתון של הצינור.
  5. הסר את המים ומוסיף 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה (ראה חומר להגדיר). רוק ההשעיה בעדינות במשך דקות 5-10 ולאחר מכן להתחיל ניטור תמוגה תולעת תחת סטראו כל דקות 2-3. ירידה של השעיה ניתן גם להציב על coverslip לבדיקה קלה יותר. זמן הדגירה משתנה בהתאם לטריות של אקונומיקה; לקנות בקבוקים קטנים של אקונומיקה ולפתוח בקבוק חדש בכל חודש.
  6. כאשר ~ 70-80% מתולעים lysed (10 דקות מתחילת הדגירה), לעצור את תגובת תמוגה ידי הוספת 9 מיליליטר של pH חיץ הביצה 7.3 (ראה חומר להגדיר). צנטריפוגה ההשעיה ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות. מכאן ואילך יש לי מבער בונזן ב, על הספסל כדי למנוע זיהום מחדש של הביצים (*) זו.
  7. מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק סטרילית ולשטוף את הכדור 3-4x עם חיץ ביצה עד הפתרון הוא ברור. הקפד לערבב היטב גלולה במאגר הביציות בכל שטיפה.
  8. ביצים מופרדות מפגרי בעלי החיים באמצעות 30% תמיסת סוכרוז. Resuspend את הכדור ב 2 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה ולהוסיף 2 מיליליטר של 60% תמיסת סוכרוז (המניה בחיץ סטרילי ביצה). מערבבים היטב וצנטריפוגות במשך 20 דקות ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) (*).
  9. מוציאים בזהירות את הצינורות מצנטריפוגות. הביצים צפות בחלק העליון של הפתרון. שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להעביר את כל הביצים לתוך צינור חרוטי מיליליטר 15 סטרילי טרי.
  10. הוסף 10 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה לצינור צנטריפוגות ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד) עבור 10 דקות. חזור על לשטוף 3 x. ודא הביצים resuspended לחלוטין בחיץ הביצה במהלך כל שטיפה.

3. דיסוציאציה תאים עוברי

לנהל את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות זרימה למינרית. בעוד בעלי חייםשמלה על צלחות חיידקים, שטיפה והטיפול בפתרון תמוגה המכיל אקונומיקה צריכה לחסל את רוב אם לא כל החיידקים. וכך באמצעות ברדס למינרית בשלב זה של ההליך זה מונע זיהום חדש של ההשעיה הביצה.

  1. Resuspend ביצי pelleted ב 1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר chitinase (המניה בpH ביצת חיץ 6.5 (*)) ולהעביר אותם לצינור סטרילי חדש 15 מיליליטר חרוטי. רוק הצינור ל10-30 דקות בטמפרטורת חדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לטריות של האנזים, ואת הטמפרטורה של החדר ולכן צריך להיות שנקבע לכל הכנה. מומלץ להתחיל מעקב הביצים תחת המיקרוסקופ תרבית תאים הפוך לאחר 10 דקות של דגירה. הערה: בניסיון שלנו, ה-pH הנמוך מגבירה את הפעילות האנזימטית chitinase. מסיבה זו אנו משתמשים חיץ ביצה בpH 6.5 לפזר chitinase (מתכון שדווח לעיל, שבו רמת חומציות מותאמת ל6.5 באמצעות NaOH).
  2. כאשר ~ 80% מקליפות הביצים מתעכלים על ידיטיפול chitinase (איורים 1 AB), גלולה הביצים על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל"ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להסיר בזהירות את supernatant ולהוסיף 3 מיליליטר של L-15 בינוניים (*).
  3. מעביר את הביצים לתוך צלחת בקוטר 6 סנטימטר ובעדינות לנתק את התאים באמצעות מזרק סטרילי 10 מיליליטר מצויד במחט G 18. לפקח על מידת הניתוק על ידי הצבת ירידה של השעיה לתוך צלחת פטרי פלסטיק טרי ועל ידי הצגה מתחת למיקרוסקופ. לא לשאוב אוויר לתוך המזרק במהלך הליך זה, כדי למנוע תאים מזיקים. המשך הניתוק עד ~ 80% מהתאים הם ניתקו.
  4. סנן את ההשעיה באמצעות 5 מסנן Millipore מיקרומטר סטרילי. השעיות תא חייבת להיות מסוננות כדי להסיר גושי תא, ביצים לא מעוכלות וזחלים בקעו. סנן 4-5 מיליליטר נוסף של L-15 תקשורת טריות דרך המסנן כדי לשחזר את כל התאים. אל תשתמשו בכוח מופרז במהלך שלב הסינון כדי למנוע damaging המסנן ו / או התאים.

