הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

Summary

אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.

Abstract

בזאת, אנו מתארים פרוטוקול למדידה בו זמנית שישה חלבונים המצויים ברוק באמצעות מערך נוגדנים מבוסס microsphere סיבים אופטיים. הטכנולוגיה חיסונית המערך מועסק משלבת את היתרונות של ייצור מערך השעיה מבוסס microsphere עם השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שתואר בפרוטוקול הווידאו, זעירים מפולימר 4.5 מיקרומטר זמין מסחרי היו מקודד לשבעה סוגים שונים, הנבדלים בריכוז של שני צבעי ניאון לכודים פיזי בתוך זעירים. Microspheres המקודד המכיל קבוצות carboxyl פני השטח שונו עם נוגדנים חד שבטיים ללכידה דרך הכימיה צימוד EDC / NHS. כדי להרכיב את microarray החלבון, הסוגים השונים של זעירים ממקודדים ופונקציונלית היו מעורבים ושהופקדו באופן אקראי ב4.5 מיקרומטר microwells, שנחרתו כימיים בקצה הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים. צרור סיבים האופטיים שימש גם כמוביל והדמיה מ 'icrospheres. לאחר הרכבה, microarray שימש כדי ללכוד חלבונים בsupernatant הרוק שנאסף מהמרפאה. זיהוי התבסס על immunoassay כריך באמצעות תערובת של נוגדנים לזיהוי biotinylated לanalytes שונה עם בדיקה ניאון streptavidin מצומדות, R-phycoerythrin. Microarray היה צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלושה ערוצים שונים, שני לרישום microsphere ואחת לאות assay. Micrographs הקרינה אז היו מפוענח ונותח באמצעות אלגוריתם תוצרת בית בMATLAB.

Introduction

מאז microarray הראשון שדווח על ידי מארק Schena ועמיתים לעבודה באמצע 1990, כלי רב עוצמה זה נוצל בתחומים רבים של מחקר ביולוגי ^1. microarrays נוגדנים המסוגל בו זמנית גילוי חלבונים רבים בנוזלי אבחון, כגון דם, יש יישומים חשובים באבחון קליני והקרנת סמן ^2-10. רוק, המכיל רבים מאותו analytes כמו דם, כבר נחשב כחלופה עדיפה על דם בגלל אוסף רוק הוא בטוח, לא פולשנית, ויכול להתבצע על ידי אנשי צוות רפואיים מאומנים מינימאלי ^11-13. נכון לעכשיו, ניתוח חלבון מרובב באמצעות דגימות רוק הוא מוגבל על ידי מספר גורמים חשובים, כוללים הריכוז הנמוך של חומר אנליטי יעד ¹⁴ וטווח הריכוז הרחב של סמנים ביולוגיים שונים ^15.

.

בזאת, אנחנו מדגימים את הניתוח של שישה חלבונים: גורם אנושי אנדותל כלי דם צמיחה (VEGF), חלבון מושרה אינטרפרון גאמא 10, metallopeptidase מטריצה ​​9 (MMP-9), ובטא interleukin-1 (IP-10, interleukin-8 (IL-8), גורם הגדילה באפידרמיס) (EGF) (IL-1β) . הביצועים של השיטה בתחילה אומת באמצעות פתרונות סטנדרטיים המהווים חלבוני אנליטי רקומביננטי וחסימת מאגר. דגימות רוק אמיתיות שנאספו מחולים במחלות נשימה כרוניות שונות, כמו גם ביקורת בריאה נבדקו גם עם ביצועים משביעי רצון. הפרוטוקול צריך להיות ישים analytes חלבון אחר ומבוסס מבחני microsphere אחרים. פלטפורמה זו מציעה יתרונות משמעותיים בתחום הכימיה אנליטית כפי שהיא מאפשרת ניתוח סימולטני מהיר, מדויק, ושחזור של ריכוזים נמוכים של כמה חלבונים עם מגוון רחב דינמי, אינטראקציות לא ספציפיים מינימליות, צריכת מדגם מופחתת, ועלות נמוכה בהשוואה ל Assay הצמוד אנזימים מקבילים immunosorbent (ELISA).

