נוגדן מכתים ב ג Elegans שימוש "Freeze-פיצוח"

סיכום

"פיצוח להקפיא", שיטה לחשיפת הרקמות הפנימיות של ג נמטודות elegans לנוגדנים ללוקליזציה חלבון, בא לידי ביטוי.

תקציר

כדי להכתים ג elegans עם נוגדנים, הציפורן יחסית בלתי חדירה חייבת לעקוף בשיטות כימיות או מכאניות. "להקפיא-פיצוח" הוא אחת שיטות המשמשות למשוך פיזי לציפורן מנמטודות ידי דחיסת נמטודות בין שתי שקופיות חסיד, להקפיא אותם, ומושך את השקופיות לגזרים. הקפאת פיצוח מספק דרך פשוטה ומהירה כדי לקבל גישה לרקמות ללא טיפול כימי והוא יכול לשמש במגוון רחב של fixatives. עם זאת, זה מוביל לאובדן רבים של הדגימות והדחיסה הנדרשות מכאנית מעוות את המדגם. בפועל נדרש על מנת למקסם את ההתאוששות של דגימות עם מורפולוגיה טובה. הקפאת פיצוח יכול להיות מותאם לתנאים ספציפיים קיבוע, התאוששות של דגימות, או כתמים שאינם ספציפיים נמוכים, אך לא לכל הפרמטרים ובעונה אחת. לנוגדנים שדורשים תנאי קיבעון קשים מאוד ולסבול את הטיפולים הכימיים הדרושים כדי permeabilize הציפורן כימי, treatment של נמטודות השלמה בפתרון עשוי להיות מועדף. אם הנוגדן דורש תיקון קל או אם תנאי הקיבעון האופטימליים אינם ידועים, בהקפאה פיצוח מספק דרך שימושית מאוד לassay במהירות נוגדנים ויכול להניב מידע לוקליזציה subcellular והסלולרי ספציפי לאנטיגן של עניין.

מבוא

כדי לקבוע את הלוקליזציה הסלולר וsubcellular של חלבונים, מדענים שכותרתו מסורתי רקמות עם נוגדנים שנבחרו להכיר באופן ספציפי חלבונים מסוימים ^1. בחלק מאורגניזמים מודל כגון ג elegans, מכתים נוגדן הוחלף לעתים קרובות על ידי טכניקות גנטיות מולקולריות, אשר יניבו תוצאות במהירות רבות יותר. אלה כוללים אורגניזמים הפיכה עם מבנים בהיקף של התכה גנים בין האמרגן ואזורי קידוד של הגן של עניין וחלבון פלואורסצנטי ירוק. עם זאת, טכניקות מולקולריות כפופות למספר החפצים, ובם בעיות עם ידיעת האמרגן ושינויים בביטוי של מבנים במספר גבוה עותק (טכניקות הרגילות ב C. elegans) ^2,3 האמיתיים. לכן, צביעה עם נוגדנים נשארת מטרה של מדענים רבים בחקר תפקוד חלבון in vivo.

מכתים את הרקמות עם נוגדנים יכולים להיות קשה, שכןtibodies רק יכול לזהות אנטיגן בקונפורמציה מסוימת ^1. לדוגמא, נוגדנים יכולים לזהות רק אנטיגן מפוגל או בשלמותה הקבוע בדרך מסוימת ואולי לא מזהים את האנטיגן באתרם. הבעיה של מכתים נוגדן בנמטודות מחריפה בשל העובדה שהציפורן של נמטודות יוצרת מחסום בלתי חדיר יחסית, החוסם את הגישה של נוגדנים לרקמות.

ישנן מספר שיטות שונות המשמשות למכתים נוגדן בג elegans (שנסקר בעבודה הקודמת שלנו ^4). כדי להכתים שלמים 'תולעים', שיטות פותחו כדי להקפיא ולהפשיר במקבע קשה יחסית (פורמלדהיד או glutaraldehyde); להקפיא להפשיר מחזורים לעזור לפצח את הציפורן כדי לאפשר חדירה מהירה של המקבע ^5. לאחר קיבוע, הציפורן הייתה permeabilized כדי לאפשר חדירה של הנוגדן; שיטות כללו טיפול עם צמצום סוכנים, collagenase, או שניהם ^5-7. לא אלהreatments השתמר מורפולוגיה, אך לעתים קרובות מופחת או נהרס הכרת נוגדן. שיטות אלטרנטיביים כוללות לנתיחה ⁸ כדי לאפשר חדירת נוגדן.

