מאמר שיטה

מודל במבחנה לחקר התגובות החיסוניות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לזיהום בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50766

⸱

10 בדצמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

במאמר זה

סיכום

הנגיף הסינציאלי הנשימתי האנושי (HRSV) יכול לגרום לברונכיוליטיס חמורה בתינוקות צעירים. חלק מהפתוגנזה של מחלת HRSV חמורה נגרמת על ידי התגובה החיסונית של המארח. גירוי של תאי חיסון אנושיים ראשוניים עם HRSV מספק מערכת מודל מהירה וניתנת לשחזור לחקר הפעלה של מסלולים דלקתיים וזיהום.

תקציר

זיהומים בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי (HRSV) מציגים ספקטרום רחב של חומרת מחלה, החל מזיהומים קלים ועד ברונכיוליטיס מסכנת חיים. חלק חשוב מהפתוגנזה של מחלה קשה הוא תגובה חיסונית מוגברת המובילה לאימונופתולוגיה.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשמש לחקירת התגובה החיסונית של תאי חיסון אנושיים לזיהום HRSV. ראשית, אנו מתארים שיטות המשמשות לתרבית, טיהור וכימות של HRSV. לאחר מכן, אנו מתארים מודל מבחנה אנושי שבו תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מגורים עם HRSV חי. ניתן להשתמש במערכת מודל זו כדי לחקור מספר פרמטרים שעשויים לתרום לחומרת המחלה, כולל התגובה החיסונית המולדת והנרכשת. ניתן למדוד את התגובות הללו ברמת התמלול והתרגום. יתר על כן, ניתן למדוד בקלות זיהום ויראלי של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה. יחד, גירוי של PBMC עם HRSV חי מספק מערכת מודל מהירה וניתנת לשחזור לבחינת מנגנונים המעורבים במחלה הנגרמת על ידי HRSV.

מבוא

הנגיף הסינציאלי הנשימתי האנושי (HRSV) הוא הגורם השכיח ביותר לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות בילדים. מדי שנה, למעלה מ-33 מיליון ילדים מתחת לגיל חמש נדבקים ב-HRSV, מה שמוביל ליותר משלושה מיליון אשפוזים וכמעט 200,000 מקרי מוות1. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך ש-HRSV מהווה גם איום משמעותי על קשישים ומבוגרים עם מחלות כרוניות בסיסיות2.

רוב זיהומי HRSV בילדים צעירים מציגים תסמינים קלים, דומים להצטננות, ואינם דורשים התערבות קלינית. עם זאת, חלק קטן מהחולים זקוקים לאשפוז והנשמה מכנית עקב ברונכיוליטיס קשה.

חלק מהפתוגנזה של מחלת HRSV הוא התגובה החיסונית השופעת והבלתי מספקת של המארח לזיהום3,4. זה מומחש על ידי מספר תצפיות. לתקופת המחלה המקסימלית קדם לעתים קרובות שיא הזיהום הנגיפי והיא חופפת טוב יותר לחדירה תאית לרקמות נגועות ושחרור ציטוקינים דלקתיים3. קו ראיות נוסף מגיע מניסויי HRSV (FI-RSV) בשנות ה-60. במקום לעורר הגנה בתינוקות צעירים, החיסון הביא לתגובה חיסונית מוגזמת וכתוצאה מכך למחלות נשימה מוגברות ולתחלואה ותמותה גבוהות יותר.

פותחו מספר מודלים לחקר הפתוגנזה של זיהומי HRSV. קווי תאים רציפים, כמו HEp-2 ו-A549, שימשו באופן נרחב לחקר זיהום HRSV במבחנה. תאי אפיתל הם המטרות העיקריות של זיהום HRSV5, ולכן התמקדות רבה הייתה בסוגי תאים אלה. עם זאת, המצב in vivo מורכב הרבה יותר ואינו מוגבל לסוג תא אחד. על מנת לבחון את האינטראקציות המורכבות הללו, פותחו מספר מודלים של זיהום בבעלי חיים כדי לחקור פתוגנזה של HRSV. עד כה, נעשה שימוש בשתי אסטרטגיות שונות, המתמקדות במודלים הטרולוגיים (לא אנושיים) כמו גם במודלים קוגניטיביים של מארח-פנאומו-וירוס. דוגמאות למודלים הטרולוגיים עבור HRSV כוללות שימפנזים, כבשים, חולדות כותנה ועכברים. זיהום RSV במארח הטבעי שלו נחקר בבקר ובעכברים, באמצעות RSV בקר ופנאומו-וירוס, בהתאמה.