Protocol

איור 1. . זרימת עבודה ליישום מערך נוגדני microsphere סיבים אופטיים לאפיון רוק (1) מיקרוסכמות מקודדות באופן פנימי עם שני צבעי ניאון, (2) זעירים המקודדים משתנים חיצוני עם נוגדנים חד שבטיים חלבון ספציפי; (3) זעירים מהריבוב מעורבב, ו (4) שהופקד באופן אקראי בmicrowells חרוט בקצה הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים; (5) חלבוני רוק הם נתפסו על ידי זעירים דרך immunoassay כריך, ו( 6) לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

1. קידוד מיקרוסכמות

1. שוקל אירופיום נתרן (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydrate (EU-TTA, MW = 869.54 g / mol) בבקבוקון זכוכית בצבע ענבר ולהכין פתרון מניות 200 מ"מ בtetrahydrofuran (THF). מערבבים בעדינות על ידי pipetting; חזותי לאמתהצבע הוא נמס לגמרי.
2. שוקל coumarin 30 (C30, MW = 347.41 g / mol) בבקבוקון זכוכית בצבע ענבר ולהכין פתרון מניות 12 מ"מ בTHF. מערבבים בעדינות על ידי pipetting; ויזואלית לאמת את הצבע הוא נמס לגמרי.
3. הכן 700 μl של פתרון עובד לכל סוג microsphere באמצעות פתרונות המניות וTHF להגיע ריכוז סופי מפורט בטבלה 1.
4. ודא זעירים (10% w / v) מושעים גם על ידי vortexing, ולאחר מכן להעביר 60 השעיה μl לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
5. הוספת 600 μl PBS להשעיה microsphere ומערבבים על ידי pipetting 20x. צנטריפוגות הצינור ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant בזהירות. חזור על תהליך זה 2x אחר לשטוף זעירים.
6. לשטוף 3x גלולה microsphere עם THF באמצעות הליך דומה כצעד 1.5.
7. צנטריפוגה ההשעיה microsphere / THF ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות, להסיר את supernatant, מחדש להשעות גלולה ב 600 μlפתרון עובד מפורט בטבלה 1. מעבירים את התערובת לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש.
8. לאטום צינור microcentrifuge עם Parafilm ולמקם אותו על שייקר. לנער ב3,000 סל"ד ו דגירה של 24 שעות, להגן מפני אור על ידי כיסוי ההתקנה באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
9. צנטריפוגה ההשעיה microsphere ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות לצורה כדורית.
10. הסר את פתרון צבע supernatant, לשטוף זעירים מ6X עם 600 מתנול μl ולאחר מכן עם 600 μl PBS המכיל Tween-20 0.01% נוספים 6x, כמתואר בשלב 1.5.
11. אחסן את microspheres המקודד ב600 μl PBS המכיל Tween-20 0.01% על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, להגן מפני אור.

שם סוג microsphere:	1	2	3	4	5	6	7
Eu-TTA (מ"מ)	100	100	10	100	10
C30 (מ"מ)		1	1	6	6	1	6

טבלת 1. ריכוזים של האיחוד האירופי-TTA וC30 עובדים פתרונות.