"להקפיא-פיצוח" הוא אחת דרכים כדי לקבל גישה לחלק הפנימי של התולעת חצי השלמה כדי לאפשר נוגדן מכתים ^9-10. הקפאת פיצוח יכול להתבצע עם מגוון רחב של תנאי קיבעון תוך הימנעות טיפולי collagenase וצמצום. נמטודות ממוקמות בין שתי שקופיות דבקים, קפואות, ולאחר מכן השקופיות מופרדות, ומשאירות את רוב נמטודות בשקופית התחתונה וחלק גדול מציפורן בשקופית העליונה. השקופית התחתונה יכולה להיות ממוקמת במקבעת וכל השקופית עם נמטודות דבקה מועברת בהליך מכתים נוגדן. השיטה עושה שני קשיים עיקריים כיום. ראשית, קשה להחיל את הסכום הנכון של לחץ דרוש כדי לפצל את נמטודות בלי לעוות אותם ברצינות. שנית, רבים של התולעים לא יהיה שלסמן לאו שקופיות, ויאבד במקבע או שטיפות. עם זאת, עם השקופיות ותרגול הנכונים, השיטה תהיה במהירות להניב נמטודות עם מורפולוגיה סבירה שבו ניתן להשתמש במגוון רחב של fixatives ונוגדנים.

השיטה עשויה להיות מגוונת במקצת, בהתאם למטרה של הנסיין. אם הכתמה של נמטודות אחת היא רצויה (למשל כדי לקבוע אם transformant אחת שינה מכתים נוגדן), ואז מחליק עם הידבקות מקסימלי (אבל מכתים רקע גבוה יותר) יכול לשמש, כמו שקופיות שהוכנה במעבדה עם polylysine נוסף (ראה בהמשך). לפורמלדהיד או קיבעון glutaraldehyde, יש להשתמש בשקופיות הידבקות גבוהות יותר (שקופיות polylysine הכנה מעבדה), שכן נמטודות לדבוק יותר גרועה לpolylysine לאחר הקיבעונות האלה. אם נמטודות פראית מהסוג שמתבצעת קבועה עם מתנול ו / או אצטון, ולאחר מכן שקופיות עם הידבקות נמוכה יותר ויש להשתמש בי מכתים רקע נמוך יותר (מסחרי או laboratory הכנה שקופיות). אם מגוון רחב של נוגדנים וfixatives נמצאים בשימוש במעבדה, מבחר השקופיות עשוי להיות מוכן מבעוד מועד ומאוחסן עד צורך.

לאחר הגישה לרקמות נמטודות כבר צברה, נהלי מכתים הנוגדן פעלו בשיטות סטנדרטיות (עם incubations יותר אופייני לרקמות ולא תאים ^1,11).

פרוטוקול

הערה: צעדי פרוטוקול מרובים מוצגים עם אפשרויות להקמה והכנה בהתאם לתנאים הספציפיים של הניסוי. במקרים כאלה, צעדים אלטרנטיביים מוצגים כA, B, C, וכו 'הפרוטוקול בצעדים חלופיים מתואר באיור 1.

1. הכנת שקופיות polylysine מצופה

שלושה סוגים שונים של שקופיות יכולים לשמש, בהתאם לפשרה הרצויה בין קלות הכנה, הדבקה יחסית, והמחייב הלא ספציפית של הנוגדן. פרטים של חלופות הכנת שקופיות הם כדלקמן בצעדים 1A-1C על מנת להגדיל את ההידבקות ומורכבות. שקופיות שהוכנו על ידי שיטות השונות אלה יכולים לשמש יחד עבור ניסוי בודד.

1 א. הכנה לא שקופיות

שקופיות polylysine מצופים זמינות מסחרי לספק הידבקות נמוכה ורקע נמוך.

1 ב. יחסי ציבור שקופיותאופטימלי eparation לקיבעון מתנול אצטון

הידבקות בינונית ורקע נמוך.

