הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

4.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50722

⸱

23 בדצמבר 2013

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

במאמר זה

סיכום

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

תקציר

WRN exonuclease מעורב בפתרון נזק ל-DNA המתרחש במהלך שכפול DNA או בעקבות חשיפה לגנוטוקסינים אנדוגניים או אקסוגניים. סביר להניח שהוא ישחק תפקיד במניעת הצטברות של תוצרי ביניים רקומבינוגניים שאחרת היו מצטברים במזלגות שכפול שנתקעו באופן חולף, בהתאם לפנוטיפ היפר-רקומביננטי של תאים חסרי WRN. בבני אדם, תחום האקסונוקלאז מורכב מחלק N-terminal של חלבון גדול בהרבה שיש לו גם פעילות הליקאז, יחד עם אתרים נוספים החשובים לאינטראקציה של DNA וחלבון. לעומת זאת, בדרוזופילה, פעילות האקסונוקלאז של WRN (DmWRNexo) מקודדת על ידי לוקוס גנטי מובהק מההליקאז המשוער, המאפשר דיסקציה ביוכימית (וגנטית) של תפקיד פעילות האקסונוקלאז במנגנוני יציבות הגנום. כאן, אנו מדגימים שיטה פלואורסצנטית לקביעת פעילות אקסונוקלאז WRN באמצעות DmWRNexo רקומביננטי מטוהר ואוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים עם תווית קצה. מערכת זו מאפשרת יכולת שחזור גדולה יותר מאשר בדיקות רדיואקטיביות מכיוון שהאוליגונוקלאוטידים של הסובסטרט נשארים יציבים במשך חודשים, ומספקת שיטה בטוחה ומהירה יחסית לניתוח מפורט של פעילות נוקלאז, המאפשרת קביעת קוטביות נוקלאז, תהליכיות והעדפות מצע.

מבוא

נוקלאזות ממלאות תפקיד חיוני בתאים בהסרת DNA פגום, פתרון מבנים לא-דופלקסיים כגון צומתי הולידיי ומתן יכולת קריאת הגהה במהלך שכפול ה-DNA, הן מהותי בתוך DNA פולימראז והן חיצוני להם1. נוקלאזות יכולות לפעול על ידי פירוק רציף של DNA מקצוות חופשיים (אקסונוקלאזים) או על ידי פיצול קשרי פוספודיאסטר פנימיים בתוך מולקולת DNA ארוכה יותר (אנדונוקלאזות). אובדן פעילות נוקלאז יכול לגרום לפנוטיפים ספציפיים ביותר של חוסר יציבות גנום. בעוד שמוטציה של בן משפחת הליקאז RecQ BLM גורמת לשיעורים גבוהים מדי של חילופי כרומטידים אחות ושיעורי סרטן גבוהים בעולם (נבדק על ידי פיין והיקסון2), מוטציה של חלבון WRN הקשור מאוד מובילה להזדקנות מוקדמת3; ההבדל המשמעותי העיקרי בין שני בני המשפחה הללו הוא הנוכחות של תחום אקסונוקלאז 3'-5' עם WRN4. עדויות לתפקיד קריטי של האקסונוקלאז WRN בשמירה על יציבות הגנום הצטברו מניתוח גנוטיפים בחולי WS5, יחד עם מחקרי מוטציה נקודתית ומחיקה בתאים אנושיים, המגובים במחקרים קריסטלוגרפיים של תחום האקסונוקלאז המבודד6. עם זאת, שיתוף פעולה ודיבור צולב בין פעילות האקסונוקלאז של WRN לבין פעילות ההליקאז המרכזית שלו7 מקשה על הפרדת הפונקציונליות של כל אחד מהם ותרומתם היחסית ליציבות הגנום. בצמחים ובבעלי חיים מטזואים נמוכים יותר, פעילות אקסונוקלאז WRN קיימת על פוליפפטיד יחיד חסר פעילות הליקאז8-10 (נסקר בקוקס ובובריאק11); הוכח ביוכימית ב-Arabidopsis כי אקסונוקלאז זה פועל בתיאום עם הליקאז WRN הקוגנטי, ולמעשה משחזר את פעילויות האנזים המשולבות שנצפו ב-WRN9 של בעלי חוליות. חקרנו אקסונוקלאז WRN בדרוזופילה מכיוון שהכלים הגנטיים המצוינים מאפשרים ניתוח של ההשפעה של מוטציה אקסונוקלאז (מבלי להשפיע על ההליקאז הקוגנטי המשוער) ברמת האורגניזם השלם ובמהלך ההתפתחות10,12. יתר על כן, שיבטנו, ביטאנו וטהרנו אקסונוקלאז רקומביננטי של Drosophila WRN (DmWRNexo) המאפשר ניתוח ביוכימי מלא של תכונות האנזים שלו13,14.