2. הכנת מיקרוסכמות חלבון ללכוד

1. הכן MES חיץ [2 - חומצה (N-morpholino) ethanesulfonic (MES) 0.1 M, NaCl 0.9%, SDS 0.01%, pH 5.7] וחיץ PBS / SDS (סודיום פוספט 0.01 M, NaCl 0.154 M, SDS 0.01%, ה-pH 7.4) מראש בטמפרטורת חדר.
2. הוסף 200 μl השעיה מקודדת microsphere (המכילה זעירים ~ 2 מ"ג) לתוך צינור 1.5 microcentrifuge מיליליטר בטוח-Lock. חשוב להשתמש בסוג זה של צינור microcentrifuge כדי למנוע דליפה במהלך הדגירה בשלב 2.6.
3. לשטוף זעירים עם MES 600 μl חיץ 3x כמתואר בשלב 1.5. הוסף 700 MES μl לגלולת microsphere ומערבבים היטב על ידי pipetting.
4. הכן 0.105 גר '/ מיליליטר 1-אתיל-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide הידרוכלוריד (EDC, MW = 191.7 g / mol) ו0.163 sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide גר' / מיליליטר (sulfo-NHS, MW = 217.13 g / mol) פתרונות במאגר MES בצינורות נפרדים.
5. הוסף 150 μl מוכן טרי טיפת פתרון EDC אחרת טיפה לתוך ההשעיה microsphere. EDC hydrolyzes מהר מאוד, ולכן הוא חיוני לשימוש פתרון טרי על מנת להבטיח את יעילות הקיבוע. מייד לאחר התוספת של EDC, להוסיף פתרון sulfo-NHS 150 μl לזעיר, ומערבב היטב על ידי pipetting ולאמת את ההשעיה היא הומוגנית.
6. שווי הצינור, לאטום אותו עם Parafilm, ולמקם אותו על שייקר. לנער ב1,500 סל"ד 4 שעות, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
7. צנטריפוגה suspens microsphereיון ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. שטוף זעירים עם 3x חיץ 500 μl PBS / SDS כפי שמתואר בשלב 1.5.
8. הוסף 200 μl חיץ PBS / SDS לגלולה, ומערבב היטב זעירים ולהעביר את הפתרון ל300 μl חיץ PBS / SDS המכיל 60 נוגדנים ללכוד מיקרוגרם. חשוב להשעות את גלולה microsphere הראשונה ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה microsphere לתוך תמיסת הנוגדן.
9. דגירה את תערובת נוגדנים זעירים על ידי הטלטול ב1,500 סל"ד במשך 4 שעות על שייקר, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
10. צנטריפוגה ההשעיה microsphere ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. שטוף זעירים עם StartingBlock μl 500 (TBS) חסימת 3x חיץ, כמתואר בשלב 1.5.
11. מערבבים זעירים עם 1 מיליליטר של TBS חיץ חסימת דגירה זעירים ב1,500 סל"ד עבור שעה 1 על שייקר, להגן מפני אור באמצעות מפרצון תיבהאדום עם רדיד אלומיניום.
12. צנטריפוגה ההשעיה microsphere ב7,000 סל"ד למשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. לשטוף 3x גלולה עם 500 TBS μl חסימת חיץ, כמתואר בשלב 1.5.
13. צנטריפוגה פתרון microsphere ב7,000 סל"ד למשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. הוסף 500 TBS μl חסימת חיץ ומערבבים על ידי pipetting.
14. אחסן את ההשעיה microsphere הותאם על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, להגן מפני אור.
15. חזור על תהליך זה כדי להפוך סוגים אחרים של זעירים באמצעות נוגדנים מתאימים.

3. Microarray עצרת סיבים אופטיים

1. מערבבים 50 μl של כל סוג של החלבון זעירים מללכוד לתוך צינור microcentrifuge autoclaved חדש. צנטריפוגה המניה זעירים מהברכה ב7,000 סל"ד למשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant, כך שהנפח הנותר הוא כ 100 μl.
2. חבילות יד לחתוך סיבים אופטיים לכ 5 סנטימטר באורך ורצף ללטש את שני הקצוות במכונת ליטוש באמצעות 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0.5, ו0.05 יהלומים מיקרומטר בגודל מלחך סרטים. Sonicate החבילה המלוטשת במי deionized במשך 2 דקות כדי להסיר את כל חלקיקים.
3. שים הבר ערבוב מגנטי קטן לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מיליליטר, להוסיף 400 μl של PBS ללא חלבון חיץ ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית ל30 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
4. לחרוט קצה אחד של צרור סיבים המלוטש בפתרון 0.025 N HCl ל150 שניות ^10,16. מייד לצלול וsonicate הסוף חרוט במים deionized דקות 1. ייבש את צרורות סיבים עם אוויר דחוס.
5. הר צרור סיבים על בעל סיבים ולחסום את הקצה חרוט ב, PBS החיץ נטול חלבון ללא בועה במשך שעה 1.
6. aliquot μl הפקדת 1 של ההשעיה microsphere מאוחסן על הקצה חרוט של צרור הסיבים אופטיים. הגן על ההתקנה מהאור עם תיבה בנייר אלומיניום, ולחכות ל15 דקות. הנפח של ההשעיה תהיהלהקטין על ידי אידוי ולאלץ זעירים לתוך microwells חרוט. חזור על שלב טעינה זה עוד פעם אחת.
7. השתמש במטלית ספוגה בתמיסת מדגם להסיר זעירים שאינם לכודים בmicrowells. Microarray החלבון מוכן לשימוש כעת. תלך מייד לשלב 4.1 לניתוח רוק.