1. הכן פתרון polylysine עבור טבילת השקופיות: הוסף 400 מ"ג של משקל מולקולרי גבוה מאוד (150,000 - 300,000 ד ') פולי-L-ליזין ל200 מיליליטר כפול מים מזוקקים. הוסף 2 מיליליטר 10% מניית אזיד הנתרן (ריכוז סופי 0.1%) כחומר משמר. זהירות: יבשה אזיד הנתרן הוא תגובתי וכל הצורות הן רעילות. ללבוש מסכה וכפפות ואילו אבקה במשקל כדי להפוך את מניית 10% במים מזוקקים פעמיים.
2. נגב שקופיות זכוכית חלבית סוף אחת עם מגבונים ללא סיבים, כתמי הסרת וחלקיקים. זה צריך להיעשות גם בשקופיות שנרכשו עם הייעוד "precleaned".
3. מקום מחליק גב אל גב בהחזיק שקופיות, צנצנת coplin או מיכל מכתים שקופיות אחרים, שמירה על קצוות חלבית ולא מיושר באופן מושלם למדי (לעשות הפרדה מאוחר יותר קלה יותר). הנח בעל פרוסה בכוס עם 70% אתנול (אלכוהול כיתה מגיב אין צורך) עם 1% HCl בdiנדם מים או למלא צנצנת מכתים לרמה של זיגוג. רוק שקופיות בפתרון למינימום של 5 דקות. זהירות: פתרון זה הוא מאכל, ללבוש כפפות. הערה: פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים (עד מספר חודשים).
4. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מזוקקים דקות 1.
5. מגלשות יבשים לחלוטין בסביבה נטולה אבק או על ידי הצבת בתנור C ° 40-60 ל30-60 דקות או על ידי שמירת הלילה בטמפרטורת חדר.
6. דגירה שקופיות בפתרון polylysine (כיסוי חלקי unfrosted) על נדנדה במשך 15 דקות.
7. חזור על ייבוש של שקופיות.
8. חזור על דגירה פתרון polylysine וצעדי ייבוש.
9. הפרד את השקופיות באמצעות חפץ מתכתי דק כגון מרית במשקל רזה. אם הם דבקו כראוי, הם קשים להפריד. ללבוש ציוד מתאים בטיחות (משקפי מגן) ולעבוד על נייר ספסל עליון (להיות מושלך לאחר שימוש), שכן חתיכות קטנות של זכוכית עשויות לטוס רופפות כאשר שקופיות מופרדות.
10. שקופיות חנות בנקיה(ללא אבק) תיבת שקופיות על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.

1 ג. הסט אופטימלי הכנה לקיבעון פורמלדהיד

ההידבקות הגבוהה ביותר, אך רקע גבוה.

1. מגלשות מקום מוכנים עם שטוח 1B שיטה ב, מנה נטולת אבק תנור בטוח (לייבוש בתנור) או על משטח נקי מאבק שטוח (לייבוש באוויר).
2. מניחים ירידת 20-60 μl של פתרון polylysine באמצע של כל שקופית.
3. מגלשות יבשים לחלוטין בתנור או בטמפרטורת חדר. Polylysine ישאיר מאחורי אליפסות בהירות כפי שהוא מתאדה. אליפסות אלה הן מאוד דביקות. למרבה הצער, הם גם להיקשר לנוגדנים הראשוניים ומשניים, גם לאחר החסימה.
4. שקופיות חנות בתיבת שקופית נקייה (ללא אבק) על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.

2. הכנת קפואה נמטודות השקופיות

הכן נמטודות עבור מכתים ידי שטיפה חופשית לחלוטין של חיידקים באמצעות 2A שיטה (לצלחות של נמטודות) או2B (לנמטודות בודדת).