בעוד שכל אחד מהמודלים הללו סיפק תובנות חשובות לגבי פתוגנזה של מחלות, HRSV מותאם מאוד לבני אדם. לכן, כתוספת לקווי התאים ולמודלים של בעלי חיים המשמשים כיום, אנו מציעים להשתמש ב-PBMCs ראשוניים אנושיים כמודל לגירוי עם HRSV. ניתן להשיג PBMCs אנושיים ממגוון אנשים כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות, כולל ילדים צעירים6, אנשים מדוכאי חיסון כמו גם מבוגרים בריאים7 או קשישים8. ניתן להשתמש ב-PBMCs כדי לחקור היבטים מולדים של זיהום כמו גם את התגובה האדפטיבית לנגיף. ניתן לחקור מסלולים דלקתיים מופעלים החשובים לפתוגנזה של מחלת HRSV ברמת ה-mRNA והחלבון. יתר על כן, זיהום ויראלי של (תת-קבוצות) של תאי חיסון יכול להיקבע על ידי ציטומטריית זרימה. השתמשנו במודל זה בעבר כדי לזהות את ההשפעות הסינרגטיות של זיהום HRSV יחד עם הליגנד החיידקי מורמיל דיפפטיד (MDP) על השראת ציטוקינים פרו-דלקתיים7. אנו מציעים להשתמש בגירוי HRSV של PBMCs ראשוניים אנושיים כמודל חזק, קל ומהיר במבחנה לחקר מסלולים דלקתיים המעורבים בפתוגנזה של מחלת HRSV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה:

ניסויים עם HRSV חייבים להתבצע במגש בטיחות ביולוגית במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. יש לאסוף את כל הפסולת הוויראלית וחומרים שהיו במגע עם הנגיף להשלכה נאותה עקב סיכונים ביולוגיים.

יש לנקוט באמצעי זהירות מיוחדים בעת שימוש בדם אנושי שעלול להיות נגוע.

חיוני להשתמש בריאגנטים נקיים מאנדו-טוקסינים לאורך כל הפרוטוקולים.