4. ניתוח דגימת רוק באמצעות Microarray מיקרוסכמות

1. הוסף 200 פתרון מדגם μl (100 supernatant רוק μl מדולל עם נפח שווה של StartingBlock T20 (PBS) חסימת חיץ. פרוטוקול האוסף לsupernatant רוק כבר פורסם בעבר ^10). לתוך צינור microcentrifuge autoclaved 0.5 מיליליטר. טובלים את microarray החלבון טעון בסיבים לתוך התמיסה ולדגור על שייקר ב600 סל"ד במשך 2 שעות, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
2. הכן 20 מיליליטר לשטוף חיץ על ידי הוספת 200 μl 10% פתרון BSA ו200 μl 10% 20-Tween ל19.6 מיליליטר PBS, mix גם בעדינות על ידי רועד.
3. טובלים את microarray החלבון לתוך צינור microcentrifuge autoclaved חדש המכיל 200 לשטוף חיץ μl ולנער ב600 סל"ד במשך 2 דקות. חזור על לשטוף 3x זה.
4. דגירה microarray ב100 פתרון μl של קוקטייל של נוגדנים לזיהוי המכיל 5 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, נוגדני זיהוי biotinylated IL-1β בStartingBlock T20 (PBS) חסימת חיץ ל30 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר ב600 סל"ד, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
5. לשטוף 3x microarray עם לשטוף חיץ כמתואר בשלב 4.3.
6. דגירה microarray ב200 μl של מיקרוגרם / המצומד R-phycoerythrin streptavidin מיליליטר (SAPE) פתרון 20 PBS ב 600 סל"ד על שייקר ל10 דקות, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
7. שטוף את 5x microarray עם לשטוף חיץ כמתואר בשלב 4.3.
8. נקה את הקצה הדיסטלי של הסיבים (כלומר, הסוף משםמהזעיר מ) צרור עם ספוגית רוויה עם אתנול מוחלט.
9. ייבש את שני הקצוות של הסיבים עם אוויר דחוס. הר את הסיבים במיקרוסקופ epifluorescent ותדמית באמצעות הקצה הדיסטלי של הסיבים.
10. לרכוש תמונות microsphere המקבילות לאיחוד האירופי-TTA, C30, ועוצמות פליטת הקרינה SAPE. התקנת מסננים אופטיים וזמני חשיפה לדימות פלואורסצנטי של האיחוד האירופי-TTA, C30, וSAPE מתוארים בטבלה 2.

ערוץ	Eu-TTA	C30	SAPE
Exciter	365/10x	350/50x	546/10x
Beamsplitter	525DCLP	400DCLP	560LP
פולט	620/60m	460/50m	580/30m
זמן חשיפה	1 שניות	0.3 שניות	1 שניות

טבלה 2. פרמטרים לשלוש תמונות הניאון של microarray.

Results

תמונות הקרינה משלושה ערוצים מראים קטע קטן של צרור סיבים האופטיים מוצגות איורים 2A-C. תמונות אלה נותחו באמצעות אלגוריתם שנכתב ב MATLAB (כפי שמתוארת בפירוט רב יותר בסעיף הדיון). הניתוח מעסיק גם מידע מתמונת Eu-TTA הקידוד (איור 2 א) ואת תמונת קידוד C30 (איור 2) כדי לפענח זעירים, ועוצמות הקרינה של microspheres שונה בתמונה האות (איור 2C) חושבו. עם עקומות הכיול המתקבלות מסטנדרטים חלבון מתואמים, הריכוזים של חלבונים בדגימו...