2A. הכנת שקופיות מצלחות של נמטודות

1. מניחים פיסת המתכת שטוחה על קרח יבש לprechill.
2. השתמש במים מזוקקים וטפטף זכוכית (יורד אובדן של תולעים) או micropipette לשטוף תולעים מצלחת NGM עם חיידקים לתוך צינור microfuge 1.5 מיליליטר. ניתן לסנכרן לוחות או מעורב גילים, לא משתמשים בצלחות עם dauers רבים (קשה לפיצוח) או תולעים רעבים (autofluorescence המוגבר) אלא אם יש צורך.
3. יש לשטוף את התולעים 3-4x עם מים מזוקקים עד ללא חיידקים. (כדי להקטין את האובדן של תולעים להשתמש באותו פיפטה מזכוכית.) לגלולת תולעים, גם לתת להם לשבת על הספסל במשך 3-5 דקות (כדי לאסוף בעיקר מבוגרים בחלק תחתון של צינור) או ספין 30 שניות ב ~ 1,000 סל"ד (~ 500 ז) בצנטריפוגה שולחן (כדי לאסוף מבוגרים, זחל, ועוברים).
4. להסיר את רוב המים מצינור עם תולעים, ומשאיר בערך פעמיים את נפח מים כתולעים (אך נפח כולל לפחות 25 μl).
5. צד חלבית תווית של "תחתון" (שטופל בשלב 1) שקופיות polylysine עם מגלשות דיו ומקום בל תימחה על דלפק ליד מיכל עם קרח יבש, בצד תווית פונה מעלה.
6. יש מספר שווה של שקופיות רגילות (ניגבו נקיות אך לא טופלו polylysine) "עליונה" זמינות.
7. מקום ~ 25 תולעי μl במים בשקופית חסיד "מלמטה" ולהפיץ את הנוזל המכיל תולעים מעל החלק של השקופית באמצעות הצד של קצה פיפטה המרכזי.
8. בואו התולעים להסתפק 30 שניות עד 2 דקות. אם השקופיות היא כראוי דביקות, הקצוות של התולעים ידבקו כפי שהם ליצור קשר עם השקופיות.
9. החזק את השקופית התחתונה ביד אחת ולמקם את השקופית העליונה מעל השקופית התחתונה, כך שכל אבל החלקים החלבית חופפות. הנוזל צריך לשמור את השקופיות מעט זו מזו, כך שהתולעים עדיין להזיז מעט אל תתנו השקופיות להחליק על אחד אחרת -. זה מסובב את התולעים.
10. לחץ בזהירות כלפי מטה שלבקלילות על השקופית העליונה, באמצעות האגודלים ואצבעות של כל יד. עם הכמות האידיאלית של לחץ, כמה הרמפרודיטים הגדולים ביותר על קצה השקופיות יהיה קרע, בעוד שרוב המבוגרים והזחלים ייצרו קשר עם כל שקופית אבל יישארו על כנן.
11. מייד ובזהירות (ללא החלקה) לשים את השקופיות על חתיכת המתכת על קרח יבש. השקופיות צריכה להיראות קפואות בתוך דקה אחת. שמור על קרח יבש למשך 5 דקות, עד שקפא ביסודיות.
12. בשלב זה, שקופיות ניתן לאחסן בתיבה שכותרתה ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. (אם הם נשמרים שבועות ב -80 מעלות צלזיוס, המים יתחילו נשגבים משם והתולעים לא יהיו כתם גם כן). אם שקופיות מאוחסנות ב-80 ° C, תן להם 'להתחמם' על קרח יבש ל10 דקות לפני הפיצוח.
13. המשך לשלב 3 (קיבעון).

2B. הכנת השקופיות של נמטודות בודדת

1. מניחים פיסת המתכת שטוחה על קרח יבש לPreCגבעה.
2. השתמש איסוף תולעת להעביר נמטודות פרט לטיפת מים על צלחת NGM כדי לשחרר אותם מחיידקים. נמטודות (ים) צריכה להיות מוזנת היטב כדי להקטין autofluorescence, אם אפשר. חזור על העברה למקומות חדשים של מים לפי צורך עד שהתולעת (ים) הן ללא חיידקים.
3. תווית צד חלבית של שקופיות polylysine עם מגלשות דיו ומקום בל תימחה על דלפק "התחתונה" ליד מיכל עם קרח יבש, בצד תווית למעלה. יש מספר שווה של "עליון" פחות חסיד שקופיות (ללא טיפול) זמינות.
4. מניחים ירידת μl 5-10 של מים באזור של השקופית התחתית כפול שטופלה עם polylysine. השתמש בנפח הגדול יותר אם העברה יותר תולעים, כדי למנוע מהמים מתאדים לפני ההשלמה.
5. העבר את התולעת (ים) לטיפה של מים עם בחירת התולעת, באמצעות מיקרוסקופ כדי לצפות כתולעים לשקוע לגעת במשטח השקופיות הדביק. העבר כמה כמו אחד תולעת רבות כמו 20 + תולעים לכל טיפה.
6. החזק את ים התחתוןLIDE ביד אחת ולמקם את השקופית העליונה מעל השקופית התחתונה, כך שכל אבל החלקים החלבית חופפים.
7. מייד ובזהירות (מבלי להחליק או דחיסה) לשים את השקופיות על חתיכת המתכת על קרח יבש. שמור על קרח יבש ל5-30 דקות. (אל תאחסן שקופיות אלה לטווח ארוך, כמו השקופיות בקלות להתייבש.)
8. המשך לשלב 3 (קיבעון).