ניתוח נוקלאז במבחנה נערך באופן מסורתי באמצעות אוליגונוקלאוטידים עם תווית רדיו, הערכת פירוק על ידי חיפוש סולם של מוצרים על ג'ל אקרילאמיד4,8,15. למרות שהן רגישות, בדיקות כאלה אינן ניתנות לשחזור כמותי מדי יום בגלל דעיכה רדיואקטיבית של המצעים המסומנים. בנוסף, טיפול וסילוק ריאגנטים רדיואקטיביים מהווים בעיות סביבתיות ובריאותיות משמעותיות; גם המקור של רדיו לייבל הופך לבעייתי יותר ויותר. שיטה חלופית עדכנית מעריכה את כמות תוצר הפירוק הסופי על ידי ספקטרומטריית מסה16. עם זאת, זה גוזל זמן (לוקח מספר ימים), דורש ציוד מיוחד, והקריאה היא כמות התוצר הסופי (נוקלאוטיד בודד) ולכן אינו מתאים למדידה רגישה של היבטים כגון עיבוד אנזים או לקביעה אם נוקלאוטידים, רצפים או שינויים מסוימים מובילים להפסקה או עצירה של נוקלאז. כדי להתגבר על בעיות אלה, התאמנו את הבדיקות המסורתיות מבוססות הג'ל לשימוש עם מצעי אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים, ויצרנו מצעים מסומנים ביציבות שניתן להשתמש בהם באופן שחזורי לאורך תקופות זמן ארוכות ובכך לאפשר השוואה ישירה של פעילויות נוקלאז בתנאים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת אוליגונוקלאוטידים של סובסטרט

  1. לסנתז אוליגונוקלאוטידים מותאמים אישית.
    1. תכנן אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי אחד עם מולקולת פלואורסצאין מצומד 5'; זה יהיה עמוד השדרה לכל מצע. (שים לב שזה מיועד לאקסונוקלאז 3'-5'; עבור אקסונוקלאז קוטביות של 5'-3' השתמש בגדיל עמוד שדרה מצומד 3'). אם הקוטביות אינה ידועה, יש לבדוק גם 3' וגם 5'.
    2. תכנן גדילים משלימים כך שכאשר מחושלים לאוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטי, נוצרים מצעי הדופלקס לבחירה. שימו לב שהגדיל המשלים אינו מצומד לפלואורופור. בעת ההזמנה יש לציין טיהור PAGE (התפלה אינה מספיקה).
    3. אחסן מלאי אוליגונוקלאוטידים מאוחסנים ב-10 מ"מ ב-1 ננומול/מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס ובחושך.
  2. מערבבים את עמוד השדרה המסומן אוליגונוקלאוטיד עם כל אוליגונוקלאוטיד משלים ללא תווית ביחס מולארי של 1:1.2 של מסומן: ללא תווית במאגר (10 מ"מ Tris-HCl pH 7.6, 1 מ"מ EDTA pH 8.0, 50 מ"מ NaCl). (הערה: יחס של 1:1 הוא הרצוי ביותר אך חשוב יותר שכל הגדיל המסומן יהיה קשור. יחסים של 1:1 - 1:1.5 יכולים לעבוד.)
  3. מחממים אמבט מים או גוש חום ל-95 מעלות צלזיוס ומניחים את תערובת החישול לתוכה למשך 3 דקות ואז מכבים ומניחים לכל להתקרר לאט (1 מעלות צלזיוס לדקה) מתחת ל-30 מעלות צלזיוס.
  4. בדוק חישול מלא של האוליגונוקלאוטיד המסומן על ידי הפעלת המצע הדופלקס המתקבל על ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי של 10% (10% 19:1 אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד ב-1x Tris-Borate-EDTA (TBE, 89 מ"מ בסיס טריס, 89 מ"מ חומצה בורית, 2 מ"מ EDTA) מפולימר עם 0.05% w/v אמוניום פרסולפט (APS) ו-0.005% v/v TEMED). דמיין באמצעות PhosphorImager (ראה סעיף 5 להלן).