1. גידול של HRSV A2

  1. תרבתו תאי HeLa או HEp-2 במצע DMEM + 10% fetal calf serum (FCS) + 1% penicillin/streptomycin (P/S) בבקבוק תרבית של 175 cm2 עד להגעה לכ-50% התמזגות (confluency).
  2. שטפו את התאים שלוש פעמים עם phosphate buffered saline (PBS) בטמפרטורת החדר.
  3. הפשיקו מבחנה עם נגיפי HRSV seeding stock בבן 37 °C באמבט מים. דללו את מלאי הנגיף כך שערך ה-MOI יישמר על 0.1 או פחות; דבר זה ימנע יצירה של חלקיקים משבשים פגומים (DIPs). דללו את מלאי הנגיף ב-4 ml למבקבוק של מצע הדבקה (DMEM + 1% P/S) והוסיפו לתאי HeLa או HEp-2. שמרו על נפח זה נמוך ככל האפשר מבלי לגרום לייבוש התאים. ככל שהנפח נמוך יותר, כך שיעור ההדבקה יהיה גבוה יותר.
  4. דגרו במשך 2-4 שעות ב-37 °C, 5% CO2. סובבו את הבקבוק בכל 15 דקות כדי להפיץ מחדש את המצע.
  5. הסירו את האינוקולום ושטפו פעם אחת עם PBS.
  6. הוסיפו 15 ml מצע תרבית (DMEM + 10%FCS + 1% P/S) ודגרו למשך 3-5 ימים ב-37 °C, 5% CO2. עקבו אחר התאים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל כדי לזהות שינויים ציטופתולוגיים מושרי-נגיף, למשל יצירת סינציטיה, מוות ותאים צפים.
  7. עם הופעת הציטופתולוגיה, קצרו את ה-HRSV על ידי גירוד התאים ואספו את תגלי הנגיף למבחנה סטרילית של 50 ml. ערבלו את תגלי התאים בוורטקס. גירוד וערבול וורטקס של התאים משחררים יותר חלקיקי נגיף.
  8. צנטריפוגו את תגלי הנגיף למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ב-1,800 x g כדי לשקע את ששאירי התאים. HRSV שנמצא בנוזל העלון אינו שוקע במהירות זו, וניתן להשתמש בנוזל העלון ישירות להדבקת מספר בקבוקים של 175 cm2 או לאחסנו ב-80 °C- כמלאי זריעה (seeding stock) באליקוטים של 1 ml לשימוש עתידי. הקפיאו תמיד את ה-HRSV בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי כדי למנוע איבוד של חלקיקי נגיף זיהומיים.
  9. כפי שצוין לעיל, מלאי הזריעה שהוכן לפי פרוטוקול זה משמש להדבקת מספר בקבוקי תרבית של 175 cm2. חזרו על הפרוטוקול המדויק כדי להפיק נגיף נוסף לצורך טהרה. ניתן לטהר עד 180 ml של תגלי נגיף במחזור אולטרה-צנטריפוגה אחד.
  10. עם הופעת הציטופתולוגיה, קצרו את ה-HRSV על ידי גירוד התאים ואספו את נוזל העלון. ערבלו את תגלי הנגיף בוורטקס. צנטריפוגו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ב-1,800 x g כדי לשקע את ששאירי התאים. HRSV שנמצא בנוזל העלון אינו שוקע במהירות זו, ונוזל העלון מחולק לאליקוטים של 15 ml למבחנה של 50 ml. הקפיאו בהקפאה מהירה ואחסנו ב-80 °C- עד לביצוע הטהרה.

2. טיהור של HRSV

הערה: לפני השימוש באולטרה-צנטריפוגה, יש להיות מודעים לכך שמדובר בציוד שעלול להיות מסוכן. קראו את המדריכים ובצעו את סבב האולטרה-צנטריפוגציה הראשון תחת פיקוח של אדם מנוסה.

  1. נקה את סלי ultracentrifugation באמצעות 70% ethanol והנח להם להתייבש בתוך תא בטיחות ביולוגית.
  2. הנח מבחנת צנטריפוגה סטרילית בכל סל.
  3. הכן תמיסת sucrose בריכוז 30% (w/v) ב-PBS, בצע סטריליזציה באמצעות סינון (מסנן 0.2 μm) והוסף 5 ml לתחתית כל מבחנת צנטריפוגה. לצורך פרוטוקול מהיר יותר, ניתן להקפיא את המבחנות עם תמיסת ה-sucrose. הקפד לשמור עליהן סטריליות.
  4. אם תמיסת ה-sucrose לא הוקפאה, הוסף בזהירות רבה 30 ml של תמיסת HRSV מעל תמיסת ה-sucrose. בצע פיפוט לאט כדי למנוע הפרעה לתמיסת ה-sucrose. שמור על הפרדה ברורה. אם המבחנות הוקפאו, שפוך את תרחיף הוירוס מעל תמיסת ה-sucrose הקפואה ולאחר מכן הנח לה להפשיר.
  5. אזן בזהירות רבה את ששת סלי ה-ultracentrifugation באמצעות PBS סטרילי. הנח את המשקל בתוך תא זרימה (flow cabinet) כדי לשמור על סטריליות של כל הרכיבים. מלא את המבחנות עד לגובה של 3-5 mm מתחת לקצה, אחרת מבחנות הצנטריפוגה עלולות לקרוס. אזן את הסלים ברמת דיוק של עד 0.1 g, כולל מכסה ההברגה, למקרה שהמכסים אינם תואמים באופן מושלם.
  6. בצע צנטריפוגה ב-ultracentrifuge למשך 1.5 hr, בטמפרטורה של 4 °C ובמהירות של 20,000 rcf.
  7. הוצא בזהירות את מבחנת הצנטריפוגה מהסל באמצעות פינצטה סטרילית. חלקיקי הוירוס יעברו דרך שכבת ה-sucrose וייצרו pellet. לעומת זאת, גורמים מסיסים המופרשים על ידי תאים (למשל cytokines) יישארו בתמיסה. הטה את מבחנת הצנטריפוגה כדי לנקז את כל הנוזל. השאר אותה הפוכה על משטח סטרילי, למשל פלטת תרבית, לייבוש, אך אל תיתן ל-pellet להתייבש לחלוטין.
  8. הוסף בזהירות 1 ml של Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ל-pellet והטה את מבחנת הצנטריפוגה כדי לנקז את ה-HBSS. שוב, הנח למבחנה להתייבש כשהיא הפוכה על משטח סטרילי. אל תיתן ל-pellet להתייבש לחלוטין.
  9. שחזר את ה-pellet ב-1 ml HBSS על ידי פיפוט למעלה ולמטה 40 פעמים. נסה למנוע היווצרות בועות אוויר שכן אלו עלולות להרוס את הוירוס.
  10. חלק את הוירוס לאליקוטים, בצע הקפאה מהירה (snap-freeze) בחנקן נוזלי ואחסן ב- -80 °C עד לשימוש. השתמש באליקוט וירוס חדש לכל ניסוי, שכן הקפאה והפשרה חוזרות יפחיתו את הטיטר הזיהומי. בעת הפשרה, הפשר תמיד את הוירוס ב-37 °C כיוון ש-HRSV פחות יציב בטווח שבין -20 ל-15 °C.