3. קבעון

Fixatives נחוץ כדי "לתקן" את האנטיגן במקום בתא, או על ידי מזרז ("קיבעון אור") או cross-linking ("קיבעון קשה") אנטיגן. קיבעון עלול לשבש antigenicity; נוגדנים הידועים ביותר עבודה הטובה ביותר עם מצב קיבעון מסוים. לנוגדנים חדשים, מגוון של תנאי קיבוע צריך להיבדק.

לכל קיבעון, הצעד הראשון הוא להפוך את פתרון פוספט שנאגרו מלוח. שקופיות תיקון הבאה עם נמטודות עבור מכתים נוגדן בשיטה (אורלתקן באמצעות מתנול ואצטון) או B (תיקון קשה יותר באמצעות פורמלדהיד או glutaraldehyde).

1. הכן פתרון 10x PBS (בופר פוספט) המניה סטרילי ידי הוספת 80 גרם NaCl, 2.0 גרם KCl, 27.2 גרם Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2.4 גרם KH ₂ PO _4, 20 מיליליטר 10% המניה אזיד הנתרן. כדי להפוך את פתרון מניות זה, לשקול את אבקה אזיד הנתרן לעשות פתרון 10% במים מזוקקים פעמיים. מערבבים מלח עם חום עדין עד שהיא נמסה. זהירות: יבשה אזיד הנתרן הוא תגובתי וכל הצורות הן רעילות. ללבוש מסכה וכפפות בעת עבודה עם אזיד הנתרן יבש או פתרונות.
2. בואו מגניב מלוח (טריס pH הוא טמפרטורה רגישה), ואז ה-pH ל 7.2 עם 1-10 M NaOH. למעלה 1 ליטר עם מים מזוקקים פעמיים וחיטוי לעקר. אחסן בטמפרטורת חדר ולדלל את 1x לפי צורך במים מזוקקים כפולים סטרילי. זהירות: NaOH הוא מאכל - ללבוש כפפות בעת השימוש.

3A. תיקון אור באמצעות מתנול אצטון

1. שים מתנול 100%, אצטון 100%, וופר פוספט 1x (PBS) בצנצנות מכתים על קרח לprechill לפחות 10 דקות. זהירות: מתנול ואצטון הם רעילים, ללבוש כפפות.
2. קח זוג תחתון ועליונות שקופיות מהקרח היבש, במהירות לסובב אותם לגזרים, ולטבול באופן מיידי את השקופית "מלמטה" במתנול הקר כקרח במשך 2 דקות. השקופית "העליונה" יכולה להיות מושלכת.
3. העבר את השקופיות ממתנול לקרח אצטון הקר למשך 4 דקות. אם היו לי שקופיות תולעים רבים, רוב (90%) ייפלו בתיקון, אפילו עם השקופיות שהוכנו הטוב ביותר. אם שקופיות תולעת אחת הוכנו כראוי, התולעים צריכים להישאר דבקים.
4. הנח או טובל את השקופיות בצנצנת עם PBS (כדי לשטוף את מקבע) והמשך לשלב 4 (מכתים).