2. הכנת ג'ל אקרילאמיד

  1. הגדר את מערכת יציקת הג'ל למשל אסדת ג'ל Hoefer SE400 עם צלחות בגודל 16 ס"מ על 18 ס"מ ומרווחים של 1.5 מ"מ.
    1. נקו היטב צלחות זכוכית ומרווחים באמצעות חומר ניקוי ומים. ללבוש כפפות נקיות כדי למנוע לכלוך מחדש של הצלחות בשמן מהאצבעות, מה שיפגע בהיווצרות ג'ל עקבית.
    2. שטפו את הצלחות בהרבה מים מזוקקים (נטולי יונים) כדי להסיר שאריות חומרי ניקוי, ולאחר מכן נגבו עם טישו נטול מוך (למשל Kimwipes).
    3. לבסוף, יש לרסס עם 70% אתנול ולנגב - צלחות זכוכית צריכות לחרוק אם הן נקיות. הניחו בצד זקוף כדי לאפשר לאחרון האתנול להתאדות.
    4. נקו את שאר הציוד ליצירת הג'ל במים מזוקקים (השתמשו תחילה בחומר ניקוי במידת הצורך) וייבשו.
    5. הרכיבו את לוחות הזכוכית והמרווחים לתוך המתקן ליצירת ג'ל, וודאו שהמערכת חסינת דליפות.
  2. הכן את תמיסת הג'ל לאחוז הפוליאקרילאמיד הרצוי
    1. לבדיקת נוקלאז, השתמש בג'ל פוליאקרילאמיד 14% עם 8 M אוריאה ב-1x TBE.
    2. להכנת 100 מ"ל (מספיק ל -2 ג'לים עם הרבה עודף לדליפה) קחו 48.05 גרם אוריאה בכוס רחבה והוסיפו 35 מ"ל 40% תמיסת אקרילאמיד 19:1 ו -10 מ"ל 10x TBE (890 מ"מ טריס, 890 מ"מ חומצה בורית, 20 מ"מ EDTA, pH 8.3 עם NaOH). זהירות: יש ללבוש כפפות - אקרילאמיד הוא רעלן עצבי חזק. ממיסים את האוריאה בעזרת מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית (זה ייקח קצת זמן).
    3. כאשר הם מומסים, יש להוסיף מים נטולי יונים של milliQ ל-100 מ"ל. יש לעקר את המסנן באמצעות ממברנה של 0.22 מיקרומטר. אם אין להשתמש בו מיד, יש להסיר גז לזמן קצר באמצעות ציוד יניקה ולאחסן בחושך (יישמר מספר ימים). אין לקרר מכיוון שהאוריאה תזרז.
  3. פילמרו ויציקו את הג'ל.
    1. קח את האוריאה-אקרילאמיד והוסף 0.5 מ"ל 10% (w/v) אמוניום פרסולפט (APS, המורכב במים מזוקקים) ו-50 מיקרוליטר TEMED. מערבבים את המיכל לאט לערבב מבלי להקנות אוויר (מה שיעכב פילמור) ויוצקים לתוך הג'ל הראשון. פעל במהירות או שהג'ל עלול להתייצב לפני סיום המזיגה.
    2. הוסף את המסרק המתאים ליצירת בארות לטעינת דגימה (נבחר על פי אסדת הג'ל ומספר הדגימה שיש לנתח, למשל מסרקים בעלי 15 או 29 שיניים מתאימים לשימוש עם מתקן הג'ל של הופר). בדוק שלא מוכנסות בועות אוויר מתחת לשיני המסרק.
    3. השאירו להתייצבות. צג לדליפה. פילמור מלא מתעכב במסרקים עקב מגע עם האטמוספירה. כאשר הבארות יציבות, שאר הג'ל יתייצב.
    4. הסר את המסרקים ושטוף אקרילאמיד לא מפולימר באמצעות מים ופיפטה.
  4. הגדר את הג'ל לריצה.
    1. הכנס את הג'ל היצוק למערכת ריצת הג'ל והוסף את הכמות המתאימה של מאגר ריצה 1x TBE לתוך החדר התחתון ולבארות הג'ל. הג'ל מוכן כעת לטעינה.