3. כימות של HRSV

הערה: כדי להבטיח נתונים הניתנים לשחזור, חזור על הכימות לפחות 3 פעמים בכפולות.

3.1. הדבקת תאי A549

  1. תרגלו תאי A549 בלוחית 24 בארות עד להגעה למצב של התכנסות (confluency).
  2. שטפו את תאי ה-A549 פעמיים עם 1 ml של PBS בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו דילוליות סדרתיות פי 5 של HRSV במצע עם סרום מופחת (Reduced Serum Medium). הוסיפו 100 μl של נגיף מדולל לכל אחת מהבארות. הכינו לפחות 4 דילוליות (למשל פי 4, 20, 100 ו-500). כללו שתי בארות נוספות שהודבקו במינון הגבוה ביותר של הנגיף (אלו ישמשו כביקורת איזוטיפ) וכללו שתי בארות ללא הדבקה (mock-infected).
  4. דגרו את התאים למשך 2 hr ב-5% CO2, 37 °C. נערו את לוחות 24 הבארות מדי 15 min כדי למנוע התייבשות.
  5. הסירו את תרחיף הנגיף ושטפו את התאים פעם אחת עם 1 ml של PBS בטמפרטורת החדר.
  6. הכינו תמיסת bovine serum albumin (BSA) בריכוז 4% (w/v) במצע עם סרום מופחת. בצעו סטריליזציה באמצעות סינון (מסנן 0.2 μm) והוסיפו 500 μl לכל באר.
  7. דגרו ב-5% CO2, 37 °C למשך 22 hr.