3B. תיקון קשיח באמצעות פורמלדהיד או glutaraldehyde

1. לדלל פורמלדהיד כיתה מגיב או פתרון glutaraldehyde ב 1x PBS ל0.5-4% ריכוז סופי. ma aliquots (1.5 מיליליטר)y יאוחסן כתרים בחוזקה ב-20 ל-30 ° C; להפשיר aliquots על קרח רק לפני השימוש. הערה: פתרונות פורמלדהיד לבזות לאורך זמן ועם חשיפה לאוויר. זהירות: פורמלדהיד וglutaraldehyde הם רעילים, ללבוש כפפות ולעבוד במכסת המנוע.
2. קח זוג תחתון ועליונות שקופיות מהקרח היבש, במהירות לסובב אותם בנפרד, ומניח מייד את השקופית "התחתונה" עם תולעים בצלחת שטוחה עם מכסה. (יכולה להיות מושלכת השקופית העליונה).
3. מייד פיפטה 200 מקבע רעיל μl מעל מרכז השטח של השקופית עם תולעים. מקבע באופן חלקי יקפא במקום, ולאחר מכן להמס כדי לכסות את האזור גדול יותר של השקופיות.
4. אם התולעים לא לגמרי מכוסים במקבע, באופן מיידי ובזהירות להוסיף עוד מקבע באמצעות micropipette. אל תאפשר מקבע לזרום מעבר לקצה של השקופית.
5. מכסה את הצלחת עם מכסה ולהשאיר למשך לילה 10 דקות בטמפרטורת חדר. הקפד המנה humidified אם incubations יותר arדואר בשימוש - זה יכול להיעשות על ידי הוספת מגבונים ללא סיבים רטובים מקופלים לצלחת. אל תתנו למגבונים לגעת בשקופיות.
6. לאחר הקיבוע הושלם, פיפטה בזהירות מקבעת עם תולעים רופפים לתוך צינור 1.5 מ"ל וטובל את השקופיות בצנצנת מכתים עם PBS.
7. לסובב את הצינור עם תולעים שהשתחררו במהירות גבוהה למשך 30 שניות לגלולה. יש לשטוף את התולעים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן לעבד במקביל לתולעים בשקופיות (עושה צעדים בצינורות microfuge, ולא בשקופיות).
8. המשך לשלב 4 (מכתים).

4. נוגדן מכתים

הפרוטוקול מכתים נוגדנים דומה לפרוטוקולים סטנדרטיים לרקמה כלשהי בשקופיות. פרוטוקול זה הוא זהה עבור כל השקופיות ללא קשר להכנה בשלבי 1-3.