3. הכנת חלבון DmWRNexo רקומביננטי מתויג

  1. ביטוי חיידקי של חלבון DmWRNexo
    1. באמצעות לולאת חיסון, אסוף חיידקים על ידי גירוד על פני השטח של מלאי גליצרול הנשמר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (חיידקים הם E. coli T7 Iq LysY (NEB) שעבר טרנספורמציה עם pIVEX2.3d-DmWRNexo). פס על צלחות LB-agar (10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 5 גרם NaCl, 15 גרם אגר העשוי עד 1 ליטר עם מים מזוקקים ו-pH מותאם ל-7.4) עם 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. דגירה הפוכה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. בחרו מושבה אחת מהצלחת ל-50 מ"ל LB (10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 5 גרם NaCl המורכב עד 1 ליטר עם מים מזוקקים) בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין (מורכב במים ומעוקר בפילטר ל-0.22 מיקרומטר). גדל עם טלטול ב-220 סל"ד 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. יש לחסן 1.8 ליטר (כמות של 600 מ"ל כל אחת בשלוש צלוחיות חרוטיות של 2 ליטר כדי להבטיח אוורור נאות) של LB-אמפיצילין בתרבית לילה של 50 מ"ל ולהגדיל ל-OD600 ~ 0.8. יש להוסיף IPTG לריכוז סופי של 0.7 מ"מ ולדגור בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס (למניעת צבירת חלבונים) תוך ניעור למשך 4-8 שעות.
    4. קצרו את גלולת התא על ידי צנטריפוגה ב-8,000 סל"ד 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות - השתמשו ב-6 בקבוקי צנטריפוגה סטריליים מפלסטיק בנפח 500 מ"ל עם תרחיף תאים של 300 מ"ל בכל אחד. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור בנפח קטן (10 מ"ל) של ה-LB-amp המקורי, העבירו לצינור פלקון של 15 מ"ל ואז סובבו מחדש ב-5,000 סל"ד כדי לגלול את התאים - הסירו שוב את הסופרנטנט והקפיאו ב-80 מעלות צלזיוס (זה עוזר לליזה).
  2. ליזה של תאי חיידקים
    1. איפור 3.2 מ"ל מאגר ליזה המכיל 1 מ"ל 5 M NaCl, 1 מ"ל 1 M DTT, 200 מיקרוליטר 1 M בנזמידין ו-1 מ"ל 10 מ"ג/מ"ל ליזוזים (מושעה במים מזוקקים).
    2. לכל גלולה שמקורה בתרחיף חיידקים של 300 מ"ל, הוסף מאגר ליזה של 320 מיקרוליטר. השעו כמה שיותר - השתמשו בקצה p1000 'מנוסר' וערבבו כמו גם פיפטינג למעלה ולמטה. דגירה על קרח 20 דקות. הוסף עוד מאגר ליזה של 100 מיקרוליטר וערבב היטב ואז העביר כמה שיותר מהליזט התלוי לתוך צינור מיקרופוגה (הוא יהיה צמיג מאוד וקשה לפיפטה).
    3. צנטריפוגה את הליזאט ב-14,000 סל"ד ברוטור מיקרופוגה מקורר מראש ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז קח את הסופרנטנט לצינור מיקרופוגה נקי: זה מכיל את החלבון הרקומביננטי.
  3. טיהור המלכודת שלו
    1. הכנת ריאגנטים: סמן 5 צינורות מיקרופוגה עבור כל אחד מהריכוזים הבאים של אימידזול: 40 מ"מ, 60 מ"מ, 100 מ"מ, 300 מ"מ ו-500 מ"מ (למשל תווית 40-1, 40-2, 40-3 וכו'), שישמשו לאיסוף שברי העמודה. אחסן את הצינורות על קרח ברשת עם מכסים פתוחים (אך מכסים באופן רופף בניילון נצמד או דומה כדי לשמור על ניקיון בזמן הכנת כל השאר). הרכיבו 25 מ"ל של 20 מ"מ אימידזול ו-10 מ"ל מלאי של כל אחד מהריכוזים האחרים של אימידזול בצינורות אוניברסליים של 25 מ"ל, תוך שימוש ב-1x PBS (8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4, pH מותאם ל-7.4 ועשוי עד 1 ליטר עם מים מזוקקים) כמדלל.