3.2. הכנה ל-FACS

  1. הסיר את המצע ושטוף את התאים פעם אחת עם 1 ml של PBS בטמפרטורת החדר.
  2. הוסף 200 μl של trypsin שחומם מראש (37 °C) לכל באר והדגר למשך 10 min ב-37 °C, 5% CO2.
  3. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא היפרדות. אם התאים נפרדו, הוסף 800 μl DMEM + 10% FCS + 1% P/S כדי לנטרל את ה-trypsin. השהה את התאים בתרחוף (Resuspend).
  4. העבר את התאים לפלטת 96 בארות קונית שאינה מטופלת לתרביות רקמה. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g בטמפרטורת החדר. השהה את המשקעים (pellets) בתרחוף של 200 μl PBS קר.
  5. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g ב-4 °C. שפוך את הנוזל העליון (supernatant) והשהה את התאים בתרחוף של 200 μl PBS קר.
  6. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g ב-4 °C. שפוך את הנוזל העליון והשהה את התאים בתרחוף של 150 μl acetone בריכוז 80% קר מאוד (ice-cold).
  7. קבע את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 min.
  8. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g ב-4 °C. שפוך את הנוזל העליון והשהה את התאים בתרחוף של 200 μl PBS קר + 0.1 % BSA.
  9. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g ב-4 °C. שפוך את הנוזל העליון והשהה את התאים בתרחוף של 50 μl anti-NP-RSV-FITC (מדולל 1:50 ב-PBS + 1% BSA) או 50 μl IgG2 anti mouse-FITC (זהו ביקורת איזוטייפ; לכן השתמש באותה ריכוז נוגדנים).
  10. בהמשך הפרוטוקול, שמור את המבחנות בחושך. הדגר למשך שעה אחת לפחות ב-4 °C, אך ניתן להאריך זאת ללילה שלם.
  11. הוסף 150 μl PBS קר + 0.1% BSA.
  12. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g ב-4 °C. שפוך את הנוזל העליון והשהה את התאים בתרחוף של 200 μl PBS קר + 0.1% BSA.
  13. סבב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-400 x g ב-4 °C. שפוך את הנוזל העליון והשהה את התאים בתרחוף של 200 μl PBS קר + 0.1% BSA. שמור את הפלטה על קרח ובחושך עד למדידת ה-FACS.
  14. מדוד את התאים המזוהמים באמצעות ציטומטר זרימה (flow cytometer).

3.3. חישוב FITC-50

  1. השתמש בתוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את ערך הסף (cutoff) באמצעות הביקורת השלילית (ביקורת איזוטייפ). השתמש בסוג גרף Pseudocolor. שרטט שער רבעים (quadrant gate), כך שהתאים החיוביים יימצאו בשטח Q3. אחוז החיוביים השגויים (false positives) צריך להיות נמוך מ-0.2% בשתי ביקורות האיזוטייפ.
  2. ייצא את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני והכן טבלה עם אחוז התאים ה-FITC+ עבור כל דילול. החסר מכל ערך את ערך הממוצע של החיוביים השגויים (כפי שנקבע על ידי ביקורת האיזוטייפ) עבור כל ניסוי.
  3. פתח קובץ חדש (XY scatter, עמודת X בודדת ומספר עמודות Y) בתוכנה לסטטיסטיקה. העתק את הנתונים לתוכנה זו: X = דילול, Y = % תאים נגועים, n = 3, השתמש בממוצע של שתי מדידות עבור כל דילול. בצע ניתוח סטטיסטי של רגרסיה לא ליניארית, דעיכה מעריכית חד-שלבית (one-phase exponential decay). בדוק אם העקומה מתאימה לנקודות הנתונים; אם לא, בחר ניתוח סטטיסטי אחר.
  4. העתק את המשוואה עבור העקומה ואת ערכי המשוואה לתוכנת גיליון אלקטרוני. חשב את ערך ה-X עבור Y = 50%. בהתאם לכך, קבע את ערך ה-FITC-50 על ידי חישוב מספר החלקיקים המדבקים שזוהו ב-FITC למל' (FIP/ml) בדילול שבו קיימת הדבקה של 50%, באמצעות המשוואה הבאה:
    נוסחה לחישוב FITC50; תרשים הממחיש את משוואת מדידת עוצמת הפלואורסצנציה.
    A = מספר ממוצע של תאי A549 לבאר
    B = μl נגיף לבאר ששימש להדבקה
    C = הדילול שבו קיימת הדבקה של 50%