Discussion

חוקרים צריכים לשים לב במיוחד לשלבים הבאים: לדיוק פענוח טוב יותר, יש צורך לאמת את microspheres הושעו הומוגנית בכל הדגירה ולשטוף צעדים במהלך הליך הקידוד זעירים. בנוסף, זעירים מהמקודדים צריכים להיות מוגן מפני אור לאורך כל הניסוי. לאחר תהליכי קידוד והאחסון נאותים, מצאנו כי דיוק פענוח כולל היה מעל 99%. יש לאחסן זעירים ממקודד ב 4 ° C. הימנע מהקפאה ולהגן מפני אור. בתנאי אחסון נאותים, זעירים מהמקודדים הם יציבים במשך יותר משישה חודשים. זהירות רבה נדרשת במהלך שלבי קידוד ושי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eu-TTA צבע	פישר סיינטיפיק	AC42319-0010
THF	סיגמא-אולדריץ'	34865-100 מ"ל
בקבוקון זכוכית ענבר	פישר סיינטיפיק	03-339-23B
קומרין 30 צבע	סיגמא-אולדריץ'	546127-100MG
Microspheres	Bangslabs	PC05N/6698
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-129
PBS 10x תרכיז	סיגמא-אולדריץ'	P5493-1L
מים	סיגמא-אולדריץ'	W4502-1L
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	34860-100 מ"ל
TW-20	סיגמא-אולדריץ'	P7949-100 מ"ל
BupH MES חוצץ מי מלח	תרמו מדעי	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
תמיסת NaOH	Fisher Scientific	SS256-500
צינור מיקרוצנטריפוגה נעילה בטוחה	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
נוגדן לכידת VEGF אנושי	R& D Systems	MAB293
Human IP-10 לכידת נוגדנים	מו"פ D Systems	MAB266
אנושי IL-8 לכידת נוגדנים	מו"פ D Systems	MAB208
נוגדנים ללכידת EGF אנושיים	מו"פ D Systems	MAB636
Human MMP-9 לכידת נוגדנים	מו"פ D Systems	MAB936
אנושי IL-1 ובטא; לכידת נוגדנים	R& D Systems	MAB601
עכבר IgG1 נוגדן בקרת איזוטיפ	R& D Systems	MAB002
StartingBlock (TBS) מאגר	Thermo Scientific	37542
HCl תמיסה סטנדרטית 1.0 N	סיגמא-אולדריץ'	318949-500 מ"ל
0.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-120
מאגר ללא חלבון (PBS)	Thermo Scientific	37572
רקומביננטי אנושי VEGF 165	מו"פ D Systems	293-VE
אנושי רקומביננטי IP-10	D Systems	266-IP
רקומביננטי אנושי IL-8	מו"פ D Systems	208-IL
EGF אנושי רקומביננטי	D Systems	236-EG
אנושי רקומביננטי MMP-9	D Systems	911-MP
IL-1 ובטא אנושי רקומביננטי;	מו"פ D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) מאגר	Thermo Scientific	37539
חוסם BSA ב-PBS	Thermo Scientific	37525
נוגדן לזיהוי VEGF ביוטיניל	R& D Systems	BAF293
נוגדנים לזיהוי IP-10 ביוטיניל	מו"פ D Systems	BAF266
נוגדנים לזיהוי IL-8 ביוטיניליים	מו"פ D Systems	BAF208
נוגדנים לזיהוי EGF ביוטיניל	מו"פ D Systems	BAF236
נוגדנים לזיהוי MMP-9 ביוטיניל	מו"פ D Systems	BAF911
נוגדנים לזיהוי IL-1 ובטא ביוטיניליים	D Systems	BAF201
סטרפטווידין, R-phycoerythrin	Invitrogen	S-21388
אתנול (200 הוכחה)	סיגמא-אולדריץ'	E7023-500ML