    2. התאם את הליזט החיידקי ל-20 מ"מ אימידזול באמצעות נפח מתאים של תמיסת מלאי אימידזול של 2 M, והתאם את הנפח ל-1 מ"ל לפחות (<5 מ"ל) באמצעות 20 מ"מ אימידזול.
    3. שטפו עמוד His-Trap של 1 מ"ל (אמרשם) עם 10 מ"ל מי MilliQ באמצעות מזרק של 5 או 10 מ"ל עם נעילת לואר ולחץ ידני עדין, ולאחר מכן אזנו את העמודה על ידי מעבר דרך 10 מ"ל של 20 מ"מ אימידזול המורכב ב-PBS (ראה שלב 3.3.1 לעיל).
    4. טען את הליזאט על העמודה. כאשר הליזאט נטען על העמוד, עלול להיווצר לחץ אחורי משמעותי; זה נורמלי לחלוטין. אל תתפתו להפעיל כוח רב מדי על המזרק, ושמרו על לחץ אחיד ויציב. מקובל לראות שינוי צבע קל כאשר הליזאט נכנס לעמודה. יש לאסוף את הזרימה בבקבוק סטרילין ביז'ו (קיבולת של 7 מ"ל) ולאחסן על קרח.
    5. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של 20 מ"מ אימידזול ואספו אותו בשפופרת אוניברסלית של 25 מ"ל על קרח, שכותרתה 'שטיפה'.
    6. העבירו 5 מ"ל של 40 מ"מ אימידזול דרך העמודה, אספו שברים של 1 מ"ל לכל אחד מצינורות המיקרופוגה (מסומנים 40.1, 40.2, 40.3 וכו '): צפו בזהירות בבוכנה של המזרק מכיוון שהיא מאפשרת מדידה של 1 מ"ל.
    7. כעת עוברים ברצף דרך 5 מ"ל מכל אחד מ-60 מ"מ, 100 מ"מ, 300 מ"מ ו-500 מ"מ אימידזול, ואוספים שוב 5 x 1 מ"ל שברים בכל ריכוז מלח.
  4. ניתוח שברי עמודות
    1. כתם נקודה: נקודה 2 מיקרוליטר מכל שבר עמודה (וגם להעמיס, לזרום ולשטוף) על יריעת ניטרוצלולוזה - זה קל יותר אם זה נקבע מראש עם רשת באמצעות עיפרון רך). יש להניח לייבוש באוויר. עבד את כתם הנקודות על ידי חסימה למשך 15 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר בחלב מיובש ללא שומן 5% המורכב ב-PBS עם 0.2% v/v Tween 20, ולאחר מכן שטוף ב-PBS-Tween מספר פעמים ודגירה עם נוגדן HRP-anti-his מדולל 1:500 ב-PBS-Tween למשך 30-60 דקות. שטפו בהרחבה עם PBS-Tween ולאחר מכן PBS, וזהו נוגדנים קשורים באמצעות כימילומינסנציה משופרת (ECL), המוצג ב-Hyperfilm MP. כתם נקודות זה נותן מושג מצוין על שברי שיא לפני ניתוח SDS-PAGE, ויכול ליידע את שלבי הטיהור הבאים במידת הצורך (למשל, אם יציבות החלבון מהווה בעיה, ניתן לאגד שברי שיא על סמך תוצאות כתמי נקודות ולטעון ישירות על עמודות סינון ג'ל - ראה שלב 3.5 להלן).
    2. SDS-PAGE: אסוף 50 מיקרוליטר מכל שבר עמודה לתוך צינור מיקרופוגה מסומן המכיל 50 מיקרוליטר 2x צבעי טעינת SDS-PAGE (4% w/v SDS, 20% v/v גליצרול, 120 מ"מ Tris-HCl pH 6.8 עם 200 מ"מ DTT). הרתיחו את הדגימות הללו במשך 5 דקות בחום של 95-100 מעלות צלזיוס (שימו לב אם משתמשים בבלוק חם ללא מכסה מחומם, צרו חור קטן במכסה של כל צינור בעזרת מחט מזרק צרה כדי למנוע מהצינורות 'להתפוצץ' כשהם מתחממים). הפעל מיניג'ל של 10% SDS-PAGE וטען 10 מיקרוליטר מכל שבר עמודה וצבוע בכחול מבריק של Coomassie כדי לאמת את שיא השברים ואחוז הטוהר של החלבון. במידת הצורך, ניתן גם לכתם מערבי לחלבון המתויג שלו על ידי העברת חלבונים המופרדים על ידי SDS-PAGE לניטרוצלולוז; לחסום את הממברנות עם 5% חלב דל שומן ב-PBS-0.2% Tween 20, ואז לשטוף ולבדוק עם נוגדן אנטי-HIS מצומד HRP (1:500) באשר לכתם הנקודה.
  5. כדי להגביר את הטוהר, ניתן לאסוף את שברי השיא מעמודת המלכודת שלו ולהעמיס אותם על עמוד סינון ג'ל Superdex 75 עם פליטה במלח הולך וגובר (כפי שתואר קודם לכן Boubriak et al.13 ומייסון ואחרים. 14).