4. בידוד תאי מונונוקליאריים מדם פריפריאלי (PBMC) מדם של מתנדבים בריאים

  1. שאבו דם ורידי למבחנות EDTA בנפח 10 ml ממתנדבים בריאים לאחר קבלת הסכמה מדעת. נפח של 10 ml של דם יניב כ-107 PBMCs.
  2. מעתה והלאה, עבדו באופן סטרילי במabilis זרימה (flow-cabinet).
  3. דללו את הדם פי 2 עם PBS בטמפרטורת החדר במבחנה של 50 ml. עבור כל מבחנה של 50 ml ניתן להשתמש בנפח כולל מקסימלי של 35 ml של דם מדולל.
  4. קחו מזרק סטרילי של 50 ml והוסיפו מחט Luer lock שעברה עיקור. שאבו למזרק מדיום למדרג צפיפות (density gradient media). הניחו את המחט בתחתית של מבחנה עם דם מדולל ושאבו בזהירות 15 ml של מדיום למדרג צפיפות מתחת לדם המדולל. שמרו על הפרדה ברורה בין המדיום למדרג צפיפות לבין הדם.
  5. סבבו בצנטריפוגה במהירות של 800 x g בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עם תאוצה של 9 (מקסימום) וללא בלימה. הגדירו את טמפרטורת הצנטריפוגה ל-4 °C לאחר השימוש.
  6. סבב הצנטריפוגה במדרג צפיפות יביא להיווצרות של מספר שכבות. בתחתית נמצא משקע (pellet) של תאי כדוריות דם אדומות עם שכבה כסופה מעליו, המכילה את הנויטרופילים. השכבה השקופה מעל משקע זה מכילה את המדיום למדרג צפיפות. שכבה דקה בין המדיום למדרג צפיפות לבין שכבת פלזמת הדם למעלה מכילה את ה-PBMCs.
  7. אספו בזהירות את ה-PBMCs באמצעות פיפט פסטור והעבירו את התאים למבחנה חדשה של 50 ml. מעתה והלאה שמרו את ה-PBMCs על קרח והשתמשו ב-PBS קר מאוד. הוסיפו PBS קר עד לנפח של 50 ml וסבבו בצנטריפוגה ב-400 x g למשך 10 דקות ב-4 °C (עם בלימה המוגדרת על 9).
  8. הסמירה את על-המשקע (supernatant) באמצעות שאיבה, השעיקו מחדש את המשקע ב-50 ml של PBS קר וסבבו בצנטריפוגה ב-400 x g למשך 10 דקות ב-4 °C; חזרו על הפעולה פעמיים.
  9. לאחר הסמרת על-המשקע, הוסיפו 1 ml של מדיום קר (RPMI + 1% P/S) וספרו את התאים באמצעות תא ספירה.
  10. כוון את ריכוז התאים ל-5 x 106 PBMCs/ml.

5. גירוי של PBMCs עם HRSV חי

  1. הכינו את מערך הניסוי; כללו כפילויות ניסיוניות לכל תנאי.
  2. דללו את כל המעוררים הדרושים במדיום (RPMI + 1% P/S). קחו בחשבון שהנפח הסופי לבאר יהיה 200 μl. נפח של 50 μl של מעוררים יתווסף, לכן הכינו תמיסות מלאי של מעוררים בריכוז של 4x.
  3. הוסיפו 100 μl מתלי הSuspension של התאים שהוזכרו לעיל לכל באר של פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה (5 x 105 PBMC/well).
  4. הוסיפו 50 μl של המעוררים המדוללים לכל באר. ניתן להוסיף שני מעוררים שונים, מה שייתן נפח של 200 μl. אם נדרש מעורר אחד בלבד, התאימו את הנפח ל-200 μl באמצעות מדיום.
  5. דגרו את פלטת ה-96 בארות למשך תקופת הדגירה הנדרשת ב-37 °C באינקובטור עם 5% CO2. עבור רוב הציטוקינים, דגירה של 24 שעות תספיק.

6. קריאת תוצאות הגירוי

  1. לאחר תקופת הדגירה, סבב את פלטת 96 הבארים בצנטריפוגה למשך 5 min בטמפרטורת החדר במהירות של 450 x g כדי לרכז את התאים בתחתית.
  2. אסוף את הנוזל העליון (נפח מקסימלי של 180 μl) ושמור אותו לצורך אנליזת ציטוקינים עתידית (-20 °C) או לצורך ייצור נגיפים (-80 °C).
  3. ניתן לנתח את תאי ה-PBMCs המגורה שנמצאים במשקע באמצעות qPCR/Western blot על ידי הוספת בופר ליזיס, או לחלופין, ניתן לצבוע את תאי ה-PBMCs לצורך אנליזת flow cytometry.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטת הגידול והטיהור של HRSV A2 המתוארת כאן תניב תפוקה שבין 2 x 107 ו-2 x 108 כמות חלקיקי נגיף זיהומיים של FITC-50 למ"ל. תוצאות של אנליזה מיקרוסקופית, שבה נספרו תאים נגועים שצבעו ב-FITC (התוצאות לא מוצגות), הושוו לתוצאות של כימות באמצעות FACS (איור 1). שתי השיטות הניבו טיטרים דומים, אם כי בשיטת ה-FACS הייתה סטיית תקן נמוכה בהרבה בין ניסויים שונים והיא דרשה פחות עבודה.

