טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מומים מולדים Craniofacial להתרחש ב1 מתוך כל 700 לידה חיות, אבל אטיולוגיה ידועה לעתים רחוקות בגלל הבנה מוגבלת של פיתוח craniofacial. כדי לזהות היכן מסלולים ורקמות איתות לפעול בדפוסים של הפנים פיתוח, טכניקה 'השתלת הפנים' פותחה בעוברים של צפרדע Xenopus laevis. אזור של רקמות פנים משוערות ("אקסטרים Anterior דומיין" (EAD)) מוסר מעובר תורם בשלב tailbud, ולהשתיל לעובר מארח של אותו השלב, שממנו האזור שווה הערך הוסר. זה יכול לשמש כדי ליצור פנים chimeric בי הרקמה המארחת או תורם יש הפסד או רווח של תפקוד בגן, ו / או כוללת תווית שושלת. לאחר ריפוי, התוצאה של פיתוח היא בפיקוח, ומצביעה על תפקידים של מסלול האיתות תוך התורם או רקמות מארח שמסביב. Xenopus הוא מודל יקר ערך לפיתוח פנים, כמו אזור הפנים הוא גדול וקלותccessible להמיקרומניפולציה. ניתן assayed עוברים רבים, על פני פרק זמן קצר מאז פיתוח מתרחש במהירות. ממצאים בצפרדע רלוונטיים להתפתחות אנושית, שכן תהליכי craniofacial מופיעים נשמרים בין Xenopus ויונקים.
מבוא
כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס ליקויי craniofacial לידת 1-2, רקמות חשובות ותרומות האיתות שלהם במהלך התפתחות craniofacial חייב להיות מזוהה. בצפרדע Xenopus laevis, חלק מהפנים, כוללים את הפה וצורת נחיריים מ" אקסטרים Anterior דומיין "(EAD), שבו האאקטודרם והאנדודרם ישירות לצד זה 3-4. EAD פועל גם כמרכז איתות להשפיע על רקמות הסובבות, כוללים הרכס העצבי גולגולתי, המהווה את הלסתות ואזורי פנים אחרים 5. כדי לזהות את הגנים שתורמים לתפקוד EAD, טכניקה 'השתלת הפנים' פותחה, שבו רקמה מושתלת מתורם לעובר מארח, לאחר הסרת אזור המארח המתאים. בעקבות ההשתלה, וכתוצאה מפיתוח פנים הוא העריך. לכן, ההש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ריאגנטים הכנה
- MBS 10x: הכן 1 ליטר של 10x השתנה מלוח של ארת' (MBS) פתרון 17. עיין בטבלת 1, ריאגנטים, חומרים, והוראות. השתמש במים מזוקקים לכל הפתרונות. מערבבים בכוס, תוך שימוש בבר ומערבב, עד לפירוק מלא. כל הפתרונות צריכים להיעשות בטמפרטורת חדר.
- MBS 1x: לדלל של פתרון 10x MBS 100 מיליליטר ב900 מיליליטר של מים מזוקקים כדי להפוך 1 ליטר של MBS 1x. הוספת 0.7 מיליליטר של M CaCl פתרון 2 1.
- 0.1x MBS: MBS 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רקמות המושתלות צריכים להיות מוכנסות במלואו לתוך ראש המארח לאחר ההשתלה כפי שמוצגות באיור 3 א, ויש לי גשר זכוכית להציב כראוי על פניו של העובר, כפי שמוצגים באיור 2Bc. הרקמות המושתלות התורמות חייבים להיות בגודל נכון לפתיחה המארחת, להשתלה כדי להצליח. רקמת EAD לא צריכה לבלוט מהראש, בכל דרך, כפי שניתן לראות ב3B דמויות ו3C. בנוסף, השתלת הפנים לא צריכה להיות מסובבת יחסית למיקומה בגוף התורם, כפי שמוצג באיור 3D. לאחר כמה שעו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים ומגבלות קריטיים: הליך השתלת הפנים EAD הוא זמן ועבודה אינטנסיבי. זה דורש תרגול, ידיים יציבים, ומיומנות מושלמת. פרוטוקול השתלת פנים מסתמך על יכולתו של החוקר כדי להסיר ביעילות וברקמות להשתלה. אם אחד לוקח יותר מדי זמן להכניס את ההשתלה בפרצופו של המארח, את פני המארח יתחילו להתכווץ ולרפא. מלקחיים ניתן להשתמש בם כדי להרחיב את אזור הפנים בעדינות. עם זאת, אם התכווצות פצע משמעותי התרחשה, ההשתלה לא תרפא גם כן וייתכן שיהיה הצורך בגודל מופחת להשתלב חור הפנים של המארח. הגודל של ההש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים לראדק Sindelka על עזרתו, וקאש Bresilla לסיוע עם בעלי צפרדע והכנת עובר. עבודה זו מומנה על ידי NIH באמצעות R01DE021109 המענק לHLS לורה Jacox מומן על ידי הרשל סמית בוגר המלגה באוניברסיטת הרווארד ומענק מלגה בודדת F30 F30DE022989-01 דרך NIDCR.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פיפטה פסטר | VWR | 14672-400 | זכוכית ליים |
| גודל 5 3/4 | בכותנה פיפטת העברה מדורגת סתומה | ||
| VWR | 16001-180 | חד פעמי | |
| #5/45 מלקחיים | כלים מדעיים עדינים מאת Dupont medical | 11251-35 | זווית 45° |
| מלקחיים דפוס סטנדרטי | כלי מדע עדינים | 11000-20 | ישר; קצה משונן; צינורות נימי נירוסטה |
| (למחטים) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ ID/ |
| סיבים כיסוי החלקה | VWR | 48393 252 | 24 x 60 מ"מ זכוכית כיסוי מיקרו; |
| חולץ מחטים Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Sutter Instrument | Co Needle Puller: נימה שהופסקה: FB300B | מושך המחט הדומה ביותר, הזמין כיום הוא ה-P-97. עבור חוטים, השתמש בחוטי קופסה מרובעים של Sutter 3.00 מ"מ, ברוחב 3.0 מ"מ. | |
| דגם P-80 | מיקרופיפטה בוער / חום | ||
| סטריאומיקרוסקופ | Zeiss | ||
| תאורת סטריאומיקרוסקופ מאת Fostec | Fostec | השתמש בקופסת אור עם 2 זרועות סיבים אופטיים. | |
| מחזיק סיכה מצופה ניקל | כלי מדע עדינים | 26018-17 | קוטר פתיחת לסת: 0-1 מ"מ |
| מחזיק סיכה מצופה ניקל מוריה | כלי מדע עדינים | 26016-12 | קוטר פתיחת לסת: 0-1 מ"מ |
| מחטי טונגסטן | כלי מדע עדינים | 10130-05 | 0.125 מ"מ קוטר מוט |
| ואן אקן פלסטלינה | Blick | #33268-2981 | |
| דוגמנות חימר- לבן, אדום או mMessage צהוב | |||
| mMashine SP6 או T7 ערכת | אמביון | AM1340 |
מקורות
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potenti....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