1. הכן את נוגדן הצפת על ידי ערבוב 700 מיליליטר מים מזוקקים פעמיים, 100 מיליליטר 10x PBS, 5 מיליליטר טריטון X-100 (0.5% סופיים), 2 מיליליטר 0.5 M-pH EDTA 8 (1 מ"מ סופי), BSA 1 גר '(0.1% סופיים), 5 מיליליטר 10% AZ נתרןפתרון IDE (0.05% סופיים). pH 7.2 עם HCl, ואז להוסיף מים מזוקקים פעמיים לL 1; לאחסן ב 4 ° C.
2. הכן את הבלוק על ידי בנייה מחדש של סרום חמור במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן מוסיף 5 מיליליטר סרום ל45 מיליליטר חיץ נוגדן (סרום 10% סופיים).
3. הכן את פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים על ידי דילול נוגדן במאגר נוגדן בתוספת BSA 1%. דילולים מומלצים הם 1:50-1:2,000 עבור נוגדנים ראשוניים ו1:1,000-1:5,000 לנוגדנים משני (נוגדני Cy3or OG488 מצומדות חמורים נגד מינים המשמשים להעלאת נוגדן ראשוני).
4. הכן את מניית DAPI ידי ערבוב 2.5 מ"ג / מיליליטר במים מזוקקים כפולים; חנות ב8 aliquots μl קפוא ב-30 ° C. זהירות: DAPI הוא צבע-DNA מחייב רעיל, ללבוש כפפות בעת שקילה ומהחלק לaliquots.
5. הכן בינוני הרכבה 10 מיליליטר ידי ערבוב gallate n-propyl 200 מ"ג, 0.3 מיליליטר 1 M טריס 9 pH, מים מזוקקים כפולים 2.7 מיליליטר בצינור חרוטי 15 מיליליטר. חום ב65 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד שהיא נמסה.הוסף 7 מיליליטר גליצרול וaliquot 8 μl של DAPI ומערבולת היטב. בינוני aliquot לתוך צינורות 1.5 מיליליטר, לעטוף בנייר כסף, ולאחסן בחושך ב 4 ° C (שניהם אוויר והאור לבזות את המדיום - אם זה הופך להיות צהוב יותר, להשליך פסולת בBiohazard). זהירות: gallate n-propyl הוא נוגד חמצון תגובתי, ללבוש כפפות בעת שקילה.
6. העבר את השקופיות לצנצנת מכתים עם בלוק לשעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C (לילה עדיף לתיקון קשה). הימנע רועד, כדי למנוע תולעים לאבד.
7. העברת שקופיות מכתים צנצנת עם מגלשות נוגדן או מקום העיקרי שטוחות בצלחת והעליונה humidified כל אחד עם 100-500 נוגדן ראשוני μl. דגירה שקופיות הלילה בשעה 4 ° C בלי לרעוד.
8. לאחר דגירה נוגדן ראשוני, העברת שקופיות מכתים צנצנת של PBS.
9. סנן בלוק דרך המשפך מרופד בנייר המסנן ולאחסן ב 4 ° C, ואם כל 1-2 שבועות מסוננים סטרילי, בלוק ניתן לעשות שימוש חוזר ל1 חודשים או יותר. בדומה לכך, לסנן ולשמורנוגדן ראשוני ב4 ° C לשימוש חוזר (לתקופה של עד 10 או יותר סיבובים של צביעה).
10. יש לשטוף את שקופיות שלוש פעמים (~ 20 דקות כל אחד) במאגר נוגדנים.
11. הנח שקופיות בנוגדנים משני במכל מכתים אור חזק ודגירת 4 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
12. העברת שקופיות מכתים צנצנת של PBS. סינון ולחסוך נוגדנים משני ב4 ° C לשימוש חוזר (לתקופה של עד 10 או יותר סיבובים של צביעה).
13. יש לשטוף את שקופיות שלוש פעמים (~ 20 דקות כל אחד) במאגר נוגדנים.
14. העברת שקופיות PBS ולהשאיר ב-PBS (דקות לילה לעל 4 מעלות צלזיוס) עד מוכן לעלות.
15. לעבוד במהירות בשקופיות בודדות, כך שהתולעים על מול שקופיות להישאר רטובים. הסר שקופית אחת מPBS, לייבש אחורי של השקופיות עם לנגב נטולי סיבים, ומניחים על מגבת נייר.
16. מקום ~ 20 μl של הרכבה בינונית על תולעים, כך שיש חלקים שווים בערך בינוניים וPBS בשקופית ושקופית להטות בעדינות לתערובת את שני פתרונות. CAUTION: בינוני הרכבה הוא רעיל.
17. שקופיות הטיה קצה כל כך חלבית הוא נמוך ופתרון אוסף ליד זיגוג, ואז למקם את הקצה אחד של 24 x 60 coverslip מ"מ על פתרון.
18. בעדינות להוריד את coverslip כדי למזער את בועות אוויר (המגדילות הלבנת ולשבש צפייה). אם בועות להיווצר, להרים את הקצה של coverslip לאט, ואז relower זה בלי להכניס את coverslip על פני התולעים.
19. לייבש בזהירות מקצה השקופית מבלי להזיז את coverslip, על ידי דחיסת הקצוות עם לנגב ונטול מוך. הקצה היבש יחסית של השקופית חייב להיות גלוי בכל רחבי קצה coverslip
20. לאטום את coverslip עם 2-3 שכבות של לק. ניתן להציב שקופיות בהחזיק שקופיות שטוחות במהלך הכנה ואחסון כדי להגן מפני אור. ברגע שקופיות אטומה ויבשה היטב, לנקות את coverslip ואחורי של השקופיות.
21. יכולות להישמר שקופיות ובכן אטומות בחושך במשך ימים על 4 מעלות צלזיוס או שבועות ב -20 ° C. במשך זמן רב יותר תקופות, STA DAPIining של ה-DNA ואת רוב הצבעים הירוקים (למשל עירור ננומטר 488) לדעוך. לאטום את coverslip עם יותר לק לפי צורך, למשל לאחר השימוש בכל עדשת טבילת שמן.