בעת ביצוע ניסוי של גירוי PBMC, אנו ממליצים להשתמש בשיטת הגירוי-שבר (stimuli-fraction meth...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנו מדגימים כי זיהום של PBMC ב-HRSV הוא מערכת מודל מהירה ואמינה שבה ניתן לחקור מסלולים דלקתיים. על מנת לעורר PBMCs יש להכין ולכמת מניית HRSV.

קווי תאים מרובים רגישים לזיהום HRSV. קווי התאים המשמשים ביותר לתרבית HRSV הם תאי HEp-2, HeLa ו-Vero. עם זאת, לא היינו ממליצים על שימוש בתאי Vero לתרבית HRSV מכיוון שהוכח כי תרבית של HRSV בתאי Vero מביאה לחלבון G קטום של HRSV10. כמו כן, השתמש תמיד בכמויות נמוכות של וירוס כדי להדביק את התאים לתרבית בגלל הסיכון ליצירת חלקיקים מפריעים פג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה לחשוף.

תודות

RSV A2 סופק באדיבות על ידי ד"ר ר. דה סווארט (Erasmus MC, רוטרדם, הולנד). MV ו-GF נתמכים על ידי קונסורציום Virgo, הממומן על ידי פרויקט ממשלת הולנד מספר FES0908, ועל ידי פרויקט מספר 050-060-452 של יוזמת הגנומיקה ההולנדית (NGI). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט
>PBSLonzaBE17-516FPBS ללא Ca2+ Mg2+ או פנול אדום
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום
DMEMInvitrogen31966-047DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובט
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 בינוני, GlutaMAX, HEPES
סרום מופחת בינוני (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I סרום מופחת בינוני, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (סרום בקר עוברי)
BSASigma AldrichA7030אלבומין מסרום בקר
P/SInvitrogen15140-122פניצילין-סטרפטומיצין,
טריפסיןאינוויטרוגןנוזלי 25300-0540.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום
תאי HeLaATCCCCL-2
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S7903סוכרוז BioXtra, ≥ 99.5%
IgG2 נגד עכבר-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K FITC בקרת איזוטיפ
אנטי-NP-RSV-FITCAbcamAB25849נוגדן וירוס סינציאלי אנטי נשימתי [671] (FITC
)מדיום שיפוע צפיפות (Lymphoprep)EDTA-Axis-Shield1114545
BDBiosciences367525
AcetoneMerck Millipore1000141000אצטון לאנליזה
<חזק>חומר
צינורות צנטריפוגהבקמן קולטר326823Thinwall, פוליאלומר, 38.5 מ"ל, 25 מ"מ x 89 מ"מ
רוטור SureSpin 630 עם דליים של 36 מ"לסורוול79368דלי מתנדנד רוטור טיטניום
סורוול WX80 אולטרה-צנטריפוגהסורוול46900
CB 150l CO2 קלסר
A549 תאי ATCC CCL-185 צינורות אינקובטור

מקורות

  1. Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).
  3. Openshaw, P. J. Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).
  4. Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection. Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).
  5. Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).
  6. Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide. J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).
  7. Vissers, M., Remijn, T., et al. Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells. Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).
  8. Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein. Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).
  9. Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands. Vaccine. 30, 597-606 (2012).
  10. Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans. J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).
  11. Treuhaft, M. W., Beem, M. O. Defective interfering particles of respiratory syncytial virus. Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).
  12. Korns Johnson, D., Homann, D. Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry. PLoS One. 7 (5), e37337(2012).
  13. Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity. J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).
  14. Kimpen, J. L. Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).
  15. Wang, S. Z., Forsyth, K. D. The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection. Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).
  16. San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells. J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).
  17. Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10. Plos One. 8 (1), e53641(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RSVqPCR

מאמרים קשורים