4. בדיקת נוקלאז

  1. הכינו מלאי עבודה של מצעים.
    1. השתמש במצע של 20 pmol לכל תגובה (אם כי ניתן לשנות זאת בהתאם לשאלה שיש להתייחס אליה) כך שמלאי עבודה נוח הוא 200 pmol/μl (כלומר פי 10). מלאי עבודה מורכב בכמויות קטנות של מאגר חישול (10 מ"מ Tris-HCl pH7.6, 1 מ"מ EDTA pH 8.0, 50 מ"מ NaCl) או ב-10 מ"מ Tris-HCl pH 7.0 (עד pH 8.5, על פי נוקלאז) ללא מלח או EDTA, בהתאם לרגישות האנזים או הבדיקה שיש לבצע.
    2. שומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ובחושך (עטוף בנייר כסף). מצעים מחזיקים מעמד שבועות רבים ללא אובדן שלמות דופלקס או אות פלורסנט.
  2. בדיקת ריכוז חלבון אקסונוקלאז על ידי ניתוח קולורימטרי, או ספקטרומטריית UV ב- Abs260.
    1. יש לאחסן במכסות קטנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    2. אם הדגימות מוקפאות/מופשרות פעם אחת, הניחו שיעור קיפול שגוי של חלבון של 5% (או הגדירו באופן אמפירי עבור כל חלבון שייבדק) והתאימו את הריכוזים בהתאם.
    3. השליכו חלבונים לבדיקת פעילות אקסונוקלאז לאחר שני מחזורי הקפאה/הפשרה, ושימו לב למצב החלבון עבור כל ניסוי.
  3. תכנן ניסוי וחשב כמויות תמהיל ראשי (MM) עבור דוגמאות.
    1. צור MM המכיל את כל הרכיבים המשותפים לדגימות הנבדקות (בדרך כלל הכל מלבד האנזים או המצע) כדי להפחית את השונות בין הדגימות.
    2. אפשר שגיאת פיפטינג בעת הרכבת ה-MM, למשל חישוב נפחים עבור דגימות N על ידי ביצוע מספיק עבור דגימות (N + 0.1N).
    3. הגדר תגובות בנפח כולל של 20 מיקרוליטר לדגימה, המכיל 1 pmol של אנזים ו-20 pmol של סובסטרט (כברירת מחדל לפני אופטימיזציה - ברור שהכמויות משתנות בהתאם למה שנבדק, למשל לשנות את כמות האנזים אם בודקים את השפעת ריכוז האנזים). עבור DmWRNexo, המאגר האופטימלי לפעילות נוקלאז נמצא באופן אמפירי כמכיל 40 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 4 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ דיתיותרייטול, עם 0.1 מ"ג/מ"ל ביולוגיה מולקולרית BSA.
  4. הגדירו רגשות.
    1. שמור את כל הריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (דלי קרח או קריוראק).
    2. הרכיבו את תערובת המאסטר והכניסו למספר המתאים של שפופרות מיקרופוגה סטריליות ללא DNase בנפח 0.5 מ"ל. כלול בקרה ללא אנזים כדי להמחיש את הסובסטרט הראשוני (בקרה לא מתפרקת).