תוצאות

כאשר תולעים הם דחוסים כמו שצריך, סדוקים, וקלילות קבועה, כמעט את כל התולעת יכולה להיות נגישה למכתים נוגדן (ראה איור 2). המיקום של הגרעינים כפי שצוין על ידי מכתים DAPI מציין איזה חלקים של התולעת הם שלמים כאשר התולעים חשופים למקבעים קשה יותר, כגון פורמלדהיד, המורפולוגיה של התולעת עלולה להיות מעוותת (כפי שניתן לראות על ידי הופעתו בצורה לא טבעית הגלי של שרירים באיורים 3A-D). בעיה נוספת נפוצה היא קיבעון או חדירה של רקמות מסוימות לא אחידים. דוגמא לכך היא...

דיון

פרוטוקול פיצוח ההקפאה הוא אחת מכמה שיטות למכתים נוגדן בג elegans. הוא מספק דרך פשוטה יחסית להכתים תולעים, אבל דורש חומרים כימיים מסוימים ולתרגל לתוצאות מיטביות. שלבים קריטיים (שמתוארים באיור 1) כוללים: 1) הכנת שקופיות (ראה שלבים 1 ו 2) דחיסה ידנית של נמטודות (ראה שלבים 2 ו -3) קיבעון מהיר (ראה שלב 3). ראשית, על מנת למקסם את ההידבקות של נמטודות לשקופיות, עדיף להכין שקופיות עם משקל מולקולרי גבוה (פולימר ארוך) polylysine, במקום להסתמך על שקופיות מוכנות מסחרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקופיות פולי-L-ליזין (מותג ESCO)	פישר	12-545-78	שקופיות המותג סיגמא מתאימות גם
פולי-L-ליזין הידרוברומיד	סיגמא	P1524	<חזק>חשוב: מותג ומשקל מולקולרי גבוה של שקופיות קצה חלביות בודדות קריטיות פוליליזין
	פישר	48312-002	מותגים אחרים מתאימים
נתרן אזיד	סיגמא	S2002-25G	TOXIC, ללבוש כפפות ומסכה תוך כדי שקילת אבקה כדי לייצר 10% מלאי. ללבוש כפפות בעת צנרת תמיסת מלאי
צנצנת מכתים קופלין	VWR	47751-792	מותגים אחרים מתאימים
דיוור 5 שקופיות	Electron Microscopy Science	71549-01	אחד ממותגים רבים ושונים של מחזיק שקופיות קטן, מתאים לצביעה
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	<חזק>חשוב: תמיסות פורמלין רגילות (37% פורמלדהיד) אינן מתאימות. או 1) ממיסים קריסטלין פרפורמלדהיד במאגר פוספט ומאחסנים בכמויות קטנות קפואות. או 2) לקנות פרפורמלדהיד בדרגת מיקרוסקופ אלקטרונים במיניקוטים. רעיל - ללבוש כפפות; השלך עודפי כיור למטה עם מים.
תמיסת גלוטראלדהיד, 25% במים	סיגמא	G 5882	<חזק>חשוב: לרכוש גלוטראלדהיד בדרגת מיקרוסקופ אלקטרונים באמפולות; רעיל - ללבוש כפפות; השלך עודפי כיור למטה עם מים.
Triton X-100	VWR	EM-9410	מותגים אחרים מתאימים
סרום בקר אלבומין	פישר	ICN820451	מותגים אחרים מתאימים
סרום חמורים, ליופיליזציה	Jackson Immunoresearch	017-000-121	מותגים אחרים מתאימים
Cy3 חמור נגד עכבר IgG רב תוויות	Jackson Immunoresearch	715-165-150	חברה זו מומלצת לנוגדנים מרובי תוויות באיכות גבוהה (מדוללי זיקה). בחר צבע ואנטיגן מתאימים (בעל חיים המשמש להעלאת נוגדנים ראשוניים).
n-פרופיל גלאט	פישר	ICN10274750	מותגים אחרים מתאימים
DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. ללבוש כפפות ולהוציא לתוך חבילות קטנות ולפזר כדי למזער את החשיפה
Whatman #1 מסננים בקוטר 15 ס"מ	פישר	09805G
Coverslip #1 1/2 מלבן 24 x 60 מ"מ	VWR	48393-252	#1 1/2 עובי הוא הטוב ביותר אופטית
תיקיית שקופיות מיקרוסקופ	VWR	48429-092	מותגים אחרים מתאימים