4. Culturing תאים

  1. גלולה התאים ניתקו על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל"ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטרילי להסיר בזהירות את כל supernatant. Resuspend תאי pelleted במדיום L-15 מלא וצלחת 1 מיליליטר / היטב. כמות בינונית הוסיף תלויה במספר 8P צלחות בשימוש, נקודת המפגש של התולעים על הצלחות, והסוג של ניסויים שיבוצעו בתאים. צפיפות התאים ניתן לקבוע באמצעות hemocytometer. עבור הקלטות תיקון מהדק ציפוי צפיפות של ~ 230,000 תאים / 2 סנטימטר הוא אופטימלי.
  2. שמור את צלחת 24 בארות במכל פלסטיק פלסטיק המכיל מגבות נייר רטובות, כדי למנוע אידוי של מדיום לתרבות. אחסן את המכל בחממה humidified על 20 מעלות צלזיוס, אוויר הסביבה.
  3. התאים הם בדרך כלל מוכנים לניסויים בתוך 24 שעות כאשר הבידול ומפורש מורפולוגייםיון של סמני ה-GFP הושלם. יכולים להישמר תאים בתרבית עד 2 שבועות, אבל הם בדרך כלל בריאים ביותר עד 7-9 ימים לאחר ציפוי. הבינוני צריך להיות מוחלף פעם ביום כדי לשמור על תאים בריאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans תאים בתרבית להבדיל ותא מפורש סמנים ספציפיים

כריסטנסן ועמיתים באמצעות מכתים trypan הכחול הוכיחו כי> 99% ג העוברי תאי elegans לשרוד את הליך הבידוד. ביום 9 ו22 לאחר ציפוי, 85% ו65% בהתאמה עדיין בחיים 1. ג העוברי המבודד תאי elegans חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל. תאים שאינם מצליחים לדבוק גושי צורה ולא ברור אם הם ישרדו. התמיינות של התאים מתחילה 2-3 שעות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לפענוח המסלולים הגנטיים מעורבים בפיתוח, התנהגות והזדקנות. הנוחות שלה נובעת בעיקר מההקלות שבה ניתן להשפיע מבחינה גנטית וממחזור החיים הקצר שלה. למרות הנוחות שלה, ג יש elegans מגבלותיו. ג תאי elegans הם זעירים ומוגבל בתוך ציפורן בלחץ המגבילה את היישום של שיטות הדורשות גישה ישירה לתאים, כגון טכניקות אלקטרו ותרופתיות, או בידוד של סוגי תאים ספציפיים, כגון פרופיל ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray. ג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco אגר מגורעןVWR בינלאומי בע"מ90000-784
בקטו טריפטוןVWR אינטרנשיונל בע"מ90000-284
תמצית שמרים בקטוVWR אינטרנשיונל בע"מ90000-724
L-15 נוזלי L-15 בינוני (1x) של לייבוביץ11415-064
סרום בקר עובריInvitrogen16140-063
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמאP4333-100ML
כיטינאז מ-Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis המרכז
לקטין בוטניםסיגמאL0881-10MG
סוכרוזסיגמא57903-1KG
D-(+) גלוקוזסיגמא67528-1KG
אתילן גליקול-ביס (2-אמין– thylether), N,N',N'- חומצה טטרחוצית (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
כולסטרול
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl<תת>2סיגמאM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 גרם
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
אתנול
מזוקק אוטוקלאב H2O
Bleach
<חזק>ציוד
101-1000 μ l טיפים לפיפט כחול בוגרארה"ב Scentific1111-2821
10 מ"ל פיפט מעוקר עטוף בנפרדארה"ב Scentific1071-0810
נפח משתנה ארגונומי (100-1000 μ l) פיפטור עם מפלט קצהVWR International Inc.89079-974
עזר פיפט נייד, דראמונדVWR אינטרנשיונל בע"מ.53498-103
העברת פיפט פלסטיק סטריליVWR International Inc.14670-114
15 מ"ל שפופרת חרוטית ארה"ב Scentific1475-1611
50 מ"ל שפופרת חרוטיתארה"ב Scentific1500-1811
סטרילית 18 מד מחטיםבקטון, דיקינסון ושות'.
מזרקים סטריליים 10 מ"לבקטון, דיקינסון ושות'
מסנני מזרק פלסטיק קורנינג 0,20 μ m גודל נקבוביות Corning431224
Acrodic 25 מ"מ מסנן מזרק w/5 μ m versapor ממברנהVWR אינטרנשיונל בע"מ.28144-095
60x15 מ"מ צלחת פטרי סטריליתVWR International Inc.82050-548
100x15 מ"מ צלחת פטרי סטריליתVWR International Inc.82050-912
כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מVWR International Inc.48300-560
צלחות תרבית תאים שקופות 24 תחתית שטוחה היטב עם מכסה תומס מדעי6902A09
Dumont #5- מלקחיים עדינים כלים מדעיים עדינים11254-20
צנטריפוגה 5702Eppendorf022629883
מכסה מנוע
מיקרוסקופ הפוך עם x10 מטרה
אינקובטור
לגנטיקה305196305482זרימה למינארי לח אוויר סביבתי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135(2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42(2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020(2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegans Embryonic CellsEgg IsolationChitinase TreatmentManual DissociationCell CultureImmunofluorescenceMicroscopyElectrophysiologyCalcium ImagingPatch Clamp

מאמרים קשורים