    3. הגדר בלוק חום לטמפרטורה המתאימה לפעילות האנזים (37 מעלות צלזיוס, עם נקודת זמן סופית של 30 דקות הייתה אופטימלית עבור DmWRNexo, אם כי ייתכן שיהיה צורך לקבוע זאת באופן אמפירי על ידי השוואת פעילות האנזים הנבחר בטווח של טמפרטורות וזמנים). יש לבדוק בקפידה מעכבי אנזימים פוטנציאליים הנמצאים בדרך כלל במאגרים (למשל EDTA מעכב DmWRNexo, כמו גם עודף ATP14, ככל הנראה על ידי כלציה של Mg2+ קריטי לפעילות נוקלאז). שימו לב שאפילו לריכוזים גבוהים של אימידזול (>300 מ"מ) אין השפעה על פעילות האנזים DmWRNexo ואינם מרווה את הקרינה.
    4. תמיסת איפור STOP (80% פורממיד, 1x TBE). זה ב-3x. זה עשוי להכיל צבעים כגון כחול ברומופנול במידת הצורך. אחסן ב-RT.
    5. הגדר את הדברים הבאים ליד גוש החום: הריאגנט/ים הסופיים שיתווספו לתערובת התגובה (בדרך כלל אנזים); פיפטור וקצוות של 1-10 מיקרוליטר , טיימר, קריורק או דלי קרח, ותמיסת STOP.
  5. התחילו את התגובה.
    1. הגדר את הטיימר על הוספת אנזים לצינור הראשון. הנח את הצינור בגוש החום.
    2. המשך להוסיף אנזים לשאר הצינורות במרווחי זמן מתאימים. (15 שניות זה מספיק לתגובות פשוטות שדורשות רק פתרון STOP כדי להשלים). יש להניח בבלוק חום מיד לאחר הוספת האנזים.
  6. עצרו את התגובה.
    1. כאשר הטיימר מגיע לזמן הנכון (למשלamp15 דקות) הוסף תמיסת STOP של 10 מיקרוליטר לדגימה הראשונה וערבב על ידי פיפטינג. מניחים מיד על קרח/בקריוראק.
    2. המשיכו לעצור את התגובות במרווחי הזמן המתאימים ובאותו סדר שבו הן הוגדרו, כך שלכל תגובה היה בדיוק אותו זמן דגירה.
  7. הדגימות מוכנות כעת לטעינה על ג'ל הדנטורציה המוכן.
    1. טען מחצית (או את כולם) מכל דגימה באמצעות טיפים לטעינת ג'ל לפיפטינג מדויק. ברמות האוליגו-נוקלאוטיד המשמשות בתגובה, מחצית מהתגובה תיתן תפוקה טובה להדמיה ותאפשר הפעלה חוזרת (למשל אם הג'ל הראשוני אינו פועל כהלכה).
    2. נוח לטעון תמיסת STOP אחת המכילה צבע (למשל ברומופנול כחול) בנתיב אחד או יותר כדי לוודא כיצד הג'ל פועל.
    3. אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים בגדלים ידועים עשויים להיות מופעלים לצד הדגימות כסמן גודל.
  8. הפעל את הג'ל.
    1. הוסף את תא החיץ הפועל העליון למנגנון הג'ל ומלא במאגר רץ (1x TBE), וודא שהדגימות אינן מופרעות. בדוק אם יש דליפת מאגר.
    2. חבר את מתקן הג'ל לאספקת חשמל והפעל ב-200 וולט (מתח קבוע) למשך 150-200 דקות או עד שהצבע הכחול ברומופנול (אם משתמשים) נמצא כשני שליש מהדרך במורד הג'ל (הוא עובר סביב הרמה של 10nt DNA בג'ל באחוז זה). עקוב אחר דליפת מאגר, שעלולה להטות או למנוע היפרדות.
    3. עצור את הג'ל והסר מהמנגנון הפועל.

5. ניתוח והדמיה של ג'ל

  1. קבע את הרגישות של ה-Imager לשימוש, למשל Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager יכול לזהות פלואורסצנטיות של פלואורסצין באמצעות לייזר כחול של 473 ננומטר, תוך שימוש בהגדרת הרגישות הגדולה ביותר שלו של F1000 וקריאת הפיקסלים הקטנה ביותר (רזולוציה) של 50 מיקרומטר.
  2. סרוק את הג'ל.
    1. הסר בזהירות את המרווחים וצלחת ג'ל אחת. שטפו היטב את הג'ל שנותר על צלחת הג'ל השנייה (אך בזהירות) כדי להסיר עקבות של אוריאה משקעת שאחרת יפריעו לסריקה.
    2. הנח את הצלחת (כשהג'ל עדיין מחובר) על פני הזכוכית של מחזיק הג'ל והנח אותה בתוך ההדמיה. שימו לב לקואורדינטות הג'ל על הכוס (אם הוא לא ממלא את כל המשטח).
    3. פתח את התוכנה המתאימה במחשב המחובר וסרוק את האזור המצוין באזור הסריקה שבו נמצא הג'ל. השתמש בתנאים הטובים ביותר שנקבעו כמו בשלב 5.1. הקובץ שיתקבל יהיה גדול יחסית (מספר MB), אך ניתן לחתוך ולדחוס את התמונה במידת הצורך.
    4. שמור, ואז ייצא כקובץ שניתן לקרוא על ידי תוכנת ניתוח, למשל ייצוא .tiff לניתוח באמצעות ImageJ.
  3. נתח את הנתונים.
    1. בדיקת אקסונוקלאז מוצלחת תגרום לפירוק המצע ברצף לאורך האוליגונוקלאוטיד לכיוון הפלואורופור, וכתוצאה מכך דפוס דמוי סולם אופייני של שברי DNA פלואורסצנטיים על הג'ל. מינים עם ניידות גבוהה יותר על הג'ל (הפועלים רחוק יותר) קטנים יותר מהמצע ההתחלתי הלא מתפרק ולכן מייצגים תוצרים של פירוק אקסונוקלאז.
    2. השתמש בכלי 'ג'לים' ב-ImageJ כדי לכמת את העוצמות היחסיות של מינים בכל נתיב בהתאם לניידות שלהם, על מנת לקבוע את רמות הפירוק ומכאן פעילות אקסונוקלאז בכל דגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביצוע ניתוח in vitro של פעילות אקסונוקליאז דורש מספר שלבי הכנה בנוסף לניתוח עצמו. סקירה כללית של הפרוצדורות מוצגת ב-איור 1.

לפני ביצוע בדיקות אקסונוקלאז המבוססות על פלואורסצנציה, קריטי לבצע אופטימיזציה של זיהוי תת-המצע (substrate) האוליגונוקלאוטידי המסומן פלואורסצנטית לאחר הפרדה על ג'לי urea-acrylamide באמצעות מערכת דימוי פלואורסצנטית מתאימה. בחירת המסנן חשובה ביותר, שכן לה יש השפעה ניכרת על הרגישות של הבדיקה הכוללת - תת-המצע האוליגונוקלאוטידי שלנו מסומן ב-fluorescein...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קביעת פעילות אקסונוקלאז של חלבונים מטוהרים מחייבת ניתוח של תוצרי מחשוף DNA. ניתן לדמיין מחשוף רציף של DNA על ידי אקסונוקלאזים על ידי הפרדה של מוצרי מחשוף מסומנים על ג'ל אקרילאמיד. מבחינה היסטורית זה היה כרוך בתיוג קצה של מצע ה-DNA עם תווית רדיו (למשל 32P או 35S), אך עם החסרונות הגלומים בשימוש בתווית רדיו (עלות, בעיות בטיחות וחוסר יציבות לאורך זמן). כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בדיקת אקסונוקלאז המשתמשת במצעי DNA עם תווית פלואורסצנטית, ומראים את התועלת של מערכת הבדיקה בקביעת פעילות הנוקלאז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לתוכנית הדינמיקה החדשה של ההזדקנות על מימון עבודה זו [ES/G037086/1] ולפרופ' דייב שראט (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת אוקספורד) על הגישה לפוג'י FLA-3000.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Reagent/Material
oligonucleotidesEurogentecיש צורך להשיג אותם בטוהר גבוה למשל עם טיהור PAGE.
5'FLOfluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 תמיסת אקרילאמידSevern Biotech20-2400-05זהירות: נוירוטוקסין חזק ולכן יש ללבוש כפפות בכל עת
עמודות His-Trap (1 מ"ל)GE Healthcare17-5247-01
כל שאר הריאגנטיםכל ספקדרגת ביולוגיה מולקולרית נחוצה (ללא DNase); צינורות מיקרופוגה באופן דומה צריכים להיות נטולי DNase ו-RNase<
imager)קורא תמונות Fuji
V2.02FujiFilm
מד תמונה V3.3FujiFilm
Custom מכובד td colspan="4" ><חזק>ציודHoefer SE400 מכשיר ג'ל Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (זרחן ופלואורסצנטי

מקורות

  1. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
  2. Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
  3. Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
  4. Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
  5. Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
  6. Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
  7. Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
  8. Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
  9. Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
  10. Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
  11. Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
  12. Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
  13. Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
  14. Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
  15. Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
  16. Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
  17. Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
  18. Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DmWRNexoWRNDNAurea
Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.